睢博文 馬翠霞 苗磊 王苗 張榮榕 馬馨桐 趙大慶 邵帥 嚴(yán)銘銘

摘 要 目的：優(yōu)化復(fù)方人參健體方4種組方藥材（人參、山藥、枸杞子、益智仁）的配比，并考察其抗疲勞活性及急性毒性。方法：通過水提取、濃縮、減壓干燥制備復(fù)方人參健體方水提物。采用單因素試驗(yàn)，以小鼠負(fù)重游泳時間為指標(biāo)，考察人參、山藥、枸杞子、益智仁的處方量等4個因素的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以小鼠負(fù)重游泳時間和運(yùn)動后血清尿素氮含量、肝糖原含量和血乳酸曲線下面積的綜合評分為評價指標(biāo)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化處方配比。將小鼠分為空白對照組（水）、陽性對照組（人參紅景天膠囊，0.135 g/kg）和復(fù)方低、中、高劑量組[最優(yōu)配比復(fù)方人參健體方提取物（以下簡稱“優(yōu)化復(fù)方”）4.08、8.16、12.24 g/kg，以生藥量計(jì)]，灌胃給藥或水20 mL/kg，每日1次，連續(xù)30 d。以給藥后小鼠的負(fù)重游泳時間和運(yùn)動后血清尿素氮含量、肝糖原含量和血乳酸曲線下面積的綜合評分驗(yàn)證優(yōu)化復(fù)方的抗疲勞活性;同時，以復(fù)方中劑量組小鼠的測定數(shù)據(jù)計(jì)算綜合評分，比較其與理論預(yù)測值的差距。對小鼠灌胃優(yōu)化復(fù)方（總劑量為16.00 g/kg，以提取物計(jì)），連續(xù)14 d觀察并記錄小鼠的一般狀態(tài)、體質(zhì)量變化、中毒特征以及死亡情況等，并測定半數(shù)致死量（LD50）和最大耐受劑量（MTD）。結(jié)果：復(fù)方人參健體方的最優(yōu)處方配比為人參1.5 g、山藥10 g、枸杞子10 g、益智仁3 g?？蛊诨钚则?yàn)證試驗(yàn)顯示，優(yōu)化復(fù)方較空白對照組可顯著延長小鼠負(fù)重游泳時間，降低血清尿素氮含量和血乳酸含量及曲線下面積（低劑量組除外），提高肝糖原含量（P<0.05或P<0.01）;且復(fù)方中劑量組的綜合評分平均值為96.95分，與理論預(yù)測值97.01分僅相差0.06%。急性毒性實(shí)驗(yàn)顯示，小鼠均未見死亡現(xiàn)象發(fā)生，優(yōu)化復(fù)方的經(jīng)口MTD均大于15 g/kg，屬無毒級。結(jié)論：優(yōu)化的復(fù)方人參健體方對小鼠具有顯著的抗疲勞活性，且未見明顯毒副作用。

關(guān)鍵詞 復(fù)方人參健體方;Box-Behnken響應(yīng)面法;處方篩選;抗疲勞;安全性;小鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To optimize the ratio of four components of Compound renshen jianti formulation （Panax ginseng， Dioscorea oppositifolia， Lycium barbarum fruit， Alpinia oxyphylla）， and to investigate its anti-fatigue activity and acute toxicity. METHODS： The water extract of Compound renshen jianti formulation was prepared by water extraction， concentration and decompression drying. By single factor tests， using weight-bearing swimming time as index， the effects of four factors were investigated， such as the amount of P. ginseng， D. oppositifolia， L. barbarum fruit， A. oxyphylla. On the basis of single factor tests， using comprehensive score of weight-bearing swimming time， serum urea nitrogen content， liver glycogen content and AUC of blood lactate after exercise as index， the formulation was optimized by Box-Behnken response surface method. The mice was divided into blank control group （water）， positive control group （Renshen hongjingtian capsules， 0.135 g/kg） and compound low-dose， medium-dose and high-dose groups [the optimal ratio of Compound renshen jianti formulation extract （called “optimal compound formulation” for short） 4.08， 8.16， 12.24 g/kg， by crude drug]， intragastric administration of drug or distilled water 20 mL/kg， once a day， for consecutive 30 d. The weight-bearing swimming time， the contents of serum urea nitrogen， liver glycogen and blood lactate AUC after exercise were used to optimize its anti-fatigue activity of optimal compound formulation. The comprehensive score was calculated based on the measured data of mice in the compound formulation middle-dose group， and the difference between it and the theoretical prediction value was compared. The mice were given optimal compound formulation intragastrically （total dose 16.00 g/kg， by extract）. The general state， body mass change， toxic characteristics and death of mice were observed and recorded for 14 days. Median lethal dose （LD50） and maximum tolerated dose （MTD） were measured. RESULTS： The optimal formulation ratio of Compound renshen jianti formulation included that P. ginseng 1.5 g， D. oppositifolia 10 g， L. barbarum fruit 10 g， A. oxyphylla 3 g. Results of anti-fatigue activity validation test showed that the optimal compound formulation could significantly prolonged weight-bearing swimming time， reduced serum content of urea nitrogen， blood lactate content and its AUC （except for low-dose group）， while significantly increased the content of liver glycogen （P<0.05 or P<0.01）. Average comprehensive score of medium-dose group was 96.95， which was only 0.06% different from the theoretical prediction value of 97.01. The results of acute toxicity test showed that there was no death in mice. The oral MTD of the optimal compound formulation was more than 15 g/kg， which was non-toxic. CONCLUSIONS： The optimal Compound renshen jianti formulation has effective anti-fatigue activity of mice， and has no significant toxic effect.

