宋來思，趙海山，吳文富，馮啟榮，譚文

(1.廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究部，廣東 廣州 510080)

血管內(nèi)皮生長因子b(vascular endothelial growth factor b，Vegf-b)是Vegf家族的一員，其氨基酸序列和Vegf-a高度相似[1]，因此，有人認(rèn)為Vegf-b也是促血管生長因子[2-3]。但是，有人卻發(fā)現(xiàn)Vegf-b對血管發(fā)育影響甚小[4]。事實上，與廣泛分布的Vegf-a不同，Vegf-b主要分布在心臟、骨骼肌以及棕色脂肪等能量代謝活性高的組織中[5-6]。近年來，國內(nèi)外研究進展表明Vegf-b與心肌細(xì)胞的存活[1]、線粒體功能[7]和能量代謝[8]有著密切的聯(lián)系。Kivela等[9]證明了Vegf-b通過激活ERK及Akt信號通路提高線粒體功能，增加心臟能力。Lal等[1]認(rèn)為Vegf-b一方面通過調(diào)控Vegf-a間接促進血管生成，另一面直接促進脂肪酸的代謝，保護心臟。這表明Vegf-b可能是內(nèi)皮細(xì)胞與心肌細(xì)胞之間通訊的重要因子，將血管新生與心肌細(xì)胞能量代謝聯(lián)系起來。但上述猜想需要進一步的實驗驗證。但是，Vegf-b對于能量代謝的調(diào)控尚有爭議，有人認(rèn)為Vegf-b使脂肪酸代謝轉(zhuǎn)為糖代謝[10]，而有人卻認(rèn)為Vegf-b提高了脂肪酸的代謝[11]。

綜上所述，Vegf-b對血管發(fā)育及能量代謝的影響尚有爭議，有待進一步的驗證。此外，Vegf-b是保護心臟的潛在靶點，但是具體的保護機制尚未完全清楚。目前也沒有針對Vegf-b靶點的藥物，因此，有必要對Vegf-b的生理功能及保護心臟的作用機制進行深入研究，從而為針對Vegf-b靶點新的治療策略和新藥開發(fā)提供依據(jù)，構(gòu)建Vegf-b敲除動物模型可以為這個方向的研究奠定基礎(chǔ)。

斑馬魚 (zebrafish) 作為脊椎動物整體模型，與常見的爪蟾、小鼠、大鼠等模式動物相比，具有許多明顯的優(yōu)勢[12]，如(1)產(chǎn)卵多，健康的成年母魚1周可以產(chǎn)200～300顆胚胎，給各種轉(zhuǎn)基因品種的培育提供足夠的篩選樣本；(2)胚胎透明，各種器官在顯微鏡下直接可見，配合特異表達熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因魚系，能夠簡單便捷地在基因水平進行編輯，在活體狀態(tài)下觀察其發(fā)育情況等。轉(zhuǎn)基因斑馬魚系Tg[flk：EGFP]使用flk作為啟動子驅(qū)動EGFP，以使表達flk的細(xì)胞表達綠色熒光，特異性的反映血管內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)育情況，應(yīng)用廣泛。如Fernando等用Tg[flk：EGFP]斑馬魚胚胎模型證明了石杉醇提取物(IO)及其組分Ishophloroglucin A(IPA)對高糖誘導(dǎo)的血管生成具有抗血管生成的作用，表明它們在糖尿病相關(guān)血管生成中有潛在的治療作用[13]。

與早期的ZFN,TALENT技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)通過單鏈sgRNA，直接識別DNA序列，并實現(xiàn)高效精確的DNA切割，再利用細(xì)胞的非同源末端重組或同源重組對斷裂的DNA進行修復(fù)，可實現(xiàn)對靶基因的敲除、敲入。CRISPR/Cas9系統(tǒng)整體操作簡單，編輯效率高，應(yīng)用廣泛，大大降低了基因編輯的難度[14]。該技術(shù)以廣泛分布在基因組中的各種序列基因為靶點，因此可以高效的對絕大多數(shù)基因進行敲除，用于各種基因功能研究[15]。

因此，本研究中，將利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除轉(zhuǎn)基因斑馬魚系Tg[flk：EGFP]的Vegf-b基因，以觀察其對心血管發(fā)育的影響。

1 儀器與材料

PV830型皮升注射泵 (美國World Precision Instruments公司)；Stemi 508型體視顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；Axio Observer A1型熒光倒置顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；LBI-175-N型生化培養(yǎng)箱(上海龍躍儀器設(shè)備有限公司)。

