廖光珍 畢建鑫 張 鈺 白素英

(東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040)

麝鼠(Ondatrazibethicus)，原產(chǎn)于北美洲，屬哺乳綱(Mammalia)草食性動(dòng)物，自20世紀(jì)初蘇聯(lián)引進(jìn)后，被作為毛皮獸而大量飼養(yǎng)，于20世紀(jì)中葉傳入中國(guó)進(jìn)行人工養(yǎng)殖。成年雄性麝鼠在陰莖基部的腹部中線兩側(cè)的皮膚與肌肉之間，有一對(duì)能在繁殖期(分泌期)分泌粘稠的乳白色液體的香腺[1]。麝鼠香腺呈現(xiàn)明顯的季節(jié)變化，在2月開(kāi)始發(fā)育，3月開(kāi)始進(jìn)入分泌期，4月達(dá)到頂峰，然后繼續(xù)變化直到8月，9月開(kāi)始腺體萎縮，10月在陰莖基部附近縮小到黃豆大小，到了11月，結(jié)締組織逐漸取代了腺體[2]。Zhang等[3-5]指出麝鼠香腺的這種季節(jié)性發(fā)育可能是受到激素與激素受體的調(diào)控，Li等[6]則指出鈣和TGF-beta信號(hào)通路的基因在麝鼠香腺中的季節(jié)性差異表達(dá)可能與其萎縮有關(guān)，而有關(guān)腫瘤壞死因子在麝鼠香腺發(fā)育中的影響還未見(jiàn)研究。

由活化的巨噬細(xì)胞與單核細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)是一種參與細(xì)胞免疫等多種生理調(diào)控過(guò)程的細(xì)胞因子[7-8]，其超家族成員(tumor necrosis factor superfamily，TNFSF)能夠結(jié)合一個(gè)或多個(gè)TNF受體超家族(TNFRSF)分子[9-10]，這些超家族成員的受體和配體是一種影響免疫系統(tǒng)發(fā)育、內(nèi)穩(wěn)態(tài)和適應(yīng)性反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)因子[9]。其中，腫瘤壞死因子受體超家族成員13C(TNFRSF13C)，也稱為BAFF受體，是含有單個(gè)細(xì)胞外富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(CRD)的Ⅲ型跨膜蛋白。有研究顯示該受體通過(guò)與其銜接蛋白TRAF2和TRAF3的相互作用，誘導(dǎo)NF-κB和Bcl-2的抗凋亡信號(hào)通路的啟動(dòng)，導(dǎo)致抗凋亡蛋白的形成，從而促進(jìn)細(xì)胞生存[11]。同為TNF受體超家族成員的TNFRSF4(TNF receptor superfamily member 4)也稱OX40受體，在與銜接蛋白TRAF2和TRAF5結(jié)合后，同樣能夠促進(jìn)NF-κB發(fā)揮效應(yīng)[12-14]。本試驗(yàn)利用RT-qPCR技術(shù)比較麝鼠TNFRSF13C和TNFRSF4基因在繁殖期與非繁殖期的麝鼠心、肝、肺、腎、睪丸、肌肉和香腺中的轉(zhuǎn)錄水平差異，探討TNFRSF13C和TNFRSF4基因在麝鼠繁殖與香腺發(fā)育中可能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

在5月初和10月末前往黑龍江省哈爾濱市的麝鼠養(yǎng)殖場(chǎng)，分別購(gòu)買3只體況相近的1歲齡雄性麝鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后采其心、肝、肺、腎、睪丸、肌肉與陰莖兩側(cè)的香腺，于液氮中速凍后放入凍存管中，并保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.2 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

將試驗(yàn)組織放入盛有液氮的研缽中快速研磨后加入適量Trizol試劑(1 mL/100 mg組織)，然后利用RNA提取試劑盒(Thermo Scientific，USA)提取組織總RNA。利用DNase I去除總RNA中的DNA殘留后，于純化柱中洗脫RNA。然后利用1.3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性，按照全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.3 TNFRSF13C和TNFRSF4基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)

