鄒小興，倪 林，黃 維，鄒雙全

（福建農(nóng)林大學 a.林學院；b.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心；c.植物保護學院；d.生命科學學院，福建 福州 350002）

圓齒野鴉椿Euscaphis konishiiHayat為省沽油科Staphyleaceae野鴉椿屬Euscaphis常綠灌木或小喬木[1]，是具有重要價值的觀賞藥用植物，在抗炎、抗癌、保肝等方面作用顯著[2-6]，也是畬藥“雞眼睛”[7]和苗藥“血脈通膠囊”[8]的重要原料。近年來，多種具有顯著藥理活性的三萜類化合物已經(jīng)從同屬野鴉椿E.japonica植物體中分離得到[9-11]。但是，關于圓齒野鴉椿體內(nèi)三萜類化合物含量及其與野鴉椿三萜類化合物含量的差異、三萜類物質(zhì)在圓齒野鴉椿不同部位的分布情況、不同生長區(qū)域和采收月份對圓齒野鴉椿體內(nèi)總?cè)祁惢衔锓e累的影響等方面的研究仍未見報道。為此，筆者針對以上問題展開研究，以探尋三萜類化合物在野鴉椿和圓齒野鴉椿植物體內(nèi)積累的規(guī)律，為進一步研究其藥用價值和科學栽培奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地分別位于福建省邵武市將石自然保護區(qū)（以下簡稱為“邵武”，SW）、清流縣益晟園林苗木基地（以下簡稱為“清流”，QL）、福建農(nóng)林大學科技園（以下簡稱為“農(nóng)大”，ND）和福州市閩清縣下祝鄉(xiāng)翁山頭（以下簡稱為“閩清”，MQ）。圓齒野鴉椿種植密度為2 m×2 m。以GPS測定各試驗地的經(jīng)緯度、海拔，從當?shù)貧庀蟛块T采集各試驗地的氣候因子數(shù)據(jù)。采集各試驗地的土壤樣品，測定其堿解氮、速效磷和速效鉀含量。各試驗地概況見表1。

表1 各試驗地概況Tabble 1 Each test plot status

1.2 試驗材料

1.2.1 試驗植株的選擇

2014年6月，分別在邵武、清流、農(nóng)大3個試驗地選擇長勢良好的8年生圓齒野鴉椿各10株，在閩清試驗地選擇6年生野鴉椿和圓齒野鴉椿各10株，掛牌標記，進行常規(guī)水肥管理。

1.2.2 樣品采集

閩清試驗地野鴉椿和圓齒野鴉椿葉片和枝條的采樣時間為2014年8月；清流、邵武、農(nóng)大3個 試驗地的采樣時間均分別為2014年11月（圓齒野鴉椿果實成熟即其旺盛生長基本結束時期）和2015年3月（春季植株開始抽芽前時期），2014年 11月采集葉片、枝條、果實和種子，2015年3月只采集葉片和枝條。采集時，從掛牌標記植株的不同方位采集葉片（2014年春季萌發(fā)的葉片）、枝條（頂芽往下約35 cm處）和果實。各樣品采集量均為500 g，分別放入信封中，帶回實驗室以備用。

1.3 總?cè)坪康臏y定

將果皮和種子分離，然后將所有樣品經(jīng)40 ℃烘干，粉碎，過40目篩，低溫密封保存。利用高氯酸和5%的香草醛-冰醋酸溶液與三萜類化合物的顯色反應，采用比色法[12]測定三萜類化合物的含量。

1.3.1 標準曲線的繪制

分別精確吸取以無水乙醇為溶劑溶解的齊墩果酸標準溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80 mL，分別置于5 mL的容量瓶中，在80 ℃的水浴上蒸干后加入0.30 mL的新制5%的香草醛-冰醋酸溶液（稱取香草醛1.25 g，迅速用適量冰醋酸溶解轉(zhuǎn)入25 mL的容量瓶中定容，當日使用）和1.00 mL的高氯酸后搖勻，于60 ℃的水浴保溫反應 20 min后，用流水將其冷卻至室溫，再加入冰醋酸定量到10 mL，搖勻，同時作試劑空白，以空白對照和不同濃度水平的齊墩果酸對照品溶液分別在400～900 nm的波長范圍內(nèi)掃描，確定對照品的最大吸收波長。在波長為550 nm 處以試劑空白為參比，用1 cm的比色皿測定體系吸光度值（OD值）。以齊墩果酸的微克數(shù)為縱坐標，以OD值為橫坐標，建立標準曲線（n=3），其標準曲線如圖1所示，其回歸方程為：

y=0.021 1x+0.000 7，R2=0.998 4。

式中：y表示對照品中齊墩果酸的濃度（mg·mL-1）；x表示溶液在波長為510 nm處的吸光值。從圖1中可以看出，標準曲線回歸方程的線性關系良好（R2=0.998 4），可用作待測液中總?cè)祁惢衔锖康挠嬎愎健?/p>

