郭金昊 袁子奧 張瑋琪 張明海

(東北林業(yè)大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040)

馬鹿(Cervuselaphus)屬偶蹄目(Artiodactyla)，鹿科(Cervidae)，鹿屬，生活于范圍較大的針闊混交林、林緣或靠近水源的林地，是我國Ⅱ級保護野生動物[1]。東北馬鹿(Cervuselaphusxanthopygus)屬于馬鹿的亞種，是中國北方重要的經(jīng)濟性物種，維持生態(tài)系統(tǒng)平衡的重要功能性物種。近些年，由于自然環(huán)境條件惡化及人為活動的影響，野生東北馬鹿種群數(shù)量不斷減少，僅在內(nèi)蒙古、黑龍江及吉林省的部分區(qū)域有所分布[2]。

目前，針對馬鹿的研究已相當深入，不僅涉及宏觀研究，還包含對微觀方面的探索，宏觀方面包括馬鹿地理分布、個體行為、種群數(shù)量及動態(tài)、生境選擇及營養(yǎng)生態(tài)等；微觀方面包括馬鹿起源與遺傳多樣性、馬鹿繁育、生理與疾病等[3]；微生物方面，僅見馬鹿瘤胃微生物多樣性的相關(guān)研究，而關(guān)于馬鹿腸道菌群多樣性的相關(guān)研究還未見報道[4]。

腸道微生物與宿主相互適應，相互進化，依靠宿主而生存的同時，協(xié)助宿主執(zhí)行某些生理生化功能，幫助宿主渡過極端惡劣的生存環(huán)境[5]。不僅如此，腸道菌群參與宿主體內(nèi)的物質(zhì)循環(huán)、能量流動和信號傳導等過程，對神經(jīng)免疫系統(tǒng)調(diào)控有著重要影響，腸道菌群失衡可能會導致神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)受阻，免疫功能下降，誘發(fā)多種動物慢性病，嚴重會導致動物死亡[6-8]，大量針對人類腸道微生態(tài)的研究表明，腸道微生物是人體有效抵抗外界病原菌入侵的屏障[9-10]。野生東北馬鹿常因為天敵的捕殺、自然環(huán)境的變化、人為活動等因素而死亡，卻低估了腸道菌群對東北馬鹿健康的影響。近些年，有關(guān)動物腸道菌群的研究不斷深入，考慮到腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性對馬鹿腸道穩(wěn)態(tài)及健康的重要性，為了更加科學地保護野生東北馬鹿，本次研究對冬季的馬鹿腸道菌群多樣性進行研究。冬季是馬鹿食物資源最貧乏的時期，本次研究有助于我們了解食物資源貧瘠的條件下馬鹿腸道微生態(tài)情況。野外采樣使用非損傷性糞便采集法，該方法干擾小，不會對馬鹿活動產(chǎn)生影響[11]，研究表明糞便中的菌群結(jié)構(gòu)與宿主腸道中的菌群結(jié)構(gòu)更為相似[12]。

在本研究中，通過高通量測序技術(shù)對野生東北馬鹿腸道菌群多樣性及結(jié)構(gòu)進行分析，分析了在不同分類水平下的優(yōu)勢菌群，比較了不同性別間腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性差異，為馬鹿腸道菌群進一步深入研究提供科學理論數(shù)據(jù)，同時為野生東北馬鹿的科學性保護提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本研究樣品均來于內(nèi)蒙古高格斯臺罕烏拉國家級自然保護區(qū)，該保護區(qū)地處大興安嶺南麓，位于內(nèi)蒙古赤峰市阿魯科爾沁旗北部。采用分層取樣法在馬鹿集中分布區(qū)隨機布設(shè)樣線，調(diào)查區(qū)域包含落葉闊葉林、楊樺林、闊葉灌叢、草原及草原-森林過渡帶等多種景觀。采用非損傷性糞便采樣法對東北馬鹿的糞便進行收集，并用GPS進行地理位置標記(圖1)，共收集24份新鮮野生東北馬鹿糞便。不同的樣品保存方式會影響到后續(xù)DNA提取及腸道菌群分析，研究表明冷凍糞便保存法得到的DNA測試結(jié)果更為準確，因此野外收集的糞便樣品立即放置于-20 ℃的保溫箱內(nèi)[13]，采集回來的糞便樣本均放置在超低溫冰箱-80 ℃保存。