利用NCBI設(shè)計(jì)引物，實(shí)驗(yàn)內(nèi)參基因?yàn)棣?肌動(dòng)蛋白(β-actin)基因，引物序列見(jiàn)表1。RT-qPCR反應(yīng)體系為20 μL：cDNA模板2 μL，上下游引物(10 μmol/μL)各0.2 μL，2×SYBR GREEN I Supermix(ROCHE)10 μL，最后用 H2O補(bǔ)足。所有樣品一式3份進(jìn)行重復(fù)孔試驗(yàn)，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃10 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s 40個(gè)循環(huán)，退火時(shí)收集熒光信號(hào)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

RT-qPCR擴(kuò)增后，按△△Ct法計(jì)算結(jié)果。

內(nèi)參基因均一化樣本差異：△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因；2個(gè)時(shí)期樣本表達(dá)差異：△△Ct=△Ct處理樣品-△Ct對(duì)照樣品；計(jì)算倍數(shù)變化=2-△△Ct。

兩組間結(jié)果比較采用t檢驗(yàn)，P≤0.01認(rèn)為差異顯著，P≤0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 本文所用引物信息

Tab.1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

經(jīng)RT-qPCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子TNFRSF13C和TNFRSF4基因在麝鼠心、肝、肺、腎、睪丸、香腺中繁殖期與非繁殖期的表達(dá)差異顯著。其中TNFRSF13C基因在麝鼠心、肝、肺、腎、睪丸、香腺中繁殖期的轉(zhuǎn)錄水平約為非繁殖期的 2.4、8.2、10.6、2.8、9.6、4.8倍(圖1)，差異顯著(P<0.05)；TNFRSF4基因在麝鼠心、肝、肺、腎、睪丸、香腺中繁殖期的轉(zhuǎn)錄水平約為非繁殖期的2.2、3.6、4.2、2.3、1.9、4倍(圖2)，差異顯著(P≤0.05)；而TNFRSF13C和TNFRSF4基因在繁殖期與非繁殖期的麝鼠肌肉中的mRNA表達(dá)水平均沒(méi)有明顯差異(圖2，圖3)(P>0.5)。熔解曲線結(jié)果顯示反應(yīng)過(guò)程中未出現(xiàn)明顯非特異性擴(kuò)增(圖3，圖4)。

圖1 繁殖期與非繁殖期麝鼠TNFRSF13C基因轉(zhuǎn)錄水平差異Fig.1 Difference of TNFRSF13C gene transcription level between reproductive and non-reproductive muskrat

3 討論

通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，麝鼠TNFRSF13C和TNFRSF4基因在其心、肝、肺、腎、睪丸、香腺中的轉(zhuǎn)錄水平均表現(xiàn)為繁殖期高于非繁殖期，并且差異顯著(P≤0.05)，由此推測(cè)腫瘤壞死因子TNFRSF13C和TNFRSF4可能參與了麝鼠器官發(fā)育(香腺)和機(jī)體適應(yīng)變化環(huán)境的過(guò)程。

圖2 繁殖期與非繁殖期麝鼠TNFRSF4基因轉(zhuǎn)錄水平差異Fig.2 Difference of TNFRSF4 gene transcription level between reproductive and non-reproductive muskrat