KEYWORDS? ?Compound renshen jianti formulation; Box-Behnken response surface method; Formulation screening; Anti-fatigue; Acute toxicity; Mice

疲勞在中醫(yī)學(xué)上屬于“勞”“虛勞”的范疇，《內(nèi)經(jīng)·素問·舉痛論》言曰“勞則氣耗”，即勞動或運(yùn)動可導(dǎo)致機(jī)體陽氣不足而引發(fā)肢軟乏力、神疲倦怠等氣虛證候，形成體力疲勞[1]。世界衛(wèi)生組織（WHO）的一項(xiàng)全球性調(diào)查結(jié)果表明，真正健康的人只占5%，患有疾病的人占20%，而75%的人則長期處于疲勞等“亞健康”狀態(tài)[2]。目前，市場上緩解體力疲勞的藥物主要以化學(xué)藥為主，但長期服用易使患者產(chǎn)生藥物依賴性，還可引起過度興奮、激素水平失衡等不良反應(yīng)[3]。近年來，中藥在抗疲勞方面表現(xiàn)出效果明顯、毒副作用低且不會引發(fā)興奮中樞、焦慮、心血管疾病等優(yōu)勢，逐漸受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[4]。

復(fù)方人參健體方是長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院治未病中心的經(jīng)驗(yàn)方，該方源由金櫻膏（《古今醫(yī)統(tǒng)》卷四十六）、大補(bǔ)元煎（《景岳全書》卷五十）、右歸丸（《景岳全書》卷五十一）、守中丸（《圣濟(jì)總錄》卷十六）、加味地黃丸（《壽世保元》卷五）、延齡固本方（《良朋匯集》卷二引王世功集方）、長生固本方（《壽世寶元》卷四）、固本健陽丹（《萬病回春》卷六）、大補(bǔ)丸（《竹林女科證治》）等古方經(jīng)加減而得，其組方藥材包括人參、山藥、枸杞子、益智仁。經(jīng)該院臨床實(shí)踐證明，該方健補(bǔ)脾胃、益腎固精、緩解疲勞、增強(qiáng)體力之功效顯著。為進(jìn)一步開發(fā)利用該方劑，本課題組在上述研究背景下，對該復(fù)方進(jìn)行處方配比的優(yōu)化，評價其抗疲勞功效并考察其安全性，為我國中藥傳統(tǒng)方劑的中藥現(xiàn)代化研發(fā)與應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

ALB-224型萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）;Infinite M200PRO型全自動酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）;DZTW型電子調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）;JM01-ZH-XSC型恒溫游泳箱（河南精邁儀器儀表有限公司）;D1008E型離心機(jī)（美國Scilogex公司）。

1.2 藥品與試劑

人參（批號：20170328）、山藥（批號：20170725）、枸杞子（批號：20170713）、益智仁（批號：20171025）各藥材飲片均購自吉林省仙草醫(yī)藥藥材有限公司，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院姜大成教授鑒定，均為合格的飲片產(chǎn)品。