圖1 樣品采集點位置圖Fig.1 The sites of samples in study area

1.2 實驗方法

使用細菌16S rDNA通用引物338F_806R對序列的V3-V4區(qū)域進行擴增[14]。反應的總體系為20 μL，其中DNA模板10 ng，5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mM dNTP 2 μL，F(xiàn)orward Primer(5 μM)0.8 μL，Reverse Primer(5 μM)0.8 μL，F(xiàn)astPfu DNA Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，最后加去離子水至20 μL。擴增過程分為3步，第一步在95 ℃下解鏈3 min；第二步95 ℃下解鏈30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，該步驟循環(huán)30次；第三步在72 ℃下延伸10 min。擴增產(chǎn)物通過2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。酶切產(chǎn)物用sigma酶切純化試劑盒純化，去處殘留的酶和鹽類，使得后續(xù)分析圖譜中能出現(xiàn)比較清晰的峰。

通過PCR將Illumina官方接頭序列添加至目標區(qū)域外端，使用TruSeqTM DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，用Tris-HCl緩沖液洗脫，同時用2%瓊脂糖電泳檢測，最后通過氫氧化鈉變性，生成單鏈DNA片段完成文庫構(gòu)建。構(gòu)建的文庫通過Qubit@ 2.0熒光計和Agilent 2100生物芯片分析系統(tǒng)進行質(zhì)檢。最終，文庫將通過Illumina Hiseq 2500進行測序。

2 數(shù)據(jù)處理

得到的所有原始序列均需要進行質(zhì)量檢測，通過降噪處理去除短序列、錯配序列和嵌合體序列，得到符合要求的非嵌合體序列[15]。

利用 Usearch(version 7.0)軟件進行序列聚類分析，以97%的序列一致性為劃分標準進行聚類并得到OTUs(operational taxonomic units)；為了得到每個OTU對應的物種分類信息，基于RDP classifier貝葉斯算法利用QIIME平臺對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析；對樣本數(shù)據(jù)進行均一化處理并以數(shù)據(jù)量最少樣本為標準，后續(xù) Alpha 多樣性和Beta多樣性計算均依賴該標準。

3 結(jié)果與分析

東北馬鹿24份新鮮糞便樣品共獲得有效序列685 896條，每個樣品的有效序列均為28 579條，平均長度409 bp。以97%的序列一致性為劃分標準進行聚類，共得到2 220個OTUs，表1為各個樣品的有效序列數(shù)目和OTUs數(shù)目。

表1 樣品序列數(shù)目及OTU統(tǒng)計

Tab.1 Sequence number and OTU statistic

3.1 不同分類水平上馬鹿腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)物種注釋結(jié)果，共獲得21門33綱74目131科306屬。圖2為門水平下馬鹿腸道菌群的平均豐度占比情況，在門水平下，平均豐度排名前5的菌門包括厚壁菌門(Firmicutes，79.43%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，16.64%)、軟壁菌門(Tenericutes，1.49%)、放線菌門(Actinobacteria，0.68%)和藍細菌門(Cyanobacteria，0.42%)，其中占優(yōu)勢的菌門為厚壁菌門和擬桿菌門。

圖2 門水平菌群平均豐度Fig.2 The relative abundance of species on the phylum level

在綱水平下，平均豐度排名前5的菌綱包括梭菌綱(Clostridia，77.96%)、擬桿菌綱(Bacteroidia，16.64%)、柔膜菌綱(Mollicutes，1.49%)、丹毒絲菌綱(Erysipelotrichia，0.76%)和放線菌綱(Actinobacteria，0.68%)(圖3)，其中占優(yōu)勢的菌綱為梭菌綱和擬桿菌綱。

