盧麗珍 ，荊 晶 ，萬 青

（1.上海宜墾生物科技有限公司，寶山，200439；2.上海環(huán)墾生態(tài)科技股份有限公司，寶山200439）

人參 （Panax ginsengC.A.Mey.）是名貴的中藥材，根、花、種子均可入藥，具有很高的藥用價(jià)值[1]。我國是人參的種植大國，同時(shí)也是全世界范圍內(nèi)種植面積最大、產(chǎn)量最大的國家[2]。吉林省東部山區(qū)是我國人參的主產(chǎn)區(qū)，總產(chǎn)量約占全國的80%以上[3]。人參對生長環(huán)境要求嚴(yán)苛[4～6]，種植過程中極易感染病害[7]。而由鏈格孢菌引起的人參黑斑病是人參病害中最為嚴(yán)重的一種[8]，該病可通過種子、土壤、種苗帶菌進(jìn)行傳播，主要危害植株的地上部位。據(jù)統(tǒng)計(jì)人參黑斑病的發(fā)病率通常在20%～30%，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)90%，這對人參的品質(zhì)和產(chǎn)量均造成嚴(yán)重影響。

目前人參黑斑病主要通過阿迷西達(dá)、普力克、凱潤等化學(xué)農(nóng)藥防治[9]，但因用藥劑量大、用藥頻繁等原因，導(dǎo)致參地污染嚴(yán)重，人參品質(zhì)不斷下降。而微生物菌劑作為一種含有大量有益活菌及活性物質(zhì)的新型肥料，不僅具有低碳、純天然、無毒、無害、無污染等優(yōu)點(diǎn)，還能提高植物的抗逆抗病能力，刺激生長[10]，近年來，它的發(fā)展與效用一直受到各界的關(guān)注和研究。王瀚等人的研究表明，節(jié)桿菌Arthrobacter和莫海威芽孢桿菌（Bacillus mojavensis）對黑斑病病菌的抑菌效果明顯[11]，丁萬隆等人也認(rèn)為不同菌劑對黑斑病病菌存在抑制效果[12]。已有的研究多集中在拮抗菌對黑斑病的抑菌效果方面，有關(guān)田間實(shí)驗(yàn)效果的報(bào)道較少。本文采用田間施肥實(shí)驗(yàn)，通過施用不同種類微生物菌劑及不同使用劑量，探究了微生物菌劑對人參黑斑病的防治作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試病原菌菌株：病株采自吉林琿春三家子滿族鄉(xiāng)西上臺子屯人參種植基地，采用組織分離培養(yǎng)方法分離純化的病原菌。

供試微生物菌劑：地養(yǎng)力微生物菌劑（地衣芽孢桿菌≥10億/g，有機(jī)質(zhì)≥70%）和高?？?號微生物菌劑（枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌≥3億/ml），來自上海環(huán)墾生態(tài)科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：吉林省琿春三家子滿族鄉(xiāng)西上臺子屯人參種植基地（E130°27′，N42°46′）。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：實(shí)驗(yàn)共設(shè)置7個(gè)處理，4次重復(fù)，小區(qū)面積是10㎡，隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)具體施肥設(shè)計(jì)如表1。

對照小區(qū)施肥方式為4月初基施0.15m3發(fā)酵農(nóng)家肥，5月、7月各追施1次氨基酸水溶肥0.15kg和復(fù)合肥（10-8-16）0.60kg。

各處理施肥方式為：4月初基施地養(yǎng)力，5月、7月、8月追施各高?？?號1次，稀釋50倍，灌根。其他按照參田正常管理進(jìn)行。

表1 施肥處理Table1 Fertilization treatments

1.3 菌種鑒定

委托微基生物科技（上海）有限公司對分離純化后的病菌進(jìn)行16S rDNA序列測定，再將該DNA序列在NCBI GenBank上進(jìn)行同源性分析(http://blast.Ncbi.nlm.nih.gov/Blast)，選取與病菌在16S rDNA序列上同源性最高的前10個(gè)菌株的16S rDNA，與病菌的16S rDNA序列一起，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 調(diào)查采樣

于8月份，在每一小區(qū)采用五點(diǎn)隨機(jī)取樣法，選取1m2的植株進(jìn)行病害調(diào)查統(tǒng)計(jì)，記錄發(fā)病株數(shù)、發(fā)病級數(shù)，計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

計(jì)算公式[13]：

發(fā)病率（%）=感病株數(shù)/總調(diào)查株數(shù)×100%

病情指數(shù) （%）=∑ [(各級參數(shù)×該級代表值)×100%]/（調(diào)查總株數(shù)×5）

相對防治效果（%）=（對照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/對照區(qū)病情指數(shù)×100%