人參紅景天膠囊（湖南金六谷藥業(yè)有限公司，批號：10619002，規(guī)格：0.45 g）;尿素氮檢測試劑盒、糖原檢測試劑盒、乳酸檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20180628、20180719、20180718）;0.9%氯化鈉注射液（江西省創(chuàng)欣藥業(yè)集團(tuán)有限公司，作為生理鹽水使用）;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（遼）2015-0003。飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級，室溫為20～25 ℃，相對濕度為40%～60%，通風(fēng)換氣次數(shù)為14次/h，光照良好，每日更換墊草料，提供標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。小鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，進(jìn)行相應(yīng)抗疲勞分組實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 復(fù)方健體方提取物制備

按照一定的處方配比稱取人參、山藥、枸杞子、益智仁4味藥材，混合后適當(dāng)粉碎，加8倍量水（mL/g），加熱回流提取2次，每次1 h;濾過，合并濾液，水浴蒸干濃縮，減壓干燥，粉碎，過80目篩，即得。

2.2 不同配比復(fù)方人參健體方提取物的抗疲勞效果比較

2.2.1 給藥劑量確定 假設(shè)復(fù)方人參健體方4味組方藥材人參、山藥、枸杞子、益智仁的人日服處方量分別為a、b、c、d（以生藥量計(jì)，單位均為g，下同），按成人體質(zhì)量60 kg以及人與小鼠的體表面積換算[5]得小鼠的等效處方量為9.2×（a+b+c+d）g/60 kg，為操作方便并取等效劑量的2倍，將小鼠的給藥劑量設(shè)置為20×（a+b+c+d）g/60 kg。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，小鼠每日灌胃復(fù)方人參健體方提取物藥液，灌胃體積為20 mL/kg，每日灌胃1次，連續(xù)30 d后，進(jìn)行后續(xù)抗疲勞效果考察。

2.2.2 小鼠負(fù)重游泳時間測定 實(shí)驗(yàn)前1 h小鼠禁食不禁水，在其末次給藥30 min后，在尾根部負(fù)荷占體質(zhì)量5%的鉛皮，然后將其置于水深30 cm、水溫（30±2）℃的恒溫游泳箱中進(jìn)行游泳負(fù)重實(shí)驗(yàn)。每次下水的小鼠不超過4只，彼此不得靠近。用秒表記錄小鼠從入水至頭部全部沒入水中（以小鼠鼻孔下沉入水并持續(xù)8 s未能浮出水面為準(zhǔn)）為止的時間，作為小鼠負(fù)重游泳時間。

2.2.3 小鼠運(yùn)動后血清尿素氮含量的測定 在末次給藥30 min后，將小鼠置于“2.2.2”項(xiàng)下恒溫游泳箱中不負(fù)重游泳90 min，游泳結(jié)束休息30 min后，摘其眼球采血，以3 000 r/min離心10 min。取上層血清，按尿素氮檢測試劑盒說明書方法操作，測定血清中尿素氮含量。

2.2.4 小鼠運(yùn)動后肝糖原含量的測定 在末次給藥30 min后，將小鼠置于“2.2.2”項(xiàng)下恒溫游泳箱中不負(fù)重游泳90 min，游泳結(jié)束后立即頸椎脫臼處死，取出肝臟，置于冰生理鹽水中剔除結(jié)締組織，然后以濾紙吸干。稱取適量肝臟組織，按糖原檢測試劑盒說明書方法操作，測定肝糖原含量。

2.2.5 小鼠運(yùn)動后血乳酸含量及其曲線下面積的測定 末次給藥30 min后，于小鼠眼眶靜脈叢取血0.1 mL（血樣置于肝素鈉處理的采集管中抗凝，下同），然后將其置于“2.2.2”項(xiàng)下恒溫游泳箱中不負(fù)重游泳10 min。分別于游泳結(jié)束后第0、20 min時于其眼眶靜脈叢再取血0.1 mL。取上述全血樣品，按乳酸檢測試劑盒說明書方法分別測定游泳前后3個不同時間點(diǎn)血乳酸含量，并按公式計(jì)算血乳酸曲線下面積[6-7]：血乳酸曲線下面積=5×（游泳前血乳酸含量+3×游泳結(jié)束后第0 min時的血乳酸含量+2×游泳結(jié)束后第20 min時的血乳酸含量）。

