張春紅，王小敏，閭連飛，李維林，吳文龍

（1.江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所，江蘇 南京 210014；2.南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江蘇 南京 210037）

黑莓Rubusspp.隸屬于薔薇科Rosaceae懸鉤子屬Rubus，為第3代小漿果類(lèi)果樹(shù)的一種特色類(lèi)型，其果實(shí)含有人體必需的可食纖維質(zhì)、基礎(chǔ)維生素、礦質(zhì)元素及酚類(lèi)物質(zhì)等，受消費(fèi)者青睞[1]。懸鉤子果樹(shù)遺傳背景較為復(fù)雜，且不同倍性種質(zhì)的親和性較低，使得其常規(guī)育種工作進(jìn)展較慢。SSR（simple sequence repeats）又稱(chēng)“簡(jiǎn)單序列重復(fù)”，是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種新型DNA標(biāo)記，具有多態(tài)性豐富和共顯性等顯著優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于不同樹(shù)種的品種鑒定、種質(zhì)資源研究、遺傳圖譜構(gòu)建以及標(biāo)記輔助選擇等[2-3]。利用已報(bào)道的SSR標(biāo)記開(kāi)展雜交品種系譜分析[4]、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和基因定位[5]以及黑莓雜交品系鑒定[6]，證實(shí)SSR引物在黑莓種質(zhì)資源鑒定和育種中具有極好的應(yīng)用潛力。然而，黑莓品種多由懸鉤子種質(zhì)高度雜合選育而來(lái)，種質(zhì)遺傳背景不清晰，使得種質(zhì)鑒定、雜交育種、種質(zhì)挖掘等具有一定難度，現(xiàn)有可用于分析的SSR引物也具一定的局限性。因而，有必要利用現(xiàn)有的生物學(xué)手段開(kāi)發(fā)更多適用性好的SSR引物用于黑莓種質(zhì)鑒定，這有利于了解現(xiàn)有種質(zhì)品種遺傳基礎(chǔ)，為開(kāi)展雜交組合親本選配及輔助選擇育種提供現(xiàn)實(shí)依據(jù)。

品種遺傳多樣性一方面表現(xiàn)在表型性狀上的差異，可根據(jù)表型及生長(zhǎng)性狀進(jìn)行種質(zhì)遺傳多樣性評(píng)價(jià)[7]；另一方面，分子標(biāo)記的發(fā)展為從DNA水平上檢測(cè)品種及品系間的遺傳多樣性提供了有利工具。近年來(lái)，基于高通量測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記逐漸成為一種獲取特異標(biāo)記位點(diǎn)的有效方法[8]?；谵D(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)掘的EST-SSR標(biāo)記作為共顯性標(biāo)記具有特異性和多態(tài)性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，可有效用于物種鑒定和遺傳多樣性分析[9]。EST-SSR標(biāo)記作為編碼序列的一部分，基于基因編碼區(qū)開(kāi)發(fā)，能夠作為某些性狀或者基因的直接功能基因標(biāo)記。本研究中基于課題組前期黑莓轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，搜索分析其中EST-SSR標(biāo)記，對(duì)具有應(yīng)用潛力的標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證和開(kāi)發(fā)，旨在利用多態(tài)性好的標(biāo)記進(jìn)行現(xiàn)有黑莓品種間遺傳多樣性分析，為檢驗(yàn)EST-SSR標(biāo)記的可行性及黑莓雜交組合配制親本選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為課題組從國(guó)外引進(jìn)的18份黑莓品種，種植于江蘇南京溧水白馬科學(xué)基地，其名稱(chēng)、育種原地和系譜等信息見(jiàn)表1。于旺盛生長(zhǎng)期采集各黑莓品種幼嫩葉片，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取

參照文獻(xiàn)[10]，采用CTAB法提取黑莓基因組DNA。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)其質(zhì)量，將DNA質(zhì)量濃度稀釋至50 ng/μL后，置于-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR序列的篩查與鑒定