以單位面積內(nèi)病株占樣本面積的百分率來劃分病害級數(shù)，病情分為 5 級，表示為 0、1、2、3、4 級，具體劃分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 人參黑斑病病害分級Table2 The garding standards of ginseng black spot

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016和SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 病菌的16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

在NCBI GenBank上進(jìn)行16S rDNA序列分析，結(jié)果表明，該病菌屬于鏈格孢屬。從發(fā)育樹上看，病菌與MoEF007菌株最接近，同源性最高。結(jié)合16S rDNA序列同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的分析結(jié)果，可以判定該病菌為黑斑病病菌。

圖1 基于病菌的16S rDNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic trees of pathogenic bacteria strains based on 16S rDNA sequences

2.2 不同處理對人參黑斑病發(fā)生的影響分析

與對照相比，施用微生物菌劑的處理，人參黑斑病的發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著下降（P＜0.01），其中T6的發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著低于其他處理，分別為30.49%和2.59%。CK的發(fā)病率和病情指數(shù)顯著高于其他處理，分別為93.05%和15.29%。各處理人參黑斑病的發(fā)病率依次為 T6(30.49±0.53)＜T1(39.53±0.55)＜T4(41.33±0.30)＜T2(41.76±0.26)＜T5(42.77±0.73)＜T3(47.00±0.95)＜CK(93.05±0.62)； 病情指數(shù)依次為 T6(2.59±0.05)＜T4(3.42±0.17)＜T1(3.47±0.04) ＜T2(3.94±0.11)＜T5(4.00±0.02)＜T3(4.43±0.16)＜CK(15.29±0.18)。說明施用微生物菌劑能有效降低人參黑斑病的發(fā)病率和病情指數(shù)。

施用微生物菌劑后，各個(gè)處理的防治效果之間存在顯著差異（P＜0.01），其中T6的相對防治效果顯著高于其他施肥處理，為83.03，其次為T4，防治效果為77.61，但與防治效果為77.28%的T1差異不大，T4和T1均顯著高于T2和T3。相對防治效果排序依次為T6(83.03±0.70)＞T4(77.61±1.12)＞T1(77.28±0.25)＞T2(74.24±0.69)＞T5(73.79±0.20)＞T3(71.01±1.04)。表明施用微生物菌劑對人參黑斑病具有良好的防治效果。另外通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在施用一定量地養(yǎng)力的條件下，增加高?？?號的用量，黑斑病的防治效果更加顯著。

表3 不同處理對人參黑斑病發(fā)生的影響Table3 The effect of different treatment on the occurrence of ginseng black spot(μ±se)

3 結(jié)論與討論

本研究通過施用不同種類和用量的微生物菌劑，來探究微生物菌劑對人參黑斑病發(fā)生率的影響。結(jié)果表明，施用地養(yǎng)力和高保康3號微生物菌劑，在不同用量的情況下均能顯著降低人參黑斑病的發(fā)病率和病情指數(shù)，對人參黑斑病具有良好的防治效果。其中，T6即基施地養(yǎng)力微生物菌劑 6405kg/ha，5、7、8月各噴施一次高?？?號微生物菌劑2415L/ha的防治效果最好，人參黑斑病的發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著低于其他處理，可在人參黑斑病的防治方面進(jìn)行推廣應(yīng)用。

?，|浩的研究表明施用液體菌劑可以顯著降低人參病害的發(fā)生率[14]，王玲的研究中表示施用粉劑菌劑能夠有效緩解人參黑斑病的發(fā)病率和病情指數(shù)[15]，均與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。細(xì)菌用于防治植物病蟲害的主要機(jī)理是由于細(xì)菌和病菌之間存在競爭機(jī)制，而芽孢桿菌屬作為一種被最廣泛應(yīng)用的生防菌種，近年來受到各界的關(guān)注。芽孢桿菌用于大田水稻紋枯病[16]、辣椒疫病[17]和煙草青枯病[18]的防治都取得了顯著的效果，孫卓認(rèn)為解淀粉芽孢桿菌對人參黑斑病的防治效果為80.21%的保護(hù)作用和72.22%的治療作用[19]，2015年的研究表明內(nèi)生芽孢桿菌對人參黑斑病的保護(hù)作用和治療作用均達(dá)到了50%以上[20]。

本研究中的供試菌劑含有大量的地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，施用含有芽孢桿菌的微生物菌劑對人參黑斑病的防治具有良好效果。菌劑的施用量與人參黑斑病的防治效果及經(jīng)濟(jì)效益之間的平衡，有待結(jié)合人參產(chǎn)量和品質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的分析研究。