圖1 齊墩果酸對照品標準曲線Fig.1 A standard curve of oleanolic acid as reference substance

1.3.2 樣品測定

取干燥樣品粉末約0.1 g，精密稱定，置于具塞試管中，加入10 mL的無水乙醇提取48 h后，離心除去沉淀，吸取上清液0.2 mL于試管中，80 ℃水浴揮干。然后依照1.3.1中說明的方法測定各樣品的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

分別采用Excel 2007和SPSS 17.0等統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結果與分析

2.1 野鴉椿和圓齒野鴉椿三萜含量差異

野鴉椿和圓齒野鴉椿不同采樣部位的總?cè)祁惢衔锖咳鐖D2所示。由圖2可知，2014年8月從閩清縣下祝鄉(xiāng)1 022 m 高海拔樣地采集的野鴉椿葉片中三萜類化合物的含量為4.48%，比圓齒野鴉椿的高0.6%，其差異達極顯著水平（P＜0.01）；兩者枝條中三萜類化合物的含量，圓齒野鴉椿略高于野鴉椿，其差異并未達到顯著水平（P＞0.05）。

圖2 野鴉椿和圓齒野鴉椿不同采樣部位的總?cè)祁?化合物含量Fig.2 Total riterpenoids contents in different sampling parts of E.japonica and E.konishii

2.2 不同部位總?cè)祁惢衔锏姆植记闆r

采集于不同試驗地的圓齒野鴉椿其不同部位的總?cè)祁惢衔锖咳鐖D3所示。由圖3可知，2014年11月分別從農(nóng)大、清流和邵武采集的圓齒野鴉椿葉片中總?cè)祁惢衔锏暮糠謩e達到9.06%、7.14%與6.85%，均顯著高于其他采樣部位（P＜0.05）。采集于不同月份不同試驗地的圓齒野鴉椿其不同部位的總?cè)祁惢衔锖咳鐖D4所示。由圖4可知，其不同部位的總?cè)祁惢衔锖?，也是葉片＞枝條，說明葉片累積了更多的三萜類物質(zhì)。圓齒野鴉椿各部位的總?cè)祁惢衔锖坑筛叩降鸵来螢椋喝~片＞枝條＞果皮＞種子。

圖3 采集于不同試驗地的圓齒野鴉椿其不同部位的總?cè)祁惢衔锖縁ig.3 Contents of total triterpenoids in different parts of E.konishii collected from different test plots

2.3 不同生長區(qū)域?qū)A齒野鴉椿總?cè)祁惢衔锖康挠绊?/h3>

從圖3中還可看出，2014年11月采集的圓齒野鴉椿各個部位中總?cè)祁惢衔锖康亩嗌倩疽来螢椋恨r(nóng)大＞清流＞邵武。采集于農(nóng)大的圓齒野鴉椿，其葉片的總?cè)坪勘绕渲l的高164.91%；而采集于清流的葉片總?cè)坪勘绕渲l的高106.36%；此兩個數(shù)值之間存在明顯的差別，說明在不同的栽培環(huán)境下三萜類物質(zhì)會在圓齒野鴉椿的某一部位富集。

當進入11月，即圓齒野鴉椿進入果實成熟期而其旺盛生長基本結束時，其葉片中總?cè)频暮烤笥?.85%，而其枝條中三萜的含量均在2.89%以上，但此時野鴉椿已落葉。

2.4 冬季低溫對圓齒野鴉椿總?cè)祁惢衔锖康挠绊?/h3>

從圖4中還可看出，2014年11月和2015年3月采集的圓齒野鴉椿樣品中總?cè)祁惢衔锏暮看嬖陲@著（P＜0.05）或極顯著水平的差異（P＜0.01）。除采集于農(nóng)大的枝條外，不同月份采集于其他3個地區(qū)的枝條和葉片的總?cè)祁惢衔锖浚?月大于11月。三萜類物質(zhì)含量最多的可以提高172.91%，說明冬季低溫更有利于圓齒野鴉椿中三萜類物質(zhì)的產(chǎn)生和積累。

2.5 各試驗地的地理和氣候因素對圓齒野鴉椿總?cè)祁惢衔锖康挠绊?/h3>

各試驗地的地理和氣候因素與圓齒野鴉椿各部位的總?cè)祁惢衔锖块g的相關系數(shù)見表2。表2表明，圓齒野鴉椿葉片中總?cè)祁惢衔锏暮颗c各試驗地的海拔、年均氣溫、年降水量及年均無霜期之間均存在極顯著的相關性（P＜0.01），其果皮中總?cè)祁惢衔锏暮颗c各試驗地的海拔、年均氣溫、年降水量之間均存在極顯著的相關性，其種子中總?cè)祁惢衔锏暮颗c試驗地的海拔、年均氣溫、年降水量之間均存在極顯著的相關性，而其枝條中總?cè)祁惢衔锏暮颗c試驗地的海拔、年均氣溫、年降水量之間的相關性均不顯著，除枝條外，各部位總?cè)祁惢衔锖颗c海拔和年降水量這2個因素之間均表現(xiàn)出極顯著的負相關關系，而其與年均氣溫之間卻表現(xiàn)出極顯著的正相關關系。

