沈秉正，李雪珂，楊海峰，喻研

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430060； 2.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院病毒學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430072； 3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢 430060)

經(jīng)過(guò)數(shù)千年的進(jìn)化，抗微生物多肽(Antimicrobial peptides，AMPs)已成為許多生物先天免疫系統(tǒng)的重要成分。由于廣泛的活性，使得AMPs成為抗病原微生物最有希望的候選藥物之一。AMPs可通過(guò)膜裂解、非裂解方式和/或細(xì)胞內(nèi)的機(jī)制進(jìn)行獨(dú)立或協(xié)同作用而引起微生物的死亡。AMPs又被稱作宿主防御肽，在所有生命形式中幾乎均可以找到。從細(xì)菌到植物、無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物等所有生物均可產(chǎn)生AMP。

截止至2019年4月，抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)(The Antimicrobial Peptide Database，APD； http://aps.unmc.edu/AP/)收錄了7大來(lái)源的3 065種抗菌肽[1]，其中1 085種來(lái)自兩棲動(dòng)物，533種來(lái)自節(jié)肢動(dòng)物，288種來(lái)自哺乳動(dòng)物，131種人類宿主防御肽，126種來(lái)自魚類，43來(lái)自軟體動(dòng)物，42種來(lái)自鳥類，40種爬行動(dòng)物，17種來(lái)自真菌，6種來(lái)自原生動(dòng)物以及包括人工合成/改造等其他來(lái)源的AMPs。

近幾年，隨著三代測(cè)序技術(shù)的普及以及四代測(cè)序技術(shù)的逐漸完善，對(duì)真菌基因組、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序也逐漸增多，目前已發(fā)現(xiàn)17種真菌來(lái)源的AMPs，這些多肽序列、結(jié)構(gòu)各異，生物活性亦有不同。本文從上述17種多肽的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、抗微生物活性等方面對(duì)真菌來(lái)源的抗微生物多肽進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié)，以期能為其進(jìn)一步作為藥品開發(fā)提供參考。

1 真菌來(lái)源的抗微生物肽的分類

由于真菌來(lái)源的抗微生物肽是一類獨(dú)特且多樣的分子，因此對(duì)其進(jìn)行分類顯得非常重要。目前，對(duì)于AMPs的分類方式主要是基于多肽序列、空間結(jié)構(gòu)、生物活性或作用機(jī)制。由于多肽的活性取決于氨基酸殘基的序列和結(jié)構(gòu)，本文亦基于該特征將來(lái)源于真菌的AMPs分為線性多肽和含有分子內(nèi)二硫鍵的多肽兩個(gè)大類，見表1所示。

表1 真菌來(lái)源的抗微生物多肽Table 1 Fungal-derived antimicrobial peptides

注：括號(hào)內(nèi)為多肽在抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)(http://aps.unmc.edu/AP)中多肽的編號(hào)。

2 真菌來(lái)源的線性抗微生物肽

2.1 來(lái)源于毛頭鬼傘的Y3多肽

吳麗萍等[2]利用離子交換層析技術(shù)和凝膠層析法從毛頭鬼傘(C.comatus)中分離提取到了抗植物病毒多肽Y3，其為含有糖基的多肽，在菌絲體和子實(shí)體中均能通過(guò)Western雜交方法檢測(cè)到。當(dāng)Y3質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL時(shí)，其對(duì)煙草花葉病毒侵染心葉煙的抑制率約為50%，亦可抑制宿主Nicotianatabacumvar. K326中該病毒的復(fù)制。

2.2 來(lái)源于白腐真菌杏鮑菇的Eryngin多肽

Wang等[3]從可食用的白腐真菌杏鮑菇(P.eryngii)的子實(shí)體中分離出相對(duì)分子質(zhì)量為10 000的抗真菌肽，命名為Eryngin，其N末端序列與來(lái)自蘑菇Lyophyllumshimeiji的抗真菌蛋白有一些相似性。該多肽能抑制尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和花生球腔菌(Mycosphaerellaarachidicola)中的菌絲體生長(zhǎng)，MIC值分別為1.35、3.5 μmol/L。

