張春利，蔡徐山，齊結(jié)華，宦 宇，吳守樂，樂江漫

(上海市嘉定區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，上海 201821)

宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性疾病之一，在生殖系統(tǒng)中發(fā)病率僅次于乳腺癌，且近年來發(fā)病率和致死率均逐年上升[1]。流行病學(xué)調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，髙危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的主要原因，不同型別的HPV致癌作用差別很大，其中HPV-16是目前所發(fā)現(xiàn)的最重要的致癌性HPV，感染人數(shù)占宮頸癌病例總數(shù)的1/2。HPV-16 E6、E7是誘導(dǎo)細(xì)胞惡變的主要蛋白，也是治療宮頸癌的理想靶蛋白，如果能破壞體內(nèi)表達(dá)HPV E6、E7蛋白的細(xì)胞，就能阻止腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，其中E7蛋白抗原性更強(qiáng)[2-5]。近年來細(xì)胞免疫治療已成為繼手術(shù)、放療、化療之后治療腫瘤的又一重要方法，尤其是特異性細(xì)胞免疫治療已成為國際研究熱點(diǎn)，目前樹突狀細(xì)胞(DC)聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(CIK)細(xì)胞在多種腫瘤的治療中取得了較好的療效[6-9]。因此，本研究擬通過用HPV-16 E7蛋白抗原肽負(fù)載DC，再與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察其對siha細(xì)胞的殺傷作用，為治療宮頸癌提供新的治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料 人外周血淋巴細(xì)胞分離液購自北京索萊寶，RPMI1640培養(yǎng)基購自sigma，胎牛血清購自Gibco公司，重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重組人白細(xì)胞介素-4(rhIL-4)、重組人腫瘤壞死因子-α(rhTNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、重組人白細(xì)胞介素-1α(rhIL-1α)、重組人白細(xì)胞介素-2(rhIL-2)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)ELISA試劑盒、IFN-γ ELISA試劑盒購自美國Pepro Tech 公司，流式抗體CD83、CD86、CD3、CD8、CD56購自美國BD公司，F(xiàn)ITC-dextran購自santacruz，CCK8試劑購自Thermo，LDH釋放檢測試劑盒購自Promega,宮頸癌siha細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 方法

1.2.1 HPV-16 E7抗原肽的設(shè)計(jì)與合成 以HPV-16 E7為標(biāo)準(zhǔn)，在UniProtKB蛋白庫中，利用ExPASy-ProtScale、Antibody epitope prediction抗原表位預(yù)測網(wǎng)站及Cn3D軟件，分析推測出可能成為抗原表位的氨基酸序列，最終根據(jù)親水性、抗原性及表面可能性選取兩條抗原肽，分別為Ag1(HPV-16 E738-54)：CDGPAGQAEPDRAHYNN；Ag2(HPV-16 E714-27)：SLQPETTDLNCYEQ，由吉爾生化(上海)合成。

1.2.2 DC培養(yǎng) 分離健康人單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640完全培養(yǎng)基混勻，接種至12孔板，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)3 h。將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)至T25培養(yǎng)瓶，進(jìn)行CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，剩余的貼壁細(xì)胞加入細(xì)胞因子進(jìn)行DC誘導(dǎo)培養(yǎng)，其中rhGM-CSF 100 ng/mL、rhIL-4 30 ng/mL，隔天半量換液，第5天在相應(yīng)孔中分別加入HPV-16 E7抗原肽，終濃度為50 μg/mL，分別標(biāo)記為Ag1-DC、Ag2-DC、AgM-DC(兩條抗原肽1∶1混合)進(jìn)行抗原負(fù)載，第6天加入1 000 U/mL rhTNF-α促進(jìn)DC分化成熟，第8天得到成熟DC。

1.2.3 CIK細(xì)胞培養(yǎng) 將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶后，加入1 000 U/mL IFN-γ,37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后加入50 ng/mL CD3單抗、1 000 U/mL IL-2、1 000 U/mL IL-1α，每3天換液1次，并添加相應(yīng)濃度的IL-2，第8天收獲CIK細(xì)胞。

1.2.4 DC-CIK共培養(yǎng) 分別將未加抗原負(fù)載的成熟DC、Ag1-DC、Ag2-DC、AgM-DC與CIK細(xì)胞以1∶10比例共培養(yǎng)，每兩天補(bǔ)充含10%血漿、100 ng/mL rhGM-CSF、1 000 U/mL IL-2的RPMI1640培養(yǎng)基，7 d后收獲DC-CIK、Ag1-DC-CIK、Ag2-DC-CIK、AgM-DC-CIK。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表型 將需檢測的細(xì)胞用PBS洗滌重懸，分別加入相應(yīng)抗體，混勻后室溫避光孵育20 min，流式細(xì)胞儀檢測DC攝取能力及表型(CD83、CD86)、CIK細(xì)胞表型(CD3、CD8、CD56)。