表2 不同栽培區(qū)域的地理和氣候因素與各部位中總?cè)祁惢衔锖块g的相關系數(shù)?Table 2 Correlation coefficients of geography and climate factors at different cultivation regions with content of total triterpenoids in each part

3 結論與討論

3.1 結 論

中藥材產(chǎn)地和采收時間均為影響藥材質(zhì)量的重要因素。吳雪松等人[13]的研究結果表明，不同產(chǎn)地的生曬參和紅參藥材中總皂苷和單體皂苷量的差異較大，長白、集安康美、撫松、靖宇4個產(chǎn)地的生曬參和紅參皂苷量的綜合評價值均較高，而有的產(chǎn)地沒有卻達到《中國藥典》中的規(guī)定；錢龍梁等人[14]發(fā)現(xiàn)，不同試驗地其氣候等條件的差異對嫁接銀杏葉片中黃酮類化合物含量存在影響；劉和平等人[15]研究發(fā)現(xiàn)，不同生長期水梔子果實中西紅花苷I、西紅花苷Ⅱ和梔子苷的含量存在顯著差異，每年的11—12月是最佳采果期；張杲等人[16]認為，5—6月是采收連翹葉的最佳時期，因為5月連翹苷含量最高，6月連翹酯苷和蘆丁含量均最高；李曉英等人[17]的研究結果表明，8—9月藍莓葉中總黃酮的含量顯著高于其在5—6月的含量，且9月的總黃酮含量最高，說明此期的抗氧化能力高于其他3個生長時期的；馬力等人[18]認為，油茶籽適宜采摘期為霜降節(jié)前后。采收于不同產(chǎn)地的圓齒野鴉椿其不同部位的總?cè)坪看嬖谳^大差異，如采集于邵武的枝條其總?cè)坪窟_到7.89%，而農(nóng)大的只有2.03%；不同季節(jié)采收的圓齒野鴉椿其總?cè)坪恳泊嬖诓町悾?015年3月采集于3個樣地的圓齒野鴉椿其枝條（農(nóng)大枝條的除外）和葉片的總?cè)祁惢衔锖烤笥?1月采集的，經(jīng)過一個冬季的積累，其三萜含量最多可以提高172.91%。相關分析結果表明，除枝條外，圓齒野鴉椿葉片、果皮和種子中總?cè)祁惢衔锏暮颗c采樣地的海拔和降水量均呈顯著的負相關關系，而與年平均溫度均呈正相關關系。

3.2 討 論

1）本研究存在的局限性。許多研究者[19-22]發(fā)現(xiàn)，隨著海拔高度的升高植物次生代謝產(chǎn)物也隨之增加，但是，本研究結果表明，總?cè)祁惢衔锏暮颗c海拔呈顯著的負相關關系，這是否是因為樣品采自3個不同地區(qū)，除海拔影響外，還受不同地區(qū)的溫度、光照、濕度等因素的影響，對此有待于進一步研究。

野鴉椿和圓齒野鴉椿均作野鴉椿藥材用，但兩者在形態(tài)和生長習性上均存在一定的差異[4]：野鴉椿冬季會落葉，而圓齒野鴉椿屬常綠樹種；野鴉椿8月已處于果實成熟期，其生長由旺盛期向落葉期轉(zhuǎn)變；而圓齒野鴉椿11月才進入果實成熟期，其旺盛生長期才開始結束。雖然野鴉椿葉片中總?cè)祁惢衔锏暮匡@著高于圓齒野鴉椿葉片中的含量，但其于11月已落葉；而11月不同栽培基地上的圓齒野鴉椿其三萜類化合物的含量均大于6.85%，且此時其枝條中三萜類化合物的含量也高于野鴉椿的；就掛果率而言，圓齒野鴉椿遠高于野鴉椿，但其抗寒性卻不如野鴉椿，這就限制了圓齒野鴉椿向高海拔、高緯度地區(qū)的推廣種植。至于野鴉椿和圓齒野椿這些差異是如何形成的，如何增強圓齒野鴉椿的抗寒性，這些問題都值得進一步研究。

2）下一步研究的方向。針對上述問題，一是進行同一地區(qū)不同海拔梯度及相同海拔梯度不同地區(qū)的區(qū)域化栽培試驗，深入探討影響圓齒野鴉椿三萜含量的氣候、環(huán)境因子，為圓齒野鴉椿適生環(huán)境的選擇提供科學依據(jù)；二是開展野鴉椿和圓齒野鴉椿雜交試驗，選育出分布較廣、抗性較強、成熟期早、三萜含量高的抗寒新品種。