2.3 單因素試驗(yàn)初步篩選復(fù)方人參健體方的處方配比

結(jié)合臨床用藥劑量及本課題組前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以人參處方量（A）2 g，山藥處方量（B）7 g、枸杞子處方量（C）8 g、益智仁處方量（D）3 g為基礎(chǔ)因素條件。單獨(dú)調(diào)整每個因素水平，具體為：（1）固定山藥、枸杞子、益智仁處方量分別為7、8、3 g，考察人參不同處方量（1、1.5、2、2.5、3 g）;（2）固定人參、枸杞子、益智仁處方量分別為2、8、3 g，考察山藥不同處方量（3、5、7、9、11 g）;（3）固定人參、山藥、益智仁處方量分別為2、7、3 g，考察枸杞子不同處方量（4、6、8、10、12 g）;（4）固定人參、山藥、枸杞子處方量分別為2、7、8 g，考察益智仁不同處方量（1、2、3、4、5 g）。按上述配比共設(shè)計(jì)20組試驗(yàn)，每組10只小鼠，按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下方法給藥后進(jìn)行小鼠負(fù)重游泳時間考察，初步比較復(fù)方人參健體方不同處方配比的抗疲勞效果。

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)方人參健體方的處方配比

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)。以人參處方量（A，g）、山藥處方量（B，g）、枸杞子處方量（C，g）、益智仁處方量（D，g）為自變量，以小鼠負(fù)重游泳運(yùn)動時間和運(yùn)動后血清尿素氮、肝糖原、血乳酸等4個指標(biāo)的綜合評分值為因變量（響應(yīng)面值），設(shè)計(jì)不同處方配比的4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)方案并進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)，每組10只小鼠，按“2.2”項(xiàng)下方法給藥后進(jìn)行小鼠抗疲勞效果考察?？紤]到抗疲勞活性以小鼠運(yùn)動能力為主、血液/組織中相關(guān)生化指標(biāo)為輔，分別對小鼠負(fù)重游泳時間、血清尿素氮含量、肝糖原含量、血乳酸曲線下面積等4項(xiàng)指標(biāo)賦予權(quán)重0.4、0.2、0.2、0.2，則綜合評分（Y）=0.4×小鼠負(fù)重游泳時間/小鼠負(fù)重游泳時間最大值+0.2×血清尿素氮含量最小值/血清尿素氮含量+0.2×肝糖原含量/肝糖原含量最大值+0.2×血乳酸曲線下面積最小值/血乳酸曲線下面積。采用Y值綜合比較復(fù)方人參健體方不同處方配比的抗疲勞效果。Box-Behnken設(shè)計(jì)的因素與水平見表1。

2.5 最優(yōu)配比復(fù)方人參健體方的抗疲勞活性驗(yàn)證試驗(yàn)

按“2.4”項(xiàng)下Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選的復(fù)方人參健體方日服處方量配比稱取4種組方藥材飲片，混合后適當(dāng)粉碎，按“2.1”項(xiàng)下方法提取，得提取物4.9 g（得率為20.00%）。按成人體質(zhì)量60 kg計(jì)算每1 kg體質(zhì)量的成人日服總生藥量（4種組方飲片質(zhì)量之和為24.5 g，下同）為0.408 g/kg。分別以該人體服用劑量的10、20、30倍作為小鼠給藥的低、中、高劑量（4.08、8.16、12.24 g/kg，以生藥量計(jì)）。

取200只小鼠，分為空白對照組、陽性對照組（人參紅景天膠囊，0.135 g/kg，劑量參考“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行設(shè)置，相當(dāng)于人日用量的20倍）和復(fù)方低、中、高劑量組[最優(yōu)配比復(fù)方人參健體方提取物（以下簡稱為“優(yōu)化復(fù)方”），以生藥量計(jì)算]，每組40只。復(fù)方各劑量組小鼠灌胃優(yōu)化復(fù)方溶液，陽性對照組小鼠灌胃人參紅景天膠囊藥液，空白對照組小鼠灌胃等體積水，灌胃體積均為20 mL/kg，每日灌胃1次，連續(xù)30 d。

首次灌胃給藥前及末次灌胃給藥前測定并記錄小鼠體質(zhì)量，觀察小鼠生長發(fā)育及活動情況。末次給藥后按“2.2.2”～“2.2.5”項(xiàng)下操作，分別測定小鼠抗疲勞試驗(yàn)4項(xiàng)指標(biāo)（每項(xiàng)指標(biāo)10只小鼠），驗(yàn)證優(yōu)化復(fù)方對小鼠的抗疲勞活性。以復(fù)方中劑量組小鼠的測定數(shù)據(jù)計(jì)算綜合評分（Y），比較其與理論預(yù)測值的差距。