圖3 綱水平菌群平均豐度Fig.3 The relative abundance of species on the class level

在目水平下，排名前5的菌目包括梭菌目(Clostridiales，77.96%)、擬桿菌目(Bacteroidales，16.64%)、柔膜細菌目(Mollicutes_RF39，1.06%)、丹毒絲菌目(Erysipelotrichales，0.76%)和紅蝽菌目(Coriobacteriales，0.64%)(圖4)，其中占優(yōu)勢的菌目為梭菌和擬桿菌目。

在科水平下，排名前5的菌科包括瘤胃菌科(Ruminococcaceae，52.15%)、毛螺菌科(Lachnospiraceae，14.62%)、Christensenellaceae(7.66%)、理研菌科(Rikenellaceae，5.19%)和擬桿菌科(Bacteroidaceae，4.45%)(圖5)，其中占優(yōu)勢的菌科為瘤胃菌科和毛螺菌科。

在屬水平下，排名前5的菌屬Ruminococcaceae_UCG-005(21.51%)、Christensenellaceae_R-7_group(7.56%)、未鑒定出的unclassifiedLachnospiraceae(6.86%)、Ruminococcaceae_UCG-010(5.45%)和Ruminococcaceae_UCG-013(4.76%)(圖6)，其中占優(yōu)勢的菌屬包括Ruminococcaceae_UCG-005和Christensenellaceae_R-7_group。

圖4 目水平菌群平均豐度Fig.4 The relative abundance of species on the order level

圖5 科水平菌群平均豐度Fig.5 The relative abundance of species on the family level

圖6 屬水平菌群平均豐度Fig.6 The relative abundance of species on the genus level

3.2 Alpha 多樣性指數(shù)分析

Alpha多樣性用于分析樣品的微生物群落多樣性，主要包括Shannon、Chao1、Simpson、ACE等統(tǒng)計學分析指數(shù)。本次研究中，以97%的序列一致性為劃分標準而獲得的各樣品Alpha 多樣性指數(shù)如表2所示，Shannon指數(shù)范圍為5.19—5.70，Simpson指數(shù)范圍為0.008—0.020，ACE指數(shù)范圍為1 164—1 477，Chao指數(shù)范圍為1 194—1 490。

表2 不同馬鹿樣品的Alpha多樣性指數(shù)

Tab.2 The Alpha diversity index of samples from red deer

續(xù)表2

圖7為樣品的稀疏性曲線，X軸代表樣品的測序量，Y軸代表樣品的Shannon指數(shù)，隨著測序量的不斷增加，曲線趨于平緩不再變化，說明本次試驗的測序量達到飽和，能夠基本反映本次研究中馬鹿腸道微生物的多樣性。

圖8為樣品的等級聚類曲線，X軸代表OTU等級，相對豐度由高到低排列；Y軸代表該等級OTU中序列數(shù)的相對百分比，曲線在X軸上跨度越大，說明樣品中微生物越豐富，在Y軸上越平滑，說明樣品中微生物均勻度高。

Good’s coverage指數(shù)用來衡量樣本測序完整性，經(jīng)測定(圖9)，樣本Good’s coverage指數(shù)均達到99%，說明能較好地反映樣本的菌群情況。

圖7 樣品的稀疏性曲線Fig.7 The rarefaction curves of samples from red deer

圖8 樣品的等級聚類曲線Fig.8 The rank-abundance curves of samples from red deer

圖9 Good’s coverage 指數(shù)圖Fig.9 The Good’s coverage curves of samples from red deer

表3為不同性別間Alpha多樣性指數(shù)差異檢驗，其中F-mean和F-sd為雌性馬鹿樣品的均值和標準差；M-mean和M-sd為雄性馬鹿樣品的均值和標準差。從表中可以清楚地看出，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao指數(shù)在性別間均無顯著差異(P>0.05)。