1.2.6 ELISA法檢測細(xì)胞因子 取未成熟DC(iDC)、成熟DC(mDC)細(xì)胞上清液，ELISA法檢測IL-12水平；取CIK細(xì)胞、DC-CIK、Ag1-DC-CIK、Ag2-DC-CIK、AgM-DC-CIK細(xì)胞上清液，檢測IFN-γ水平。

1.2.7 CCK8法檢測效應(yīng)細(xì)胞對siha細(xì)胞活性的影響 實(shí)驗(yàn)分為5組，取對數(shù)生長期的siha細(xì)胞，接種于96孔板，1×104個(gè)/孔，貼壁后，將效應(yīng)細(xì)胞CIK、DC-CIK、Ag1-DC-CIK、Ag2-DC-CIK、AgM-DC-CIK分別加入靶細(xì)胞siha培養(yǎng)體系中(效靶比5∶1、10∶1、20∶1)，培養(yǎng)72 h，加入CCK8 10 μL/孔，于培養(yǎng)箱中孵育2 h，在450 nm處檢測吸光度值(A值)，取3個(gè)平行復(fù)孔的平均值。

1.2.8 LDH釋放法檢測效應(yīng)細(xì)胞對siha細(xì)胞的殺傷率 將對數(shù)生長期的siha細(xì)胞接種于96孔板，1×104個(gè)/孔，同時(shí)將效應(yīng)細(xì)胞CIK、DC-CIK、Ag1-DC-CIK、Ag2-DC-CIK、AgM-DC-CIK分別加入siha細(xì)胞培養(yǎng)體系中(效靶比5∶1、10∶1、20∶1)，并設(shè)置自然釋放孔、最大釋放孔，在490 nm處檢測A值，計(jì)算各組細(xì)胞殺傷率，殺傷率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-自然釋放組A值)/(最大釋放組A值-自然釋放組A值)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 DC、CIK細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 外周血PBMC貼壁細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)后，體積增大，呈懸浮或半懸浮狀態(tài)，形態(tài)不規(guī)則，成熟后細(xì)胞表面有毛刺樣突起，為典型的DC(圖1A)；CIK細(xì)胞與DC共培養(yǎng)后，增殖較快，呈集落生長(圖1B)。

注：A表示 mDC(×400); B表示 DC-CIK(×100)。
圖1 成熟DC、DC-CIK共培養(yǎng)形態(tài)

2.2 DC、CIK細(xì)胞表型鑒定 流式細(xì)胞儀檢測未成熟DC(iDC)、成熟DC(mDC)細(xì)胞攝取能力及CD83+、CD86+的表達(dá)水平，結(jié)果表明，DC成熟后，攝取能力降低，CD83+、CD86+表達(dá)率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1；DC-CIK細(xì)胞表面CD3+CD8+、CD3+CD56+表達(dá)水平高于CIK細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1 DC成熟前后攝取率及表型的變化

注：與iDC比較，*P<0.05。

表2 與DC共培養(yǎng)后CIK細(xì)胞表型的變化

注：與CIK比較，#P<0.05。

2.3 DC、CIK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力比較 ELISA結(jié)果顯示，與iDC[(141.30±2.12)pg/mL]相比，mDC上清液中IL-12[(235.20±3.58)pg/mL]增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與CIK細(xì)胞[(328.60±5.41)pg/mL]相比，DC-CIK[(472.90±4.17)pg/mL]、Ag1-DC-CIK[(502.30±5.64)pg/mL]、Ag2-DC-CIK[(527.60±5.44)pg/mL]、AgM-DC-CIK[(538.20±4.93)pg/mL]細(xì)胞上清液中IFN-γ增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 效應(yīng)細(xì)胞對siha細(xì)胞活性的影響 5組效應(yīng)細(xì)胞對siha細(xì)胞均有抑制作用，但與CIK組相比，其余4組抑制作用更強(qiáng)，且經(jīng)HR-HPV-16 E7蛋白抗原肽負(fù)載的3組效應(yīng)細(xì)胞，在效靶比為10∶1、20∶1時(shí)，抑制作用均高于DC-CIK組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