2.3 來(lái)源于綠色木霉菌的U-22324多肽

Meyer等[4]從綠色木霉菌(T.viride)的1 600 mL發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)并分離得到了抗菌肽U-22343，在酸性環(huán)境(pH=4.6)中沉淀活性物質(zhì)，用質(zhì)量濃度1%硅藻土收集沉淀物，用400 mL丙酮萃取，30 ℃濃縮除去丙酮，有機(jī)相置于4 ℃冰箱中結(jié)晶。將約2.7 g粗品于室溫溶解于最小量的無(wú)水乙醇，用活性炭吸附雜質(zhì)，濃縮至約25 mL，加入等體積乙醚，結(jié)晶，得產(chǎn)物約1.7 g，其對(duì)細(xì)菌具有較強(qiáng)的抑制活性，抑制S.aureusUC-76、S.aureusUC-76、S.faecalisATCC-6057、S.hemolyticusC-203、S.viridansUC-155的MIC值分別為62.5、125、31、31、31 μg/mL。對(duì)真菌的抑制作用相對(duì)較弱，抑制B.dermatitidis、N.asteroides、C.immitis、H.compactum、H.capsulatum和T.mentagrophytesUC-4860的MIC值分別為100、1 000、1 000、1 000、1 000、1 000 μg/mL。

3 真菌來(lái)源的含分子內(nèi)二硫鍵的抗微生物肽

3.1 來(lái)源于巨大曲霉菌的抗微生物肽

Wnendt等[5]從巨大曲霉(A.giganteus)中發(fā)現(xiàn)了5 800的多肽，可抑制真菌生長(zhǎng)。首先克隆編碼該抗真菌多肽的cDNA，構(gòu)建了cDNA表達(dá)文庫(kù)，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)該抗真菌多肽的cDNA序列由183個(gè)核苷酸組成，全長(zhǎng)多肽含有60個(gè)氨基酸殘基。N-末端存在9個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列，可能與多肽分泌到細(xì)胞外有關(guān)。而發(fā)揮抗真菌功能的成熟肽由51個(gè)氨基酸殘基組成，并通過(guò)NMR技術(shù)解析了其空間結(jié)構(gòu)(圖1)。

圖1 來(lái)源于巨大曲霉菌的抗微生物多肽空間結(jié)構(gòu)(PDB: 1AFP)

Figure 1 Structure of antimicrobial peptide derived fromA.giganteus(PDB: 1AFP)

3.2 來(lái)源于腐生子囊菌的抗微生物肽Plectasin

Mygind等[6]在2005年首次從北歐松樹林中的腐生子囊菌(P.nigrella)中分離出真菌防御素類抗菌肽，命名為Plectasin，對(duì)革蘭陽(yáng)性細(xì)菌有較好的抑菌活性，特別是對(duì)肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌的抗菌效果顯著，對(duì)一些常規(guī)抗生素耐藥的菌株亦有作用。Plectasin在體外顯示出較快的殺菌速度，與臨床使用的萬(wàn)古霉素和青霉素相當(dāng)，且不易產(chǎn)生耐藥性，因此與臨床使用的傳統(tǒng)抗生素之間不具有交叉耐藥性。更值得關(guān)注的是該多肽對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞沒有毒害作用，且容易透過(guò)血腦屏障，在腦脊液中的滲透能力可達(dá)到30%以上，顯著高于其他常規(guī)抗生素。因此，Plectasin具有進(jìn)一步開發(fā)成為新型的抗菌藥物的潛力，用于治療包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)菌感染在內(nèi)的感染性疾病，其空間結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 來(lái)源于腐生子囊菌抗微生物多肽Plectasin的空間結(jié)構(gòu)(PDB: 1ZFU)

