葉艮英，梁淑貞，何瑞榮，何淑芬，丁少波

(東莞市人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 東莞 523059)

隨著我國(guó)老齡化進(jìn)程加快，老年人多存在多種疾病共存、用藥復(fù)雜、用藥量大以及藥動(dòng)學(xué)和藥代學(xué)改變，用藥不合理是導(dǎo)致患者治療時(shí)或預(yù)后發(fā)生不良反應(yīng)的主要原因之一[1]。而細(xì)胞色素P450酶系作為肝臟微粒體混合功能酶系統(tǒng)最重要的藥物代謝酶，與多種藥物的代謝失活增效密切聯(lián)系[2]。近年來(lái)本院收治的冠心病患者顯著增加，其中以急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)為主，筆者通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)在給與經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percultaneous coronary interbention，PCI)治療后給予氯吡格雷等雙聯(lián)抗血小板方案用于減少術(shù)后血栓事件的概率，但小部分患者仍出現(xiàn)缺血事件而再次入院，筆者分析認(rèn)為可能原因?yàn)槁冗粮窭椎挚?，其發(fā)生原因與患者代謝相關(guān)酶突變有關(guān)，但各地區(qū)、種族基因突變大有不同[3-4]，文獻(xiàn)中未見(jiàn)有東莞地區(qū)的CYP2C19基因多態(tài)性研究，故筆者通過(guò)研究東莞地區(qū)老年漢族ACS患者CYP2C19基因多態(tài)性研究及對(duì)患者預(yù)后影響，為臨床漢族ACS患者個(gè)體化用藥提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月-2017年1月東莞市人民醫(yī)院收治老年漢族ACS患者578例作為觀察對(duì)象，所有觀察對(duì)象均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)《非ST段抬高型急性冠狀動(dòng)脈綜合征診斷和治療指南》關(guān)于ACS相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡65～85歲；(2)入組前1個(gè)月內(nèi)未使用其他抗血小板、抗凝藥物及PPIs者；(3) 依從性好，可以按計(jì)劃堅(jiān)持服藥、且配合研究定期隨訪者；(4)無(wú)神經(jīng)精神疾病、有能力充分知情理解研究?jī)?nèi)容。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有嚴(yán)重血液系統(tǒng)疾病或有出血傾向；(2)嚴(yán)重感染；(3)有氯吡格雷或阿司匹林禁忌證；(4)嚴(yán)重肝腎功能不全；(5)惡性腫瘤患者；(6)妊娠期、哺乳期婦女。采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)入組患者CYP2C19基因型，并根據(jù)不同的代謝型分組。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.2 CYP2C19基因檢測(cè)方法

1.2.1 主要儀器與試劑 焦磷酸測(cè)序儀Q24 MDx(德國(guó)凱杰公司)；5810R冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；ETC811型PCR儀(蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司)。全血基因組DNA提取試劑盒(長(zhǎng)沙三濟(jì)生物科技有限公司)；激活劑F(Haemoscope公司)；ADP(規(guī)格：2 μmol/L，Haemoscope公司)；AA(規(guī)格：1 μmol/L， Haemoscope公司)。

1.2.2 基因組提取 患者入組當(dāng)日或次日以EDTA采血管采集靜脈血5 mL，24 h內(nèi)送東莞市人民醫(yī)院PCR實(shí)驗(yàn)室，血樣采集后于4 h內(nèi)完成DNA提取[6]。吸取全血250 μL于1.5 mL EP管中，采用全血基因組 DNA 提取試劑盒提取 DNA按照試劑說(shuō)明書(shū)操作[7]。提取結(jié)束后加入預(yù)熱到 65 ℃的洗出液 50 μL 洗脫液或dd H2O洗脫，-20 ℃保存待用。

1.2.3 PCR擴(kuò)增、反應(yīng)分析 用在線NCBI和 PyroMark Assay Design 2.0 軟件共同設(shè)計(jì)用于CYP2C19不同基因型上下游引物，用PrimerSTAT 高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增[8]，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序按照試劑及儀器說(shuō)明使用焦磷酸測(cè)序儀檢測(cè)CYP2C19基因型。

1.2.4 基因型和代謝表型判定CYP2C19*1位于第636位和第681位均為發(fā)生突變則為野生型，CYP2C19*2位于681位堿基G→A，CYP2C19*3位于636位堿基G→A。其中636GG,681GG即*1/*1為廣泛代謝型；636GG,681GA即*1/*2和636GA,681GG即*1/*3為中間代謝型；而636GG，681AA即*2/*2、636GA，681GA即 *2/*3和636AA，681GG 即*3/*3共為弱代謝型。

1.3 隨訪及相關(guān)數(shù)據(jù)收集

收集所有觀察對(duì)象的性別、病史、吸煙史、糖尿病史、高血壓史等一般臨床資料，隨訪期為12個(gè)月，出院后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月及12個(gè)月定期隨訪，隨訪方式有門診復(fù)診、再住院或電話隨訪，收集隨訪期間發(fā)生的心血管不良事件[9]，并根據(jù)患者CYP2C19基因的代謝型不同進(jìn)行分組分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 東莞市老年漢族人群CYP2C19相關(guān)等位基因頻率分布