2.5 效應(yīng)細(xì)胞對siha細(xì)胞的殺傷效應(yīng) 與CCK8結(jié)果相似，5組效應(yīng)細(xì)胞對siha細(xì)胞均有殺傷作用，但效靶比為10∶1和20∶1時(shí)，共培養(yǎng)的4組效果明顯強(qiáng)于CIK組，且經(jīng)抗原肽負(fù)載的3組效應(yīng)細(xì)胞Ag1-DC-CIK、Ag2-DC-CIK、AgM-DC-CIK殺傷能力強(qiáng)于DC-CIK組，在5∶1、10∶1、20∶1范圍內(nèi)，隨效靶比升高，殺傷作用也越強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

注：與CIK組比較，*P<0.05；與DC-CIK組比較，#P<0.05。
圖2 各組效應(yīng)細(xì)胞對siha細(xì)胞活性的影響

注：與CIK組比較，*P<0.05；與DC-CIK組比較，#P<0.05。
圖3 各組效應(yīng)細(xì)胞對siha細(xì)胞的殺傷率

3 討 論

宮頸癌在全球女性惡性腫瘤發(fā)病率中居第2位，嚴(yán)重威脅著女性的健康和生命[2-4]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，每年新發(fā)病例中，發(fā)展中國家所占比例高達(dá)80%，而我國宮頸癌發(fā)病率和病死率約占全世界的1/3，并且有年輕化趨勢[5]。因此防治宮頸癌及改善患者預(yù)后的工作極為重要。目前對于宮頸癌的治療主要以手術(shù)與放療為主，化療為輔，但由于常見的胃腸道反應(yīng)、腎毒性、骨髓抑制等缺點(diǎn)，限制了化療在臨床的長期應(yīng)用[10-11]。病因?qū)W和流行病學(xué)研究表明，HR-HPV持續(xù)感染是宮頸癌及其癌前病變的主要病因[12]，其中，HPV-16是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的致癌性HPV，感染人數(shù)占宮頸癌病例總數(shù)的1/2。HPV基因組中一般含8個(gè)可讀框(ORF)，其中E6、E7是主要致瘤蛋白。E7主要與pRb特異性結(jié)合，改變細(xì)胞周期，從而引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和無限增殖，導(dǎo)致細(xì)胞永生化[13-15]。

DC是目前發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)最經(jīng)典的抗原提呈細(xì)胞，能夠?qū)⒖乖庸ぬ幚砗蟪蔬f給 CD8+T 細(xì)胞，促使T細(xì)胞增殖分化為細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞，從而對抗惡性腫瘤。CIK細(xì)胞主要來源于T細(xì)胞，是一組細(xì)胞群，不僅具有T細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性，還具有NK細(xì)胞非MHC限制性殺死腫瘤細(xì)胞的優(yōu)勢。而DC和CIK細(xì)胞共培養(yǎng)，CIK細(xì)胞促使DC進(jìn)一步成熟，成熟DC又會加快CIK細(xì)胞釋放IFN-γ等有效因子，DC、CIK細(xì)胞的這種相互作用使培養(yǎng)的細(xì)胞獲得了對腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的殺傷能力[6-8]。已有研究表明，DC處理腫瘤抗原，然后與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)，可以提高對特定靶細(xì)胞的殺傷能力。DC-CIK對乳腺癌[6]、肺癌[9,16]、卵巢癌[17]等均能有效控制，不良反應(yīng)作用小，不損傷正常組織，能有效改善患者的免疫功能。

大部分腫瘤沒有特異性抗原，只能反復(fù)凍融腫瘤細(xì)胞來負(fù)載DC，但其特異性和有效性受到了限制，且可能對正常細(xì)胞也會進(jìn)行攻擊。宮頸癌發(fā)病機(jī)制明確，因此，根據(jù)HPV-16特性，設(shè)計(jì)并合成了E7蛋白抗原肽作為特異性抗原負(fù)載DC。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DC-CIK共培養(yǎng)可以提高抗腫瘤T淋巴細(xì)胞百分比，分泌更多的IFN-γ，在效靶比為10∶1、20∶1時(shí)，對靶細(xì)胞siha的殺傷效應(yīng)高于CIK細(xì)胞，而經(jīng)HPV-16 E7抗原肽負(fù)載的DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)，表現(xiàn)出對靶細(xì)胞更加強(qiáng)大的殺傷作用，并隨效靶比升高而增強(qiáng)。將兩條抗原肽等比例混合負(fù)載DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)，與單條抗原負(fù)載的DC-CIK相比，殺傷效果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但明顯強(qiáng)于單純CIK細(xì)胞和DC-CIK，這對于指導(dǎo)治療宮頸癌有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究設(shè)計(jì)的兩條HPV-16 E7抗原肽，負(fù)載DC后，能進(jìn)一步激活CIK細(xì)胞，增強(qiáng)對宮頸癌siha細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，為臨床宮頸癌的治療提供了理論依據(jù)，但尚需進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)，其具體機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。