Figure 2 Structure of antimicrobial peptide Plectasin derived fromP.nigrella(PDB: 1ZFU)

3.3 來(lái)源于棒曲霉菌的抗微生物肽AcAMP

Hajji等[7]從棒曲霉(A.clavatusES1)的發(fā)酵液中分離到了大小約為6 000的抗微生物肽，命名為AcAMP。通過(guò)分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)發(fā)現(xiàn)該基因由285個(gè)核苷酸編碼。全長(zhǎng)肽由94個(gè)氨基酸殘基組成，從N端到C端分別為信號(hào)肽(1-21位氨基酸殘基)、前肽(22-43位氨基酸殘基)和成熟肽(44～94位氨基酸殘基)，為具有抗微生物活性的富含半胱氨酸的堿性多肽。AcAMP在50～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍抑制真菌(A.niger、F.solani、F.oxysporum)的抑菌圈直徑在7～15 mm之間。除了抗真菌活性外，AcAMP是第一個(gè)來(lái)源于真菌的對(duì)革蘭陽(yáng)性和革蘭陰性細(xì)菌均具有抗菌活性的多肽，其抑制細(xì)菌S.aureus、B.cereus、M.luteus、E.faecalis、E.coli及P.aeruginosa的MIC值均在10～50 μg/mL范圍內(nèi)。

3.4 來(lái)源于產(chǎn)黃青霉的抗微生物肽PAF

Kaiserer等[8]從絲狀真菌產(chǎn)黃青霉(P.chrysogenum)培養(yǎng)基上清中分離得到了富含半胱氨酸的堿性多肽Penicilliumantifungalprotein(PAF)。該抗微生物多肽可抑制多種絲狀真菌的生長(zhǎng)，包括人類條件致病真菌和植物致病真菌，但不抑制細(xì)菌和酵母的生長(zhǎng)。PAF在50 μg/mL濃度下對(duì)A.fumigatus、A.nidulans、A.niger、B.cinerea和T.koningii的抑制率>90%；對(duì)A.giganteus、C.carbonum和N.crassa的抑制率在70%～90%之間；對(duì)A.flavus、F.oxysporum、G.roseum和P.chrysogenum的抑制率在30%～70%之間。同時(shí)PAF亦具有較強(qiáng)的鹽穩(wěn)定性，其空間建構(gòu)見圖3。

圖3 來(lái)源于產(chǎn)黃青霉的抗微生物多肽PAF的空間結(jié)構(gòu)(PDB: 2KCN)

Figure 3 Structure of antimicrobial peptide PAF derived fromP.chrysogenum(PDB: 2KCN)

3.5 來(lái)源于產(chǎn)黃青霉的抗微生物肽PgAFP

Rodríguez-Martín等[9]從產(chǎn)黃青霉RP42C(P.chrysogenum)菌株中發(fā)現(xiàn)了抗微生物多肽，命名為PgAFP，其能顯著抑制產(chǎn)毒霉菌的生長(zhǎng)。經(jīng)電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)測(cè)定，該多肽的分子量為6494 D，理論等電點(diǎn)為9.22，為陽(yáng)離子多肽。PgAFP多肽的基因由404核苷酸編碼，含有兩個(gè)內(nèi)含子(分別為63和62)，cDNA序列由279核苷酸編碼。PgAFP多肽前體由92個(gè)氨基酸殘基組成，經(jīng)剪切被加工成含有58個(gè)氨基酸殘基的成熟肽。其屬于由子囊菌綱產(chǎn)生的具有抗真菌活性的富含半胱氨酸的多肽。由于P.chrysogenum被認(rèn)為是食品中常見的安全霉菌，因此PgAFP可能可以用于防止食品和農(nóng)產(chǎn)品中產(chǎn)毒霉菌的生長(zhǎng)。通過(guò)NMR技術(shù)解析PgAFP的空間三維結(jié)構(gòu)見圖4。