EST-SSR序列來(lái)源于前期黑莓品種‘Boysenberry’轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果[11]。利用MISA工具篩查SSR序列，根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析ESTSSR序列（≥20 bp），進(jìn)一步選取其中部分序列用于黑莓品種遺傳多樣性分析。篩查標(biāo)準(zhǔn)為SSR位點(diǎn)側(cè)翼序列長(zhǎng)度不小于50 bp，2、3、4、5和6核苷酸的最小重復(fù)次數(shù)分別為10、7、5、5、5次，EST序列長(zhǎng)度大于100 bp。共初步篩查到127個(gè)符合要求的SSR序列，分別將其編號(hào)為Rh1～Rh127。

1.2.3 SSR引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)上述檢測(cè)到的序列和位點(diǎn)，使用Primer 3設(shè)計(jì)SSR引物。引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)：引物序列中無(wú)SSR；序列在DNA保守序列區(qū)內(nèi)；長(zhǎng)度18～24 bp；上下游引物不存在互補(bǔ)序列；引物自身不存在互補(bǔ)序列；引物退火溫度50～65 ℃；上下游引物的退火溫度差值不大于5 ℃；GC含量40%～60%；產(chǎn)物大小為100～400 bp。篩選到的2～6核苷酸重復(fù)基序的127對(duì)EST-SSR引物（Rh1～Rh127），由上海捷瑞生物工程有限公司合成，用于后續(xù)引物篩選和品種鑒定。

1.2.4 SSR引物的擴(kuò)增篩選

利用上述EST-SSR引物，擴(kuò)增黑莓的基因組DNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積為20 μL，其中包括1 μL 50 ng模板DNA、10 μL 2×Taq PCR Master Mix（含有Taq酶、dNTP和優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液）、10 μmol/L的上游和下游引物各1 μL，7 μL的ddH2O。PCR反 應(yīng) 程 序：94 ℃預(yù)變性 5 min，然后進(jìn)行30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性30 s，復(fù)性（45～60 ℃）30 s，72 ℃延伸 30 s，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)在ABI Veriti96 PCR儀上進(jìn)行。

表1 18個(gè)黑莓品種的名稱(chēng)、系譜和原產(chǎn)地Table 1 Names, parentages and breeding locations of 18 Rubus spp.cultivars

反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物加入2 μL 6×loading buffer，以50 bp DNA Ladder為DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用8%的非變性聚丙烯酰胺進(jìn)行電泳，電泳緩沖液為1×TBE，150 V穩(wěn)壓電泳120 min，以藍(lán)色條帶跑至距聚丙烯凝膠底部1/3左右為宜。電泳結(jié)束后，用0.2%AgNO3染色和拍照。利用篩選出的多態(tài)性好的SSR引物對(duì)各種質(zhì)資源的黑莓基因組總DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)條帶擴(kuò)增情況統(tǒng)計(jì)穩(wěn)定擴(kuò)增出清晰目的條帶的引物。

1.2.5 SSR引物在黑莓品種遺傳多樣性分析中的應(yīng)用

用上述篩選得到的127對(duì)引物進(jìn)行SSR擴(kuò)增，隨機(jī)選擇品種模板用于引物及最適退火溫度的篩選，各引物對(duì)應(yīng)的最適退火溫度通過(guò)梯度PCR試驗(yàn)確定。記錄每個(gè)樣品每對(duì)引物的DNA擴(kuò)增帶型，將多態(tài)性穩(wěn)定的引物的擴(kuò)增結(jié)果拍照。將其條帶大小與相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對(duì)記載，將有條帶標(biāo)記為“1”，無(wú)法正確辨別帶型以“0”表示。根據(jù)DNA擴(kuò)增帶型區(qū)分鑒定黑莓品種，帶型數(shù)據(jù)用于后續(xù)遺傳多樣性分析。通過(guò)分析EST-SSR結(jié)果，比較品種間多態(tài)性位點(diǎn)的差異，確定引物的多態(tài)率和多態(tài)信息量。使用NTSYS-pc Ver.2.10e軟件進(jìn)行基于UPGMA法的聚類(lèi)分析，使用Picalc 0.6軟件計(jì)算各引物的位點(diǎn)多態(tài)性信息含量（PIC）值。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物多態(tài)性擴(kuò)增產(chǎn)物的篩選