2.6 最優(yōu)處方配比復(fù)方人參健體方的小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)

參照本課題組前期研究[8]，取小鼠20只，雌雄各半，灌胃優(yōu)化復(fù)方溶液（以水配制成0.40 g/mL的藥液，以提取物計(jì)），每次20 mL/kg，灌胃2次，給藥間隔6 h[灌胃總劑量為16.00 g/kg（以提取物計(jì)），相當(dāng)于“2.4”項(xiàng)下優(yōu)選的成人日服用劑量的約196倍]。給藥后，連續(xù)14 d觀察并記錄小鼠的一般狀態(tài)、體質(zhì)量變化、中毒特征以及死亡情況等，并測定半數(shù)致死量（LD50）和最大耐受劑量（MTD）。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理所得數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以x±s表示，采用單因素分析數(shù)據(jù)的正態(tài)分布，符合正態(tài)分布時采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方人參健體方的單因素試驗(yàn)篩選結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)人參處方量為1.5 g、山藥處方量為9 g、枸杞子處方量為10 g、益智仁處方量為3 g時，相應(yīng)給藥組小鼠的負(fù)重游泳時間即可達(dá)到最大值并趨于穩(wěn)定。以此為基礎(chǔ)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化復(fù)方人參健體方處方。單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

3.2 復(fù)方人參健體方的Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

按Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案的不同配比復(fù)方人參健體方的試驗(yàn)結(jié)果見表2。

采用Design-Expert 8.0.5.0軟件對人參、山藥、枸杞子、益智仁的處方量與綜合評分（Y）進(jìn)行多元回歸擬合，得到二元多項(xiàng)回歸方程：Y=96.348+0.529 2A+1.551 67B+1.249 1C-2.041 67D-3.862 5AB-2.952 5AC+0.907 5AD+0.117 5BC-1.59BD-0.682 5CD-5.134A2-4.170 25B2-4.792 75C2-4.792 75D2。

對模型回歸方程各項(xiàng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可見，模型F=11.314 6，P<0.000 1，說明模型極顯著;失擬項(xiàng)F=0.173 3，P=0.476 1，說明模型失擬項(xiàng)不顯著;模型的確定系數(shù)R 2為0.928 8，接近1，說明該回歸模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合度較高，可采用此模型對綜合評分進(jìn)行分析和預(yù)測?；貧w方程的一次項(xiàng)B、C、D和交互項(xiàng)AB、AC（P<0.05），以及二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2（P<0.01）對綜合評分的影響均可達(dá)到顯著水平。根據(jù)回歸分析中F值排序（F值越大，影響越大），可知各因素對綜合評分的影響大小排序?yàn)椋阂嬷侨侍幏搅浚―）>山藥處方量（B）>枸杞子處方量（C）>人參處方量（A）。

采用Design-Expert 8.0.5.0軟件對響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到響應(yīng)面圖，見圖2～圖7。以Y值的回歸模型的極值分析得到最優(yōu)處方量為：人參1.42 g、山藥9.72 g、枸杞子10.24 g、益智仁2.71 g。在上述最優(yōu)處方量條件下，Y的預(yù)測值為97.01?？紤]實(shí)際操作的可行性，將處方優(yōu)化為人參1.5 g、山藥10 g、枸杞子10 g、益智仁3 g。

3.3 最佳配比復(fù)方人參健體方的抗疲勞活性驗(yàn)證結(jié)果

3.3.1 對小鼠體質(zhì)量的影響 實(shí)驗(yàn)過程中，各組小鼠生長發(fā)育及健康狀況均良好，且活動正常，無異常表現(xiàn);灌胃給藥前及末次灌胃給藥前，與正常對照組比較，陽性對照組和復(fù)方低、中、高劑量組小鼠的體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見表4。

3.3.2 對小鼠負(fù)重游泳時間的影響 與空白對照組比較，各給藥組小鼠負(fù)重游泳時間均顯著延長（P<0.05或P<0.01），詳見表4。

3.3.3 對小鼠運(yùn)動后血清尿素氮含量的影響 與空白對照組比較，各給藥組小鼠血清尿素氮含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表5。

3.3.4 對小鼠肝糖原含量的影響 與空白對照組比較，各給藥組小鼠肝糖原含量顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見表6。

3.3.5 對小鼠運(yùn)動后血乳酸含量及曲線下面積的影響 與空白對照組比較，陽性對照組和復(fù)方中、高劑量組小鼠在3個不同時間點(diǎn)的血乳酸含量及曲線下面積均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表6。