圖4 來(lái)源于產(chǎn)黃青霉菌的抗微生物多肽PgAFP的空間結(jié)構(gòu)(PDB: 2NC2)

Figure 4 Structure of antimicrobial peptide PgAFP derived fromP.chrysogenum(PDB: 2NC2)

3.6 來(lái)源于黑曲霉的抗微生物肽Anafp

Gun等[10]從絲狀真菌黑曲霉(A.niger)的培養(yǎng)物上清液中分離出了抗真菌肽并將其命名為Anafp。該肽由58個(gè)氨基酸殘基組成，其中包括6個(gè)半胱氨酸殘基。Anafp抑制絲狀真菌(A.flavus、A.fumigatus、F.oxysporum、F.solani、T.beigelii)的MIC值在4～15 μmol/L濃度范圍內(nèi)；抑制酵母類真菌的MIC值在8～15 μmol/L濃度范圍內(nèi)。而對(duì)細(xì)菌的抑制作用較弱，在濃度為50 μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)菌E.coli和B.subtilis均無(wú)抑制作用。

3.7 來(lái)源于阿姆斯特丹散囊菌的抗微生物肽Eurocin

Oeemig等[11]從阿姆斯特丹散囊菌(E.amstelodami)中發(fā)現(xiàn)了具有抗微生物活性的真菌防御素多肽，命名為Eurocin。該多肽由90個(gè)氨基酸殘基組成，包括信號(hào)肽(1～20位氨基酸殘基)、前肽(21～48位氨基酸殘基)和成熟肽(49～90位氨基酸殘基)。成熟肽由42個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為4 300，且多肽序列中富含甘氨酸(24%)和半胱氨酸(14%)殘基，所含的6個(gè)半胱氨酸殘基，可形成分子內(nèi)三對(duì)二硫鍵，結(jié)構(gòu)見圖5。

圖5 來(lái)源于阿姆斯特丹散囊菌的抗微生物多肽Eurocin的空間結(jié)構(gòu)(PDB: 2LT8)

Figure 5 Structure of antimicrobial peptide Eurocin derived fromP.chrysogenum(PDB: 2LT8)

對(duì)183種細(xì)菌菌株測(cè)試了Eurocin的抗微生物活性，對(duì)于人類重要的革蘭陽(yáng)性病原菌參考菌株的MIC值分別為：金黃色葡萄球菌(ATCC29213)，16 μg/mL；表皮葡萄球菌(ATCC12228)，16 μg/mL；屎腸球菌(ATCC49624)，16 μg/mL；糞腸球菌(ATCC29212)，2 μg/mL；肺炎鏈球菌(ATCC49619)，0.25 μg/mL；但在所測(cè)試的革蘭陰性菌中沒有觀察到明顯的抗菌活性(MIC≥32 μg/mL)。

3.8 來(lái)源于犬小孢子菌的抗微生物肽Micasin

Zhu等[12]從犬小孢子菌(M.canis)中克隆到了真菌防御素樣肽(fungal defensin-like peptide，fDLP)Micasin的基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析確定了其成熟肽由38個(gè)氨基酸殘基組成。通過(guò)以化學(xué)合成的線性多肽為原料，成功的制備了分子內(nèi)二硫鍵定向配對(duì)的具有活性御素樣肽Micasin，并利用NMR解析了空間結(jié)構(gòu)(圖6)，其具有典型的半胱氨酸穩(wěn)定的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)(CS/αβ)。

圖6 來(lái)源于犬小孢子菌的抗微生物多肽Micasin的空間結(jié)構(gòu)(PDB:2LR5)

Figure 6 Structure of antimicrobial peptide Micasin derived fromM.canis(PDB: 2LR5)

Micasin對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌均有活性，重要的是它能以微摩爾濃度殺死2株臨床分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和機(jī)會(huì)致病菌銅綠假單胞菌。以非破膜的機(jī)制在3 h內(nèi)殺死幾乎全部被處理過(guò)的細(xì)菌，同時(shí)顯示出極低的溶血活性和高血清穩(wěn)定性。

