馬琪琪 鐘肖 馮佩 胡宗偉 王香萍 張建民

摘 要：從四川劍閣、湖北天門、湖南吉首等地采集了100份土樣，通過高溫法進行蘇云金芽孢桿菌的分離純化，采用PCR法對菌株的殺蟲基因進行鑒定，以期篩選對蚊科幼蟲有殺蟲活力的蘇云金芽孢桿菌菌株，并以蚊科幼蟲孑孓為材料對篩選菌株的殺蟲活性進行了鑒定。 結果表明：100份土樣中共篩選到20個蘇云金芽孢桿菌菌株，其中7個菌株含有以蚊科幼蟲為靶標的殺蟲基因;其中S4-2菌株的殺蟲活性最高，在伴孢晶體濃度為2.00 mg/mL時，校正死亡率為96.67%。

關鍵詞：蘇云金芽孢桿菌;蚊科幼蟲;菌株鑒定;基因型;殺蟲活性

中圖分類號：S476+9 文獻標識碼：A文章編號：1006-060X（2020）02-0049-04

Abstract： One hundred soil samples were collected from Jiange of Sichuan Province， Tianmen of Hubei Province and Jishou of Hunan Province. Bacillus thuringiensis was isolated and purified by high temperature method. The insecticidal gene of Bacillus thuringiensis was identified by PCR method in order to screen Bacillus thuringiensis strains with insecticidal activity to mosquito larvae， and the insecticidal activity of the screened strains was evaluated by using mosquito larvae as material. The results show that 20 Bacillus thuringiensis strains are screened from 100 soil samples， 7 of which contain insecticidal genes targeting mosquito larvae; among them， S4-2 strain has the highest insecticidal activity， and at the concentration of parasporal crystal of 2.00 mg/mL， the corrected mortality is 96.67%.

Key words： Bacillus thuringiensis; mosquito larva; strain identification; genotype; insecticidal activity

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）是一種全球廣泛存在的革蘭氏陽性細菌，可產芽孢和由不同的cry基因編碼的伴孢晶體（cry protein）[1-2]。

蘇云金芽孢桿菌產品具有對人類無毒害，對環(huán)境無污染且對靶標害蟲高效的特點，在農業(yè)領域得到了廣泛的應用[3]。目前，發(fā)現(xiàn)并克隆的殺蟲Bt基因已超過300 種，分別對鱗翅（Lepidoptera）、雙翅目（Diptera）、鞘翅目（Coleoptera）、膜翅目（Hymenoptera）、同翅目（Homoptera）、直翅目（Orthoptera）、食毛目（Mallophaga）等昆蟲具有殺蟲活性[4]。自1901年發(fā)現(xiàn)以來，蘇云金芽孢桿菌受到世界各國的普遍關注，已成為研究最深入、應用最廣泛的生物殺蟲劑[5]。蘇云金芽孢桿菌的最適生長溫度為24～28℃，除了溫度以外，陽光輻射、pH值等對其田間作用效果的穩(wěn)定性有較大影響[6]。而太陽輻射為較難控制的環(huán)境因素，因此該因素也成為限制蘇云金芽孢桿菌活性的最主要因素。由于Bt制劑殺蟲譜窄，毒效較化學藥劑低，加上某些害蟲對Bt制劑已產生抗性等原因[7]，Bt制劑的發(fā)展受到一定限制。近年來，各國紛紛加大研發(fā)力度，以期通過Bt菌株分離鑒定、δ-內毒素組成研究和cry基因型鑒定分類等手段篩選出新型、高效的殺蟲菌株和特異性基因。

雙翅目蚊科昆蟲是常見的衛(wèi)生害蟲之一，人類許多疾病都可通過蚊科昆蟲傳播，如登革熱、瘧疾、黃熱病、絲蟲病、日本腦炎等[8]。根據世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，全球每年有 3億～5億瘧疾的病例，死亡300萬～500萬人;每年登革熱的病例有數千萬，在我國每年瘧疾的報告病例為3萬～5萬[9]。而目前還沒有疫苗和有效的藥物來預防瘧疾和登革熱，且在除南極洲外，世界各大洲均有蚊蟲分布，因此必須控制媒介蚊蟲的數量來阻斷蚊媒病的暴發(fā)和流行，降低其對人類的危害[10]。目前，對蚊蟲的防治主要是針對成蟲，多用蚊香、滅蚊噴劑及電蚊拍等滅蚊。但長期使用蚊香和滅蚊噴劑對人體有一定的危害。此外，因為蚊香使用不當造成的火災事故年年都有發(fā)生。因此，探尋消滅蚊類幼蟲的方法更為可取。

Bt生物農藥在防治鱗翅目昆蟲方面已取得了顯著成效，但關于其對雙翅目昆蟲的防效研究相對較少[11]。蘇云金芽孢桿菌對雙翅目昆蟲具有毒殺作用，且其伴孢晶體多為球形，也鑒定了多個殺蟲cry基因，這為蘇云金芽孢桿菌防治雙翅目昆蟲的菌株篩選奠定了良好的基礎[12]。試驗從四川劍閣、湖北天門、湖南吉首等地采集了100份土樣，通過高溫法進行蘇云金芽孢桿菌的分離純化，采用PCR法對菌株的殺蟲基因進行鑒定，以期篩選對蚊科幼蟲有殺蟲活力的蘇云金芽孢桿菌菌株，并以蚊科幼蟲孑孓為材料對篩選菌株的殺蟲活性進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 土樣采集與菌株分離