3.3 Beta 多樣性指數(shù)分析

圖10為基于weighted-unifrac的樣品距離Heatmap圖，X軸和Y軸均為樣本，樣本之間的距離用不同的顏色梯度來表示，越接近綠色代表樣本間微生物結(jié)構(gòu)越相近，越接近紅色代表微生物結(jié)構(gòu)差異越顯著，格子里面的值代表樣本間的加權(quán)距離數(shù)值，值越小代表2個樣本之間的微生物多樣性及結(jié)構(gòu)差異越小。

圖11為不同性別樣本的PCoA分析圖，X軸和Y軸表示兩個選定的主成分，百分比表示主成分對樣本組成差異的貢獻值。不同顏色或形狀的點代表不同分組的樣本，兩樣本點越接近，表明兩樣本物種組成越相似。由該圖可以看出，雌性與雄性樣本混合在一起，沒有明顯的區(qū)分，說明腸道微生物多樣性無顯著的差異。

表3 不同性別樣品指數(shù)顯著性檢驗

Tab.3 The significant test of Alpha index between sexes

圖10 不同樣品間群落結(jié)構(gòu)距離HeatmapFig.10 The community Heatmap plot between samples

圖11 不同性別樣品的主坐標分析Fig.11 The principal co-ordinates analysis between sexes

圖12為不同性別樣品的物種Venn圖，藍色區(qū)域代表雄性樣本，紅色區(qū)域代表雌雄樣本，兩者重合區(qū)域為共有的物種數(shù)，非重疊部分為特有的物種數(shù)。由該圖看出，雄性樣本中共有1 873個OTUs，雌性樣本中共有2 143個OTUs，其中77個OTUs為雄性樣本所特有，347個為雌性樣本所特有，雌性樣本整體OTUs數(shù)目高于雄性樣本中OTUs數(shù)目。

基于LEfSe多級物種差異判別分析東北馬鹿雌雄組間物種差異，如圖13所示，為門水平至屬水平LDA判別柱形圖，藍色為雄性組，紅色為雌性組，柱形圖的長度代表LDA分值，分值越大代表物種豐度對差異效果影響越大(LDA閾值為2)。雄性分組中豐度具有顯著差異的微生物類群包括：Sphingomonadales目、Kaistiaceae科、Sphingomonadaceae科、Kaistia屬、Papillibacter屬、Sphingomonas屬；雌性分組中豐度有顯著差異的微生物類群包括：Muribaculaceae科、Xanthobacteraceae科、Defluviitaleaceae科、Alloprevotella屬、GWE2_31_10、Defluviitaleaceae_UCG_011、Eubacterium_ruminantium_group。

圖12 不同性別樣品的物種Venn圖Fig.12 The Venn plot of samples between sexes

圖13 門水平至屬水平LDA判別柱形圖Fig.13 The LDA discriminant histogram from phylum to genus level

4 討論

腸道菌群與動物宿主相互適應，協(xié)同進化，幫助宿主消化吸收食物和能量代謝，影響宿主的健康情況，被譽為動物的“第二套基因組”[16]。目前，國內(nèi)關(guān)于野生馬鹿腸道菌群的研究還未見報道，馬鹿在我國被列為國家Ⅱ級保護動物，是具有重要經(jīng)濟價值的大型有蹄類動物[1]，掌握其腸道微生態(tài)對科學研究和保護具有重要意義。冬季是一年中馬鹿食物資源最貧乏，食物營養(yǎng)成分和食物可獲得性最低的時期[17]，這會對馬鹿腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，為了弄清冬季馬鹿腸道菌群結(jié)構(gòu)的情況，對24份新鮮的冬季馬鹿糞便進行測序分析。