Holt buffer配制如下：用量筒量取2 L ddH2O，置于燒杯中，使用磁力攪拌器進行攪拌，依次加入7.000 g NaCl，0.400 g NaHCO3，0.100 g KCl和0.235 g CaCl2，用一次性真空過濾器(孔徑0.22 μmol/L)過濾后常溫儲存?zhèn)溆谩?/p>

實驗動物為轉(zhuǎn)基因斑馬魚系Tg[flk：EGFP]，北京大學(xué)深圳研究生院Lin Lab慷慨贈送，年齡在3～12個月，按照國家斑馬魚資源中心指導(dǎo)建議飼養(yǎng)繁殖。

2 方法

2.1 sgRNA設(shè)計和鑒定引物設(shè)計

根據(jù)斑馬魚的Vegf-b基因序列進行sgRNA設(shè)計。本研究設(shè)計了2個sgRNA(表1)，顯微注射到斑馬魚胚胎，用堿裂法提基因組DNA，PCR擴增后測序評價其有效性。sgRNA 有效性鑒定及基因敲除斑馬魚篩選所需引物設(shè)計見表2。

表1 Vegf-b sgRNA靶位點核苷酸序列Table 1 Vegf-b sgRNA target nucleotide sequences

表2 Vegf-b sgRNA鑒定和篩選引物序列Table 2 Vegf-b sgRNA identification primer sequences

測序檢測sgRNA有效性使用上下游引物雙向測定，其余篩選只用上游引物正向測序。

2.2 斑馬魚胚胎的獲取

在注射前1天下午喂食后1 h，挑選健康的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系Tg[flk：EGFP]雌雄各6條，一雄一雌置于配種缸里，中間用隔板隔開。次日上午9:00抽走隔板，讓雄雌魚自由交配0.5 h，產(chǎn)卵后10 min內(nèi)收集胚胎，挑選200枚健康的胚胎并在單細(xì)胞階段進行顯微注射。注射結(jié)束后，置于培養(yǎng)皿中，加入適量Holt buffer在28.5 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 顯微注射

將25 ng/nL sgRNA和250 ng/nL Cas9 RNA混勻，注射2 nL到斑馬魚胚胎。胚胎置于培養(yǎng)皿中，加適量Holt buffer水在28.5 ℃培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。

2.4 sgRNA有效性的鑒定和轉(zhuǎn)基因斑馬魚篩選

顯微注射后的胚胎F0代在24 hpf(hours post-fertilization)用堿裂法提基因組DNA，PCR擴增后測序評價sgRNA的有效性。讓F0代與同品系的野生型斑馬魚雜交，胚胎測序篩選出穩(wěn)定遺傳的founder。讓founder與同品系的野生型雜交得到F1代，待F1代成年后用堿裂法測序鑒定篩選出敲除的雜合子斑馬魚Vegf-b+/-，通過基因克隆測序鑒定雜合子F1代的基因型。讓F1代雜合子與同品系的野生型雜交得到F2代，同樣的方法測序鑒定篩選出基因型相同的F2代雜合子，再讓其自交獲得F3代，待F3代成年后用同樣的方法測序鑒定，最終篩選出敲除的純合子斑馬魚Vegf-b-/-(圖1)。

2.5 基因克隆測序

用pEASY?-T1 Simple Cloning Kit(Transgen，CT111)進行克隆，常溫將4 μL目的基因PCR產(chǎn)物和1 μL pEASY?-T1 Simple Cloning Vector混勻，置于冰上5 min，反應(yīng)結(jié)束后進行轉(zhuǎn)化：往連接產(chǎn)物中加入50 μL Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，輕彈混勻，置于冰上30 min。42 ℃水浴熱激30 s，立即置于冰上2 min。加200 μL SOC，放置在搖床上，轉(zhuǎn)速200 r/min，37 ℃培養(yǎng)1 h。同時，取16 μL濃度為500 mmol/L的IPTG和40 μL濃度為20 mg/mL X-gal混勻，均勻涂在Amp+平板上，37 ℃培養(yǎng)箱中放置1 h。待IPTG和X-gal被吸收后，取100 μL菌液均勻涂在平板上，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日，挑選8個單克隆PCR后送測序。