3.9 來(lái)源于海洋真菌費(fèi)希新薩托菌的抗微生物肽NFAP

Kovács等[13]從費(fèi)希新薩托菌(N.fischeri)培養(yǎng)物上清液中發(fā)現(xiàn)了相對(duì)分子質(zhì)量約為6 600的抗微生物多肽NFAP及其編碼基因，其成熟肽為由57個(gè)氨基酸殘基組成的富含半胱氨酸的堿性蛋白。利用分子模擬所構(gòu)建的該多肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)表明具有由3個(gè)二硫鍵穩(wěn)定的5個(gè)反平行片的防御素樣分子相似空間結(jié)構(gòu)。NFAP以劑量依賴性方式表現(xiàn)出對(duì)絲狀真菌的生長(zhǎng)抑制作用，并且在寬pH和溫度范圍內(nèi)保持較高的抗真菌活性。此外，它還表現(xiàn)出對(duì)蛋白水解酶的抗性。所有這些特征使NFAP成為可進(jìn)一步進(jìn)行體外和體內(nèi)研究的候選藥物，旨在開發(fā)成為新的抗真菌活性物質(zhì)。

3.10 來(lái)源于灰蓋鬼傘菌的抗微生物肽Copsin

Essig等[14]從白腐菌灰蓋鬼傘菌(C.cinerea)中發(fā)現(xiàn)了含有6對(duì)分子內(nèi)二硫鍵的抗微生物多肽Copsin，其成熟肽由57個(gè)氨基酸殘基組成，通過(guò)NMR所解析了該多肽的空間結(jié)構(gòu)(圖7)，其分子內(nèi)二硫鍵的配對(duì)方式為Cys18-Cys48、Cys22-Cys50、Cys10-Cys40、Cys3-Cys32、Cys25-Cys57和Cys35-Cys54。Copsin對(duì)多種革蘭陽(yáng)性細(xì)菌具有殺菌作用，包括人類病原菌如屎腸球菌(E.faecium)和單核增生性李斯特菌(L.monocytogenes)?？咕鷻C(jī)制研究表明，Copsin可以與肽聚糖前體脂質(zhì)II五肽特異性結(jié)合，從而干擾細(xì)胞壁的生物合成，該多肽的空間結(jié)構(gòu)見圖7。

圖7 來(lái)源于灰蓋鬼傘菌的抗微生物多肽Copsin的空間結(jié)構(gòu)(PDB:2MN5)

Figure 7 Structure of antimicrobial peptide Copsin derived fromC.cinerea(PDB: 2MN5)

3.11 來(lái)源于費(fèi)希新薩托菌的抗微生物肽NFAP2

Tóth等[15]從費(fèi)希新薩托菌(N.fischeri)中發(fā)現(xiàn)了第2個(gè)富含半胱氨酸的陽(yáng)離子抗真菌多肽NFAP2(第2個(gè)多肽為NFAP[13])?；诋a(chǎn)黃青霉(P.chrysogenum)表達(dá)系統(tǒng)來(lái)批量獲得重組NFAP2多肽，同時(shí)應(yīng)用多肽固相合成、天然化學(xué)連接以及分子內(nèi)二硫鍵定向配對(duì)同樣制備了完整的NFAP2。重組和合成NFAP2的平均產(chǎn)量分別比天然生產(chǎn)者約分別高40和16倍。兩種方式制備的多肽都經(jīng)過(guò)正確加工、折疊，并具有熱穩(wěn)定性。它們顯示出與天然NFAP2相同的最小抑制濃度，MIC值分別為：C.albicansATCC10231，6.25 μg/mL；C.glabrataCBS138，1.56 μg/mL；C.guilliermondiiCBS566，1.56 μg/mL；C.kruseiCBS573，12.5 μg/mL；C.lusitaniaeCBS6936，3.125 μg/mL；C.parapsilosisCBS604，1.56 μg/mL；C.tropicalisCBS94，1.56 μg/mL；S.cerevisiaeSZMC0644，3.125 μg/mL；S.pombeSZMC0142，1.56 μg/mL。