將127對(duì)SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，篩選引物適合溫度并檢測(cè)目的條帶情況，發(fā)現(xiàn)除Rh15和Rh127外其余125對(duì)引物均可擴(kuò)增出條帶。將125對(duì)引物用于18個(gè)品種的擴(kuò)增鑒別，發(fā)現(xiàn)有特異條帶且大小符合預(yù)期的引物共50對(duì)。50對(duì)引物中有多態(tài)引物為45對(duì)（表2），占引物數(shù)的36%，進(jìn)一步將45對(duì)引物用于黑莓品種種質(zhì)的遺傳多樣性分析。

2.2 多態(tài)性引物擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性

45對(duì)多態(tài)性引物中，多數(shù)引物擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)為2～5。用45對(duì)多態(tài)性引物在18份材料中共檢測(cè)到191個(gè)等位基因變異，平均每個(gè)SSR位點(diǎn)有4.24個(gè)，變幅為2～8個(gè)。位點(diǎn)PIC為0.427～0.893，平均0.692?；究捎行z測(cè)出不同品種間材料的SSR差異位點(diǎn)，具有較高的遺傳多樣性代表性。

根據(jù)45對(duì)條帶清晰、多態(tài)性好、穩(wěn)定性好、便于統(tǒng)計(jì)的引物擴(kuò)增結(jié)果，利用UPGMA對(duì)18份不同類(lèi)型的材料進(jìn)行聚類(lèi)分析（圖1）。從聚類(lèi)群中可以看出，18份材料可被明顯分為3個(gè)大類(lèi)群，從上至下分別包括7、8和3個(gè)品種，分別記為第1、第2和第3類(lèi)群。第1類(lèi)群中，除Brazos產(chǎn)地為德克薩斯州外，其余均由阿肯色州立大學(xué)選育。第2類(lèi)群中8個(gè)品種均由美國(guó)農(nóng)業(yè)部推選，第3類(lèi)群中3個(gè)品種產(chǎn)地來(lái)源不同，Boysenberry和Youngberry均為七倍體，Black Butte為六倍體。

表2 黑莓多態(tài)性EST-SSR引物序列及多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果Table 2 Polymorphic EST-SSR primer sequences from Rubus spp.and ploymorphism detection result

45對(duì)引物中，多態(tài)性較好的引物有Rh121，檢測(cè)到8個(gè)等位基因，其次是Rh114和Rh118，均可檢測(cè)到7個(gè)等位基因，有7對(duì)SSR引物（Rh37、Rh40、Rh74、Rh100、Rh103、Rh111、Rh115）可檢測(cè)到6個(gè)等位基因，另有7對(duì)引物檢測(cè)到5個(gè)等位基因。Rh72、Rh100、Rh118、Rh121分別可檢測(cè)到5、6、7、8個(gè)等位基因，擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，這些引物擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，或易于區(qū)分18份材料，因此具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

圖1 基于遺傳相似系數(shù)的18個(gè)黑莓品種的聚類(lèi)分析Fig.1 Cluster analysis result of 18 Rubus spp.cultivars based on genetic similarity coefficients

圖2 4對(duì)多態(tài)性好的SSR引物對(duì)18個(gè)黑莓品種基因組DNA的擴(kuò)增圖譜Fig.2 Amplification maps of genomic DNA from 18 Rubus spp.cultivars by using four polymorphic EST-SSR primers