圖1 基因敲除斑馬魚模型的構(gòu)建過程

Figure 1 Process of construction of gene knockout zebrafish model

2.6 斑馬魚胚胎心血管發(fā)育評價

為評價敲除Vegf-b對斑馬魚心血管發(fā)育的影響，將同品系的野生型(control組)和敲除Vegf-b(Vegf-b組)的F3代雜合子分別自交，收集胚胎。在24 hpf (受精后小時數(shù))用24孔板進行鋪板，每孔20枚胚胎和1 mL Holt buffer水，每組重復(fù)3孔。在96 hpf(受精后小時數(shù))，觀察胚胎的發(fā)育情況。在凹面載玻片上滴加1滴4%甲基纖維素，用于固定胚胎。將胚胎固定在固定液上，在體視顯微鏡下調(diào)整好胚胎的位置，使兩眼重合，身體保持平直，用熒光倒置顯微鏡EGFP通道觀察血管并拍照，明場通道觀察心臟并拍照。實驗重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

測序峰圖用Seqscanner進行分析，序列用SerialCloner進行比對，斑馬魚圖片用Photoshop進行裁剪。

3 結(jié)果

3.1 sgRNA有效性的檢測

測序結(jié)果顯示，sgRNA1(圖2 A)出現(xiàn)明顯的套峰，且重疊峰出現(xiàn)在Vegf-b靶位點(黑色線框所標(biāo)注的序列)酶切位點附近，而sgRNA2為單峰(圖2 B)，確定sgRNA1誘導(dǎo)突變有效，因此，本研究使用sgRNA1進行下一步的實驗。

A. sgRNA1； B. sgRNA2。
圖2 sgRNA有效性檢測結(jié)果
Figure 2 sgRNA validity test results

3.2 Vegf-b敲除斑馬魚的構(gòu)建及篩選

F0代嵌合體成年后與同品系的野生型雜交，胚胎通過堿裂法測序，不能穩(wěn)定遺傳的F0代只有單峰，可以穩(wěn)定遺傳的有明顯套峰，稱之為founder(圖3 A)。讓founder與野生型雜交獲得F1代，待F1代成年后用堿裂法測序，沒有基因突變的野生型只有單峰，有基因突變的斑馬魚雜合子Vegf-b+/-有明顯套峰(圖3 B)。對F1代敲除雜合子進行基因克隆測序，發(fā)現(xiàn)其基因序列缺失TC 2 bp堿基(圖3 C)。讓缺失TC 2 bp 的F1代雜合子和野生型雜交獲得F2代，待F2代成年后用相同方法篩選出基因型相同的F2代敲除雜合子，野生型只有單峰，F(xiàn)2代敲除雜合子有明顯套峰(圖3 D)。讓F2代敲除雜合子Vegf-b+/-自交，相同的方法進行篩選，發(fā)現(xiàn)雜合子Vegf-b+/-有明顯套峰，沒有基因突變的野生型或者有基因突變的純合子Vegf-b-/-(圖3 E)只有單峰，進一步通過序列比對發(fā)現(xiàn)，野生型堿基沒有缺失，純合子Vegf-b-/-缺失TC 2 bp堿基(圖3 F)。最終獲得可穩(wěn)定遺傳的Vegf-b敲除的斑馬魚系。

A. F0代野生型和founder； B. F1代野生型和F1代雜合子； C. F1代雜合子序列； D. F2代野生型和F2代雜合子； E. F3代雜合子、F3代野生型和 F3代純合子； F. F3代野生型序列和 F3代純合子序列。

圖3Vegf-b敲除斑馬魚系鑒定結(jié)果

Figure 3 Identification outcome ofVegf-bknockout zebrafish line

3.3 斑馬魚胚胎心血管發(fā)育評價

control組所有胚胎血管發(fā)育正常，可觀察到發(fā)育完整的血管結(jié)構(gòu)。體節(jié)間血管(intersegmental blood vessels，ISVs)從背部主動脈側(cè)(dorsal aorta，DA)延伸到縱向背側(cè)吻合血管(dorsal longitudinal anastomotic vessels，DLAVS)。心臟呈S型，側(cè)面觀察心臟心室和心房部分重疊，心血管系統(tǒng)無形態(tài)學(xué)改變(圖4 A)。Vegf-b組部分胚胎血管發(fā)育受損，表現(xiàn)為體節(jié)間血管變細(xì)，內(nèi)皮細(xì)胞受損(紅色箭頭)，嚴(yán)重者體節(jié)間血管發(fā)育不全，表現(xiàn)為體節(jié)間血管未從背部主動脈側(cè)(DA)延伸到縱向背側(cè)(DLAVS)吻合血管(黃色箭頭)。心臟出現(xiàn)明顯的心包膜水腫(紅色箭頭)，卵黃囊腫大(藍(lán)色箭頭)，心臟畸形且線性化，心室變小，體節(jié)間血管血流緩慢或者無血液循環(huán)等多種形態(tài)改變(圖4 B)。