本研究納入樣品共578例，CYP2C19*1,*2,*3基因頻率分別是62.63%,30.11%和7.27%，其中不同性別中的各等位基因評(píng)率如表1所示，不同性別中，CYP2C19*1,*2,*3基因頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.177，P=0.555)。

2.2 東莞市老年漢族ACS患者CYP2C19相關(guān)基因型及代謝型分布

東莞市老年漢族ACS患者CYP2C19相關(guān)基因型頻率為*1/*1占227例(39.28%)、*1/*2占224例(38.76%)、*1/*3占46例(7.96%)、*2/*2占49例(8.48%)、*2/*3占26例(4.50%)、*3/*3占6例(1.04%)，如表3所示，符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)(χ2=1.484，P=0.953)，本研究所選研究對(duì)象具有群體代表性，處于平衡狀態(tài)，如表2所示。

東莞市老年漢族ACS患者CYP2C19相關(guān)代謝型頻率為廣泛代謝型占227例(39.28%)、中間代謝型占27例(46.72%)、弱代謝型占81例(14.02%)，如表4所示。

2.3 不同CYP2C19等位基因代謝型的ACS患者預(yù)后比較

不同代謝型的ACS患者臨床一般資料比較如表5所示，3組患者性別比例、年齡、冠心病史、糖尿病、高血壓等項(xiàng)目比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3種代謝型ACS患者除血管性死亡例數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，隨訪期間發(fā)生腦梗死、心絞痛復(fù)發(fā)入院、輕度出血、血小板減少、再次靶血管重建等心血管不良事件發(fā)生率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如表6所示。

隨訪期間，共有59例患者發(fā)生臨床終點(diǎn)事件，其中急性腦梗死23例，急性心肌梗死31例，血管性死亡5例；其中廣泛代謝型、中間代謝型和弱代謝型發(fā)生率分別為10.17%(6例)、35.60%(21例)、54.24%(32例)，不同組別間臨床終點(diǎn)事件發(fā)生率比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 46.67 ，P=0.000)。

表1 東莞市老年漢族人群CYP2C19相關(guān)等位基因頻率Table 1 Frequency of CYP2C19 related alleles in the elderly Han population in Dongguan [n(%)]

表2 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)Table 2 Hardy-Weinberg genetic equilibrium test

表3 東莞市老年漢族ACS患者CYP2C19相關(guān)基因型分布Table 3 Distribution of CYP2C19-related genotypes in elderly Han ACS patients in Dongguan [n(%)]

表4 東莞市老年漢族ACS患者CYP2C19相關(guān)代謝型分布Table 4 Distribution of CYP2C19-related metabotypes in elderly Han ACS patients in Dongguan [n(%)]

表5 3種代謝型ACS患者基線資料比較

Table 5 Comparison of baseline data for three metabolic ACS patients

廣泛代謝型(n=227)中間代謝型(n=270)弱代謝型(n=81)P值性別(男/女,n)133/94151/11950/310.993年齡/a( x±s)65.47±11.2364.11±10.8265.07±9.180.362冠心病史/a( x±s)10.23±5.1011.36±4.2911.00±5.720.070糖尿病[n(%)] 46(20.27)71(26.30) 23(28.40)0.641高脂血癥[n(%)] 146(64.32)163(60.37) 50(61.73)0.996高血壓[n(%)] 187(82.38)240(88.89) 73(90.13)0.972吸煙[n(%)] 37(16.30)53(19.63) 14(17.29)0.955

表6 3種代謝型ACS患者隨訪期間心血管不良事件比較

Table 6 Comparison of cardiovascular adverse events during follow-up of three metabolic ACS patients [n(%)]

廣泛代謝型(n=227)中間代謝型(n=270)弱代謝型(n=81)P值腦梗死3(1.33)11(4.07)9(11.11)0.001 3心絞痛復(fù)發(fā)39(17.18)67(24.81)40(49.38)0.000 2輕度出血35(15.42)18(6.67)2(2.47)0.001 2血管性死亡1(0.44)3(1.11)2(2.47)0.308 7血小板減少23(10.14)6(2.23)0(0)0.000 1再次靶血管重建0(0)3(1.11)7(8.64)0.000 0

3 討論

隨著藥物代謝動(dòng)力學(xué)與基因細(xì)胞組學(xué)的高度發(fā)展，研究藥物代謝差異與基因多態(tài)性相關(guān)成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[10]。另一方面心血管疾病已經(jīng)成為威脅我國(guó)老齡人口的重要疾病，ACS是導(dǎo)致患者急性猝死的主要類型[11]。PCI術(shù)聯(lián)合術(shù)后藥物預(yù)防血栓治療是ACS患者常用治療方式，大量研究發(fā)現(xiàn)CYP2C19*1位正常編碼酶活性的等位基因，而*2、*3等位基因的突變可減弱氯吡格雷抑制血小板活性[12]。但CYP2C19酶相關(guān)基因在不同人種中差異明顯，具有基因多樣性[13]，且未見(jiàn)有東莞地區(qū)漢族老年人群CYP2C19基因多態(tài)性的相關(guān)研究，而我院心內(nèi)科收治的患者主要類型為ACS，故針對(duì)ACS患者，采用焦磷酸測(cè)序檢測(cè)患者CYP2C19基因型，為臨床接受氯吡格雷患者的個(gè)體化用藥提供依據(jù)。