3.3.6 綜合評分驗(yàn)證結(jié)果 按復(fù)方中劑量組的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，小鼠負(fù)重游泳運(yùn)動時間為26.80 min，運(yùn)動后血清尿素氮為6.58 mmol/L、肝糖原含量為1 494.73 mg/100 g、血乳酸曲線下面積為118.23，則綜合評分平均值為96.95，與理論預(yù)測值97.01僅相差0.06%，由此可見經(jīng)Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化的處方配比可行。

3.4 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

兩種性別的小鼠均未見死亡現(xiàn)象發(fā)生，優(yōu)化復(fù)方的經(jīng)口MTD均大于15 g/kg，急性毒性分級屬無毒級[8]，詳見表7。

4 討論

本課題組以中醫(yī)經(jīng)典古方為參照，確定復(fù)方人參健體方的組方藥材分別為人參、山藥、枸杞子和益智仁。為優(yōu)化該方的藥材組方配比，本研究先后采用單因素試驗(yàn)及Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化法，通過抗疲勞實(shí)驗(yàn)，以小鼠運(yùn)動能力結(jié)合其血液/組織中相關(guān)生化指標(biāo)的綜合評分確定了4種藥材的最佳處方用量。同時，對此優(yōu)化配比組方進(jìn)行了小鼠抗疲勞活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)以及急性毒性實(shí)驗(yàn)，考察優(yōu)選復(fù)方人參健體方的抗疲勞功效和安全性。

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)中常用陽性藥[9-11]，同時考慮本復(fù)方后續(xù)研發(fā)方向?yàn)榭蛊谥苿?，故采用紅景天膠囊為陽性對照藥，與所優(yōu)選的復(fù)方健體方進(jìn)行抗疲勞活性的比較。

負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)是經(jīng)典抗疲勞活性，本研究在此基礎(chǔ)上結(jié)合小鼠運(yùn)動后體內(nèi)血清尿素氮、肝糖原的含量和血乳酸含量及曲線下面積變化，多指標(biāo)綜合評價不同配比復(fù)方人參健體方的抗疲勞效果，使其結(jié)果更加可靠。其中，血清中尿素是蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物，當(dāng)機(jī)體劇烈運(yùn)動時，蛋白質(zhì)及氨基酸的分解代謝增強(qiáng)，氨基酸會代謝轉(zhuǎn)化生成尿素進(jìn)入血液，使血清尿素氮含量增加，這也是疲勞時出現(xiàn)肌肉酸痛的主要原因，血清尿素氮含量越高，表明身體對運(yùn)動負(fù)荷的適應(yīng)性越差、越易產(chǎn)生疲勞[12-14]。肝糖原的重要性主要體現(xiàn)在饑餓或運(yùn)動狀態(tài)下肝糖原分解進(jìn)入血液以維持血糖的恒定，當(dāng)肝糖原被大量消耗時，機(jī)體便會產(chǎn)生疲勞[15-16]。因此，肝糖原的含量是檢測疲勞是否發(fā)生的一項(xiàng)重要指標(biāo)。乳酸是糖無氧酵解的產(chǎn)物，血乳酸的堆積會使肌肉發(fā)生收縮而擠壓血管，使得血流不暢、肌肉功能下降，繼而使機(jī)體產(chǎn)生疲勞[17-18]。因此，血乳酸被認(rèn)為是影響運(yùn)動性疲勞的重要因素，可作為評判機(jī)體疲勞程度的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，最優(yōu)配比的復(fù)方人參健體方可以顯著降低運(yùn)動后小鼠的血清尿素氮水平，顯著提高其肝糖原水平，顯著減少其血乳酸的產(chǎn)生和加快乳酸的分解，加之還可顯著延長小鼠負(fù)重游泳時間，因此證實(shí)其可增強(qiáng)小鼠的抗疲勞能力。小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠經(jīng)口MTD均大于15 g/kg，屬無毒級。

綜上所述，復(fù)方人參健體方的最優(yōu)組方配比為人參1.5 g、山藥10 g、枸杞子10 g、益智仁3 g;該優(yōu)化復(fù)方提取物對小鼠具有顯著的抗疲勞活性，且未見明顯毒副作用，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景，但其具體作用機(jī)制還需要一步研究。

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（收稿日期：2019-11-19 修回日期：2020-03-15）

（編輯：段思怡）