從四川劍閣、湖北天門、湖南吉首等地采集土樣共計100份。具體采樣方法為：選取無農事操作土地，去掉5 cm深的表層土壤;用無菌藥勺采集5 g土樣裝于無菌采樣袋中[13];將土樣帶回實驗室于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。菌株分離方法為：取1 g土樣懸浮于10 mL無菌水中，65 ℃水浴加熱30 min，震蕩混勻;吸取10 μL溶液，稀釋100倍;取100 μL稀釋液，加入900 μL無菌水稀釋成1 000倍稀釋液;分別吸取10 μL的100倍稀釋液和1 000倍稀釋液，涂布在NA培養(yǎng)基[14]上，置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d;挑取菌落在顯微鏡下觀察，標記呈蘇云金芽孢桿菌菌落形狀的菌落;將標記菌落進行純化，將純化菌落置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 供試昆蟲

供試蚊科幼蟲孑孓飼養(yǎng)于長江大學西校區(qū)植物園固定水桶內。試驗時先用小號塑料水桶舀取固定水桶內含孑孓的水，然后用紗布分離，再用小毛筆將紗布上獲得的孑孓置于新的小桶內水中，小桶內加有少許酵母粉進行飼養(yǎng)[15]。

1.3 伴孢晶體觀察及收集

伴孢晶體觀察：取一干凈載玻片，滴一滴清水;取出保存的菌株，用無菌槍頭挑取菌落于載玻片上的水滴中，用槍頭將菌體在水滴之中涂布均勻，置于烘箱中烘干;用移液槍吸取100 μL石碳酸，滴在有菌體部分，靜置染色1 min左右;用無菌水沖洗滴有石碳酸復紅染液的玻片3～4次，用紙巾擦干菌株以外的水漬，蓋上蓋玻片，做成蘇云金芽孢桿菌玻片;在100倍油鏡下觀察蘇云金芽孢桿菌及其伴孢晶體，判斷蘇云金芽孢桿菌類型，并拍照[16]。

伴孢晶體收集：將純化的蘇云金芽孢桿菌菌株接種至裝有50 mL LB 培養(yǎng)液的離心管中，220 r/min，30 ℃培養(yǎng)48～72 h;待菌株產生大量伴孢晶體后，將培養(yǎng)好的菌液放入離心機，4 500 r/min，4℃冷凍離心20 min，棄上清;用20 mL 0.1% Triton-x100生理鹽水重懸菌體，重懸菌液，4 500 r/min，4 ℃離心20 min，棄上清;無菌水洗滌沉淀3次，低溫風干后稱量沉淀物重量;加入一定量無菌水，配置成固定濃度的懸浮液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蘇云金芽孢桿菌基因型的鑒定

采用PCR的方法對分離出來的蘇云金芽孢桿菌菌株進行基因型鑒定，鑒定中所用cry1、cry2、cry4等引物是根據文獻[17]設計。反應條件：94℃ 5 min;94℃ 1 min，退火1 min，72℃1 min，35個循環(huán);72℃10 min。其中，根據不同引物設定不同退火溫度。

1.5 伴孢晶體對蚊科幼蟲的殺蟲活性鑒定

（1）初步篩選。取100 mL滅菌錐形瓶，向其中加入一定量蘇云金芽孢桿菌晶體懸浮液，對照組加入等量無菌水，然后向錐形瓶中加入飼養(yǎng)幼蟲水體，定容至50 mL，配制成晶體濃度為1 mg/mL的溶液，每個菌株設3組平行。在飼養(yǎng)的幼蟲中選擇3～4齡幼蟲，用小毛筆挑至錐形瓶中，每個錐形瓶中10只，用封口膜將錐形瓶封口。記錄幼蟲接入時間，于第二日相同時間統(tǒng)計死亡幼蟲及存活幼蟲數量，共統(tǒng)計5 d，記錄其總存活數，死亡數量。

（2）復篩。挑選初步篩選中表現(xiàn)出的高毒菌株，按照上述步驟進行不同濃度的殺蟲性試驗。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選結果

經過分離篩選，從100份土樣中共獲得蘇云金芽孢桿菌菌株20株，篩選率為20%。其中，從四川劍閣篩選出蘇云金芽孢桿菌8株，從湖北天門篩選出蘇云金芽孢桿菌6株，從湖南石首篩選出蘇云金芽孢桿菌6株，其對應地點和編號見表2。

2.2 伴孢晶體的形態(tài)觀察

將分離出來的菌株經石碳酸復紅染色后在光學顯微鏡（10×目鏡，100×油鏡）下進行觀察，鏡檢結果如圖1所示，菌株包含的伴孢晶體類型均為圓球形（圖1B），從而可初步判斷它們可能對雙翅目蚊科幼蟲具有殺蟲活性。