3.12 來(lái)源于指間毛癬菌的抗微生物肽Triintsin

Shen等[16]分離自臨床樣本的病原真菌指間毛癬菌(T.interdigitale)中克隆了防御素類抗微生物肽Triintsin的基因，通過(guò)基因序列與cDNA序列的比對(duì)確定了該基因組織結(jié)構(gòu)，即由2個(gè)內(nèi)含子分隔的3個(gè)編碼外顯子組成。Triintsin的前體肽含有85個(gè)氨基酸殘基，包括21個(gè)殘基的N-末端信號(hào)肽，26個(gè)殘基的前肽和38個(gè)氨基酸殘基的成熟肽。通過(guò)同源建模建立的3D結(jié)構(gòu)，Triintsin呈現(xiàn)典型的半胱氨酸穩(wěn)定的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)(圖8)。該肽顯示出對(duì)革蘭陽(yáng)性和革蘭陰性細(xì)菌廣譜的抗菌活性，同時(shí)也顯示出一定的抗真菌活性，對(duì)臨床分離的病原菌亦有顯著作用。

圖8 來(lái)源于指間毛癬菌的抗微生物多肽Triintsin的空間結(jié)構(gòu)

Figure 8 Structure of antimicrobial peptide Triintsin derived fromT.interdigitale

3.13 來(lái)源于禾谷鐮孢菌的抗微生物肽FgAFP

3.14 來(lái)源于皮炎芽生菌的抗微生物肽Bldesin

Luo等[18]通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了皮炎芽生菌(B.dermatitidis)中存在真菌防御素樣抗微生物多肽，并通過(guò)生物工程技術(shù)進(jìn)行了原核表達(dá)并成功制備了重組多肽Bldesin?？咕鷮?shí)驗(yàn)測(cè)定Bldesin對(duì)革蘭陽(yáng)性菌(如金黃色葡萄球菌)具有良好的抑菌活性，而對(duì)革蘭陰性菌如大腸桿菌等沒有作用。電生理實(shí)驗(yàn)表明，Bldesin具有Kv1.3通道抑制活性，1 μmol/L濃度的多肽能抑制約40%的Kv1.3通道電流。絲氨酸蛋白酶抑制相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，Bldesin同時(shí)具有獨(dú)特的胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和絲氨酸蛋白酶抑制活性。

4 小結(jié)與展望

因微生物感染死亡，特別是那些由耐藥微生物引起的死亡，已經(jīng)成為一個(gè)全球性問(wèn)題，估計(jì)到2050年每年將導(dǎo)致1 000萬(wàn)人死于微生物感染[19]。真菌在地球上存在了多長(zhǎng)時(shí)間至今還不清楚，對(duì)真菌的起源也沒有確切的結(jié)論。真菌的有些特點(diǎn)和植物相似，然而在某些方面又和動(dòng)物有相似之處。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，真菌進(jìn)化出了獨(dú)特的抗微生物系統(tǒng)，已經(jīng)從真菌次生代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了包括青霉素在內(nèi)的一系列抗生素[20]。除了小分子抗生素外，真菌亦可分泌表達(dá)抗微生物多肽，本文對(duì)目前發(fā)現(xiàn)的來(lái)源于真菌的抗微生物多肽進(jìn)行了系統(tǒng)的總結(jié)，這類多肽具有廣泛的抗微生物活性(抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒)和結(jié)構(gòu)多樣性(線性多條、含分子內(nèi)二硫鍵的多肽)。希望通過(guò)進(jìn)一步的研究能從中發(fā)現(xiàn)具有作為候選藥物潛在價(jià)值的多肽分子。