研究結(jié)果表明，在測定出的21門中，厚壁菌門(79.43%)和擬桿菌門(6.64%)是野生東北馬鹿的主要菌門。這與梅花鹿(Cervusnippon)、海南坡鹿(Rucervuseldiihainanus)等有蹄類動物糞便中微生物多樣性研究結(jié)果一致，野生梅花鹿冬季糞便中厚壁菌門占比77.624%，擬桿菌門占比18.288%；來自廣州動物園的海南坡鹿糞樣中厚壁菌門占比50.49%，擬桿菌門占比36.52%[18-19]。厚壁菌門和擬桿菌門廣泛存在于草食性動物的瘤胃中[20]，厚壁菌門在腸道中能夠幫助多糖的發(fā)酵，與擬桿菌門一同幫助宿主消化一些自身無法消化的食物[21]，是主要的纖維素分解菌，而擬桿菌門是主要的多糖降解利用菌，可以提高宿主對碳水化合物、蛋白質(zhì)和其他物質(zhì)的利用率[22-23]，兩個菌門的平衡穩(wěn)定對維持宿主腸道微生態(tài)的穩(wěn)定及宿主健康有著重要作用。關(guān)于野生東北馬鹿冬季營養(yǎng)策略相關(guān)的研究表明，該地區(qū)冬季馬鹿主要采食柳屬(Salixspp.)、榆樹(Ulmuspumila)、山杏(Prunussibirica)、白樺(Betulaplatyphylla)、細裂葉蓮蒿(Artemisiagmelinii)等植物，采食頻率與主要食物中粗脂肪和纖維素的含量成正相關(guān)[24]，厚壁菌門和擬桿菌門菌群對纖維素的分解以及碳水化合物的吸收、利用起到重要作用。梭菌目和擬桿菌目作為東北馬鹿腸道中主要的菌目，其平均豐度分別為77.96%和16.64%。以植物為食的哺乳動物需要消化吸收大量的纖維素、半纖維素等多種難以降解的植物細胞壁成分[25]，梭菌目和擬桿菌目對降解纖維素等多糖方面具有重要的作用。除此之外，腸道中占主導地位的瘤胃菌科(52.15%)和毛螺菌科(14.62%)也與食草動物消化吸收纖維素、半纖維素密切相關(guān)[26]。在屬水平下，占優(yōu)勢的菌屬包括Ruminococcaceae_UCG-005和Christensenellaceae_R-7_group，均屬于厚壁菌門。馬鹿冬季的食物選擇既不是單一營養(yǎng)成分也不是單一因素所決定的，而是多種營養(yǎng)成分和多種因素共同決定的，飲食對馬鹿腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響，不同的采食策略會導致腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異[27]。

雌雄個體在新陳代謝方面存在顯著差異，雌性個體食物消化率較低于雄性[28-29]，雌性個體更多取食高粗蛋白、高能量低粗纖維的植物，因此雌性花費更多精力來尋找食物，雄性則花費更多的時間進行咀嚼和反芻[30]，從而采食行為在不同性別間存在差異?；诖朔N觀點，本次研究將性別作為腸道菌群多樣性研究的一個很重要分析因子。然而，研究結(jié)果顯示，不同性別馬鹿腸道菌群結(jié)構(gòu)并無顯著差異，僅部分科屬間存在豐度差異，這可能是由于馬鹿為了生存，會以不同的方式去適應環(huán)境和食物類型，從而行為表現(xiàn)出高度的可塑性[31]。

本次研究摸清了冬季馬鹿腸道菌群多樣性及結(jié)構(gòu)，認識到馬鹿腸道菌數(shù)量龐大且結(jié)構(gòu)復雜，在個體間存在著一定的差異性，這與在不同環(huán)境壓力下馬鹿的采食策略密不可分。未來研究應集中在影響馬鹿腸道菌群結(jié)構(gòu)因素和腸道菌類特定功能的探索，這對野生馬鹿的保護具有重要意義。

致謝：感謝東北林業(yè)大學張瑋琪、鐘林強、孫悅、張寧以及內(nèi)蒙古高格斯臺保護區(qū)工作人員對我的幫助！同樣，十分感謝上海美吉生物公司在高通量測序方面提供的技術(shù)支持！