2.3 Bt菌株cry 基因型的鑒定

cry1、cry2和cry4是對雙翅目昆蟲具有殺蟲活性的蘇云金芽孢桿菌的主要殺蟲基因，故可采用PCR方法對所篩選的蘇云金芽孢桿菌菌株的基因型進行鑒定。由圖2可知，從獲得的蘇云金芽孢桿菌中分離出含cry1基因的蘇云金芽孢桿菌3株，分別為S4-1、S20-1、HB8-1;含cry2基因的蘇云金芽孢菌株2株，為HB2-1和HN10-1;含cry4基因的蘇云金菌株4株，分別為S4-1和S4-2和S12-1、HN10-1。

2.4 毒力菌株的初步篩選

利用飼養(yǎng)的雙翅目蚊科3～4齡幼蟲對分離的20株蘇云金芽孢桿菌菌株伴孢晶體進行殺蟲生物活性測定，結果如表3所示，對蚊科幼蟲有殺蟲作用的菌株共計3株，分別為S4-2、S12-1、HN10-1;其中殺蟲效果最好的是S4-2，在1.00 mg/mL 濃度下校正死亡率為82.76%，差異達到顯著水平。

2.5 高毒菌株的復篩

選擇初步篩選中表現(xiàn)出顯著殺蟲活性的S4-2菌株和表現(xiàn)出一定殺蟲活性的S12-1、HN10-1菌株進行了不同晶體濃度的梯度殺蟲試驗，結果如表4所示，S4-2菌株在伴孢晶體濃度為2.00 mg/mL時殺蟲活性最強，校正死亡率達到96.67%，差異達到顯著水平，而同濃度的S12-1、HN10-1菌株，校正死亡率分別只有53.33%和63.33%，殺蟲效果較差，可能需要更高的濃度才能獲得較好的效果。

3 討 論

高效殺蟲活性的蘇云金芽孢桿菌的篩選是一項長期不懈的任務。該研究從四川劍閣、湖北天門、湖南吉首3地采集土樣100份，共篩選蘇云金芽孢桿菌菌株20株，篩選率只有50%。不同地方的土樣，因為其地理環(huán)境及土壤酸堿性等生化特性不同，含有的蘇云金芽孢桿菌菌株種類與數量存在差異。相較于四川劍閣和湖南吉首采集的土樣，湖北天門采集到的土樣中分離出的蘇云金芽孢桿菌菌株種類數量相對較少。劍閣、吉首都為山區(qū)，天門屬于江漢平原，與大洪山區(qū)毗鄰，自然環(huán)境的差異導致山區(qū)與平原地區(qū)的蘇云金芽孢桿菌菌株內所含基因及其對不同目科昆蟲的防治效果存在一定差異[18]。在分離出的20株蘇云金芽孢桿菌中，含cry1基因的菌株有3株，含cry2基因的菌株有2株，含cry4基因的有4株。理論上含有cry4基因的蘇云金桿菌對雙翅目昆蟲有較強的毒殺作用，但試驗結果顯示，各菌株的具體毒力強弱存在差異[19]。

對20株蘇云金芽孢桿菌菌株進行蚊科幼蟲殺蟲試驗，篩選出一株殺蟲活性相對較高的菌株S4-2，當伴孢晶體濃度為2.00 mg/mL時，對蚊科幼蟲孑孓的校正死亡率高達96.67%。但是，筆者只進行了室內試驗，與蚊蟲類幼蟲生活環(huán)境存在一定的差異，故該菌株對蚊科幼蟲的防治在理論上是可行的。戶外使用該種蘇云金芽孢桿菌是否會產生室內同樣的效果，尚需進一步驗證。試驗選擇的蚊科幼蟲對象為孑孓的3～4齡，該齡期孑孓可能相較于其低齡幼蟲有較高的抗藥性，故在低齡幼蟲期進行蚊科幼蟲的防治，應有更好的防治效果。此外，按蚊屬、伊蚊屬和搖蚊屬蚊科幼蟲在自然界中多混合生活于水中，而該試驗所選擇的對象為蚊科的幼蟲，并未區(qū)分是按蚊、伊蚊還是搖蚊的幼蟲[20]。有研究表明，不同屬種的蚊類幼蟲在不同環(huán)境條件下對蘇云金芽孢桿菌的響應存在一定的差異，但該研究的試驗條件與自然條件十分接近，因此其結果更具參考價值。

蘇云金芽孢桿菌作為生物殺蟲劑相對于化學農藥有許多優(yōu)點，如對人畜安全無害、對環(huán)境無污染等。此外，蚊科昆蟲主要通過成蟲傳播各種疾病，若能將蚊科昆蟲消滅于幼蟲，必將大大減少人類疾病的傳播與發(fā)生。如果能得到一種高效的防蚊蘇云金芽孢桿菌菌株，必將大大減少蚊蟲給人們帶來的危害。因此，不斷加強蘇云金芽孢桿菌菌株的篩選，積極探索其對蚊類幼蟲的殺蟲活性，具有十分重要的現(xiàn)實意義。

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（責任編輯：成 平）