A. control組； B.Vegf-b組。

圖4 敲除Vegf-b對心血管發(fā)育的影響

Figure 4 Effect of knockoutVegf-bon embryonic vascular development

4 討論

Vegf-b是Vegf家族的一員，但不同于Vegf-a是公認(rèn)的促血管生長因子，它對血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響尚未明晰。有人認(rèn)為Vegf-b促進血管新生[16]，尤其是冠狀動脈血管的發(fā)育。Kupatt等發(fā)現(xiàn)過表達Vegf-b使心肌缺血或心梗的小鼠心臟毛細(xì)血管的密度增加[17]。有人卻認(rèn)為，Vegf-b對血管發(fā)育的影響甚小或者抑制血管，Mould等發(fā)現(xiàn)敲除Vegf-b的小鼠，炎癥相關(guān)滑膜血管生成減少[18]。

轉(zhuǎn)基因斑馬魚系Tg[flk：EGFP]內(nèi)皮細(xì)胞特異性的表達綠色熒光，反映血管內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)育情況，能夠在活體狀態(tài)下直接觀察Vegf-b對血管發(fā)育的影響。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是在原核生物CRISPR/Cas9技術(shù)基礎(chǔ)上進行改造，從而應(yīng)用于真核生物的一種基因編輯技術(shù)。與傳統(tǒng)的TALEN和ZFN技術(shù)對比，CRISPR/Cas9具有許多優(yōu)勢。TALEN和ZFN都是蛋白質(zhì)引導(dǎo)的DNA切割，但蛋白質(zhì)合成、選擇和驗證過程復(fù)雜且耗時。CRISPR/Cas9是由sgRNA引導(dǎo)，短且方便設(shè)計，成本低且易于生產(chǎn)[19]。CRISPR/Cas9可在多個獨立位點進行基因修飾[20]。目前只有morpholinos敲降Vegf-b的斑馬魚模型，認(rèn)為Vegf-b對斑馬魚的視網(wǎng)膜血管發(fā)育有影響，但未發(fā)現(xiàn)其對體節(jié)間血管的發(fā)育有損傷[21]。

本研究針對Vegf-b3號外顯子設(shè)計了2個sgRNA，證明了sgRNA1效率高，通過三代篩選得到缺失TC 2bp穩(wěn)定遺傳系，成功建立Vegf-b移碼突變的敲除斑馬魚系。進一步研究發(fā)現(xiàn)，敲除Vegf-b會導(dǎo)致胚胎血管發(fā)育受損，表現(xiàn)為體節(jié)間血管變細(xì)，嚴(yán)重者發(fā)育不全，證明了Vegf-b對血管發(fā)育有重要作用。同時，這也說明了基因敲除技術(shù)和morpholinos敲降技術(shù)有不同表型，前者可以構(gòu)建出穩(wěn)定遺傳的基因編輯斑馬魚品系，是后續(xù)研究Vegf-b功能的重要模型。

此外，本研究還意外發(fā)現(xiàn)敲除Vegf-b會導(dǎo)致心臟出現(xiàn)心包膜水腫，這表明Vegf-b可能對心臟的發(fā)育及功能有重要影響。有研究也發(fā)現(xiàn)缺失Vegf-b的小鼠心臟小于正常小鼠心臟，其心臟功能的恢復(fù)能力也弱于正常鼠[22]。這提示Vegf-b的功能不僅僅局限于血管方面，同時與心臟發(fā)育及功能有重要的關(guān)系。Mehlem等認(rèn)為Vegf-b可能通過PGC-1α/ERR-α通路調(diào)控脂肪酸，影響線粒體能量代謝，從而保護心臟[23]。穩(wěn)定遺傳的Vegf-b敲除斑馬魚系將成為研究Vegf-b功能和分子機制的重要工具。

綜上所述，本研究使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除轉(zhuǎn)基因斑馬魚系Tg[flk：EGFP]的Vegf-b基因，成功構(gòu)建Vegf-b敲除的Tg[flk：EGFP]斑馬魚系，本研究發(fā)現(xiàn)敲除Vegf-b導(dǎo)致胚胎血管發(fā)育受損以及心臟心包膜水腫，表明Vegf-b對心血管發(fā)育具有重要作用，為未來深入研究Vegf-b功能提供穩(wěn)定可靠的動物模型。