圖3 TNFRSF13C基因熔解曲線Fig.3 Melting curve of TNFRSF13C gene

圖4 TNFRSF4基因熔解曲線Fig.4 Melting curve of TNFRSF4 gene

麝鼠是季節(jié)性繁殖動(dòng)物，其香腺形態(tài)隨著繁殖期和非繁殖期的更替而呈現(xiàn)出明顯的季節(jié)變化——發(fā)育或萎縮。繁殖期的樣品采集于5月，此時(shí)的麝鼠香腺發(fā)育成熟，香腺體積膨大并大量分泌麝鼠香。敲除小鼠的研究表明，TNFRSF4促進(jìn)凋亡抑制因子BCL2、BCL2LL1/BCL2-XL的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡[15]。TNFRSF13C是TNFSF13C(又稱B cell activating factor belonging to the TNF family，BAFF，B 淋巴活化因子)的特異性受體。有研究顯示BAFF/BAFF-R可通過(guò)誘導(dǎo)NF-κB和Bcl-2的表達(dá)激活抗凋亡信號(hào)通路[11]。并且，BAFF通過(guò)磷酸化PI3K路徑可以促進(jìn)凋亡蛋白Mcl-1表達(dá)，另外還促進(jìn)生物代謝功能[16]。結(jié)合實(shí)驗(yàn)推測(cè)，在麝鼠香腺的發(fā)育中，腫瘤壞死因子TNFRSF13C和TNFRSF4表達(dá)的上調(diào)，促進(jìn)了抗凋亡蛋白的生成，在促進(jìn)香腺細(xì)胞的生存中起到了重要的調(diào)控作用，從而繁殖期的香腺呈現(xiàn)出快速發(fā)育，而非繁殖期呈現(xiàn)出快速萎縮的現(xiàn)象。在繁殖期麝鼠香腺中，腫瘤壞死因子TNFRSF13C的相對(duì)表達(dá)量高于TNFRSF4，說(shuō)明在抗凋亡能力調(diào)控過(guò)程中，腫瘤壞死因子TNFRSF13C比TNFRSF4的調(diào)控作用可能更強(qiáng)。

已有研究證明，腫瘤壞死因子TNFRSF13C和TNFRSF4與淋巴細(xì)胞免疫有關(guān)。BAFF(TNFRSF13C)與 B 細(xì)胞存活、增殖、發(fā)育和成熟均有密切的關(guān)系。據(jù)認(rèn)為該受體是BAFF介導(dǎo)的成熟B細(xì)胞存活所需的主要受體[11]。此外，BAFF 還發(fā)揮共刺激作用促進(jìn)CD4+/CD2+T 淋巴細(xì)胞活化，同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答[17-18]。而TNFRSF4(OX40受體)表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞表面，參與T細(xì)胞的活化、增殖與遷移。OX40的共刺激分子OX40L則主要表達(dá)于活化的抗原呈遞細(xì)胞表面，如樹(shù)突狀細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，以及某些組織細(xì)胞(心、肺、睪丸)[19]。它們所介導(dǎo)的共刺激信號(hào)在活化T細(xì)胞和促進(jìn)B-T細(xì)胞相互作用過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。敲除小鼠的研究表明該受體在CD4+T細(xì)胞應(yīng)答中的作用，以及T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞增殖和分化中的作用。與TNFRSF4相關(guān)的疾病包括免疫缺陷和急性移植物抗宿主病，其相關(guān)途徑是免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和Th2分化途徑[15]。麝鼠繁殖期時(shí)的心、肝、肺、睪丸中TNFRSF13C和TNFRSF4的轉(zhuǎn)錄水平高于非繁殖時(shí)期，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05)，說(shuō)明麝鼠繁殖期的免疫能力強(qiáng)于非繁殖時(shí)期。這可能的原因是，10月末的麝鼠已經(jīng)進(jìn)入非繁殖期，該時(shí)期的哈爾濱天氣嚴(yán)寒，麝鼠的食物匱乏，其獲得的有限的能量被更多地用于保持體熱，所以，免疫力相較食物充足的繁殖期有所下降，是機(jī)體適應(yīng)大自然變化規(guī)律的表現(xiàn)。

綜上所述，本研究通過(guò)TNFRSF13C和TNFRSF4基因的轉(zhuǎn)錄水平分析，揭示了這兩個(gè)腫瘤壞死因子在麝鼠繁殖期和非繁殖期心、肝、肺、腎、睪丸和香腺中的表達(dá)差異，可能參與了麝鼠心、肝、肺、腎、睪丸和香腺發(fā)育，可以為麝鼠繁殖和提高泌香產(chǎn)量提供依據(jù)。