3 結(jié)論與討論

自1986年由江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所引入國(guó)內(nèi)以來(lái)，黑莓在生產(chǎn)上表現(xiàn)出良好的潛力，但其遺傳背景復(fù)雜且種間親和性低等因素使得育種進(jìn)展緩慢。將SSR標(biāo)記用于不同物種品種鑒定及遺傳多樣性分析上的研究已有大量報(bào)道，但應(yīng)用于懸鉤子屬果樹(shù)黑莓開(kāi)發(fā)利用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，目前僅有Lewers等[12]進(jìn)行EST文庫(kù)搜索和Castillo等[13]建立基因組文庫(kù)開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記的報(bào)道。本課題組前期通過(guò)對(duì)1年生黑莓枝莖尖進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，預(yù)測(cè)搜索到3 393個(gè)EST-SSR標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)重復(fù)位點(diǎn)長(zhǎng)度在20 bp以上的1～6堿基重復(fù)的SSR數(shù)目為338條[11]。在此基礎(chǔ)上，本研究中設(shè)計(jì)了其中不同重復(fù)基元多態(tài)性潛能高的127對(duì)SSR引物，擴(kuò)增黑莓基因組DNA后，發(fā)現(xiàn)僅2對(duì)無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，表明所設(shè)計(jì)引物具有良好的擴(kuò)增效果。125對(duì)引物中有45對(duì)呈現(xiàn)多態(tài)性，利用這些引物對(duì)18份黑莓品種樣品進(jìn)行遺傳多樣性檢測(cè)，結(jié)果表明這些引物多態(tài)性信息含量豐富，可進(jìn)一步用于懸鉤子果樹(shù)黑莓品種雜交鑒定、指紋圖譜構(gòu)建等育種研究。

本研究中所用的引進(jìn)黑莓品種主要來(lái)源于美國(guó)俄勒岡州和阿肯色州的兩大黑莓育種中心，且多為四倍體[14]。從系譜分析和育成地點(diǎn)來(lái)看，供試材料中有6個(gè)引進(jìn)品種均由美國(guó)阿肯色州立大學(xué)黑莓育種試驗(yàn)站選育（表1），在聚類(lèi)分析中明顯聚在一起，可能與其親本來(lái)源種質(zhì)成分具一定相似之處有關(guān)。如Natchez品種雖選自Clarksville，但因系譜中含Arapaho品種成分而與Arapaho距離較近。Brazos由馬里蘭大學(xué)選育，但Natchez[15]、Arapaho[16]、Choctaw、Shawnee、Comanche系譜中均有Brazos成分，因而B(niǎo)razos距離這些品種較近。另一四倍體黑莓類(lèi)群中，已知產(chǎn)地的品種均來(lái)自美國(guó)農(nóng)業(yè)部俄勒岡州，盡管有些系譜來(lái)源不詳，根據(jù)其較近的親緣關(guān)系聚類(lèi)結(jié)果推測(cè)，相似產(chǎn)地的品種可能具有某些相似遺傳種質(zhì)成分。此外，Hull和Chester均由美國(guó)馬里蘭州Beltsville試驗(yàn)中心選育，其系譜近似（表1），但根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)其帶型有一定差距，表明其遺傳背景有一定差異，這與2個(gè)品種植株的田間表現(xiàn)差異較大也基本一致，一定程度上反映了黑莓雜交重組中的復(fù)雜性[6]。3個(gè)多倍體黑莓品種六倍體Black Butte[17]、七倍體的Boysenberry和Youngberry[18]距離較近，可能一定程度上與其復(fù)雜但相似的遺傳種質(zhì)成分有關(guān)。

隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的標(biāo)記類(lèi)型被開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，目前已有基于SSR和EST-SSR標(biāo)記的四倍體黑莓連鎖圖譜的報(bào)道[5]，SSR標(biāo)記在遺傳背景復(fù)雜的黑莓遺傳分析中的應(yīng)用展現(xiàn)出廣泛的前景。本研究中基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選出多態(tài)性較好的45對(duì)EST-SSR引物，其可應(yīng)用于分析現(xiàn)有黑莓品種種質(zhì)的遺傳多樣性，且發(fā)現(xiàn)目前引種黑莓種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)相對(duì)較窄。本研究中僅對(duì)目前江蘇地區(qū)栽植的主要黑莓引種品種進(jìn)行了評(píng)價(jià)，所用的EST-SSR引物也僅來(lái)自于1年生營(yíng)養(yǎng)莖尖測(cè)序結(jié)果，因此須開(kāi)發(fā)和挖掘更多的EST-SSR和SSR標(biāo)記進(jìn)行綜合深入評(píng)價(jià)。在下一步的黑莓育種工作中，將從引進(jìn)更多來(lái)源地黑莓種質(zhì)資源、挖掘國(guó)內(nèi)懸鉤子屬野生種質(zhì)資源以及利用多種育種方法創(chuàng)制黑莓種質(zhì)資源等方面開(kāi)展研究。