本研究中，東莞地區(qū)漢族老年ACS患者 578例中，CYP2C19*1,*2,*3基因頻率分別是62.63%,30.11%和7.27%，CYP2C19相關(guān)基因型頻率為*1/*1占39.28%、*1/*2占38.76%、*1/*3占7.96%、*2/*2占8.48%、*2/*3占4.50%、*3/*3占1.04%，而CYP2C19相關(guān)代謝型頻率為廣泛代謝型占39.28%、中間代謝型占46.72%、弱代謝型占14.02%，主要集中于快代謝型和中間代謝型為主，而肖旋浩等[14]研究的廣州地區(qū)漢族人群CYP2C19基因多態(tài)性結(jié)果顯示主要為中間代謝型，李潔等[15]研究安徽地區(qū)的結(jié)果以及范超等[16]研究的重慶地區(qū)的結(jié)果相似。CYP2C19是細(xì)胞色素P450中重要的亞型之一，在多種藥物體內(nèi)代謝中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C19還可通過(guò)抑制白細(xì)胞活化黏附、抑制血小板功能和減少細(xì)胞黏附因子分泌等影響多種生理活動(dòng)[17]。而CYP2C19的編碼基因位于第10號(hào)染色體上，其中位于外顯子5 上 681位堿基CYP2C19*2和外顯子4上的636位堿基CYP2C19*3突變是影響藥物代謝的重要遺傳因素[18]。當(dāng)CYP2C19*1突變?yōu)镃YP2C19*2時(shí)，產(chǎn)生一個(gè)無(wú)功能蛋白，當(dāng)突變?yōu)镃YP2C19*3時(shí)，產(chǎn)生功能較低的CYP2C19酶，當(dāng)含有1個(gè)或2個(gè)突變基因時(shí)，可導(dǎo)致CYP2C19酶活性較CYP2C19*1*1基因型降低[19]。

氯吡格雷作為臨床常用的血小板抑制劑，臨床上常與阿司匹林聯(lián)用，用于缺血性腦卒中、急性心梗以及PCI術(shù)后置入支架患者術(shù)后血栓復(fù)發(fā)的預(yù)防方案[20]，其主要作用機(jī)制為選擇性抑制二磷酸酰苷與血小板受體結(jié)合，進(jìn)而抑制尤其誘發(fā)的糖蛋白GPIIb/IIIa復(fù)合物的作用，最終達(dá)到抑制血小板抑制的目的[21]。在體外氯吡格雷并無(wú)抗血小板作用，口服吸收后可在CYP2C19的作用下氧化水解成活性代謝物，發(fā)揮藥效[22]。本研究中弱代謝型患者也占14.02%，而在不同CYP2C19等位基因代謝型的ACS患者預(yù)后比較中，3種代謝型ACS患者除血管性死亡例數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，腦梗死、心絞痛復(fù)發(fā)入院、輕度出血、血小板減少、再次靶血管重建等心血管不良事件發(fā)生率比較差異明顯。其中廣泛代謝型患者的輕度出血和血小板減少高于中間代謝型和弱代謝型，說(shuō)明針對(duì)廣泛代謝型患者應(yīng)稍減少藥物用量，以減少該類藥物引起牙齦出血、血小板減少等不良反應(yīng)。而在腦梗死、心絞痛復(fù)發(fā)、再次靶血管重建中，弱代謝型患者發(fā)生率明顯高于廣泛代謝型和中間代謝型，張鵬博等分析發(fā)現(xiàn)攜帶了一個(gè)CYP2C19突變型基因的患者，可出現(xiàn)氯吡格雷活性產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率下降，因此導(dǎo)致用藥后血藥濃度不足，而增加ACS患者預(yù)后由于血小板抑制功能不足，增加不良心血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[23]，且在隨訪期間，共有59例患者發(fā)生臨床終點(diǎn)事件，其中急性腦梗死23例，急性心肌梗死31例，血管性死亡5例；其中廣泛代謝型、中間代謝型和弱代謝型發(fā)生率分別為10.17%、35.60%、54.24%，說(shuō)明由于基因突變導(dǎo)致的不良心血管事件可危及患者生命，因此，研究老年漢族ACS的CYP2C19基因多態(tài)性，并以此指導(dǎo)臨床用藥，盡量避免不合理用藥具有重要意義。

綜上所述，東莞市老年漢族ACS患者中，主要以中間代謝型為主，不同基因亞型的患者預(yù)后有所不同，臨床應(yīng)根據(jù)不同CYP2C19基因型給予患者不同的治療方案，減少患者心血管不良事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。