高賢嫻，王丹妮，張 宸，洪 鐵,2*，王小龍*

(1.吉林大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，長(zhǎng)春130021；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長(zhǎng)春130012；3.吉林省婦幼保健院，長(zhǎng)春130061）

膀胱過(guò)度活動(dòng)癥（overactive bladder，OAB）是一種臨床常見(jiàn)的以尿頻、尿急、夜尿等為主要膀胱癥狀的泌尿外科疾病，可伴或不伴急迫性尿失禁，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)血尿。通常可由下尿路梗阻、急慢性膀胱炎、神經(jīng)源性膀胱炎及間質(zhì)膀胱炎等多種病因引起，國(guó)際尿控協(xié)會(huì)將OAB定義為膀胱逼尿肌不自主收縮；尿流動(dòng)力學(xué)可表現(xiàn)為膀胱逼尿肌過(guò)度活動(dòng)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其發(fā)病率可隨年齡增長(zhǎng)而升高，老年人群多發(fā)且女性高于男性[1]。目前并無(wú)特異性治療藥物及療法。穩(wěn)尿膠囊是吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院泌尿外科專家以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，根據(jù)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)方。全方由黃芪、山藥、黨參、炒白術(shù)、茯苓、澤瀉、土茯苓等七味草藥組成，對(duì)機(jī)體的泌尿系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)具有較好的調(diào)節(jié)作用。環(huán)磷酰胺（Cytoxan，CTX）是廣泛應(yīng)用的廣譜抗腫瘤藥，在治療各種實(shí)體瘤的同時(shí)由體內(nèi)磷酸脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)楸┤┏练e在膀胱粘膜及尿道上皮，導(dǎo)致泌尿道毒性從而引起出血性膀胱炎，表現(xiàn)為少尿、血尿及尿頻尿急等膀胱刺激癥狀[2]。因其引起的膀胱癥狀與人膀胱過(guò)度活動(dòng)癥相似，已成為由化學(xué)物質(zhì)刺激引起的膀胱過(guò)度活動(dòng)癥的首選模型。本實(shí)驗(yàn)選用腹腔注射環(huán)磷酰胺建模以研究穩(wěn)尿膠囊對(duì)大鼠膀胱過(guò)度活動(dòng)癥的治療作用及其機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，雄性，60只，體質(zhì)量250～280 g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001，將動(dòng)物于動(dòng)物室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，溫度為20～24℃，濕度為40%～70%，12h明暗交替照明，給予維持飼料，自由飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

環(huán)磷酰胺由上海信裕生物科技有限公司提供；酒石酸托特羅定片由山東魯南貝特制藥有限公司生產(chǎn)；大鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子 （NGF）ELISA試劑盒由武漢默沙克生物科技有限公司生產(chǎn)；大鼠白細(xì)胞介素1β(IL-1β)ELISA試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供；丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒（TBA法）、總超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒（WST-1法）由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司；科耐普計(jì)量智能型恒流泵，重慶科耐普蠕動(dòng)泵有限公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，Biotek公司；手持式高速勻漿機(jī)，上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；BS124S電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；3-18k低溫高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司；XPX-9052 MBE數(shù)顯不銹鋼電熱培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

2 方法

2.1 分組給藥與動(dòng)物模型的建立

將60只SD雄性大鼠，按體重隨機(jī)分為6組，正常對(duì)照組6只，環(huán)磷酰胺（75mg/kg）模型組14只，其余各給藥組各10只，分別為穩(wěn)尿膠囊高劑量組（5.4mg/kg），穩(wěn)尿膠囊中劑量組（2.7mg/kg），穩(wěn)尿膠囊低劑量組（1.35mg/kg），陽(yáng)性對(duì)照托特羅定片（0.5mg/kg）組。大鼠分籠飼養(yǎng)，常規(guī)飲食飲水。

采用大鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺（75mg/kg）模擬大鼠膀胱過(guò)度活動(dòng)癥模型，每3日/1次，共4次。造模1h后分別灌胃給予高、中、低濃度穩(wěn)尿膠囊（1.35、2.7、5.4mg/kg）和陽(yáng)性對(duì)照托特羅定（0.5mg/kg），1 次/日，連續(xù)給藥14天。

2.2 觀測(cè)指標(biāo)

2.2.1 大鼠一般狀態(tài)

實(shí)驗(yàn)期間觀察大鼠一般狀態(tài)，包括體重、毛發(fā)、精神狀態(tài)、口鼻出血、尿血等表現(xiàn)。

2.2.2 大鼠尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測(cè)定

末次給藥后對(duì)大鼠進(jìn)行尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后仰臥位固定，腹部及尿道口消毒，用硬膜外麻醉導(dǎo)管自制大鼠導(dǎo)尿管，大鼠做尿道插管導(dǎo)出膀胱余尿后固定導(dǎo)尿管。沿大鼠趾骨弓上緣向上縱向剖開(kāi)腹部暴露膀胱，在膀胱頂部刺一小洞，將兩根PE-50導(dǎo)管插入膀胱，荷包縫合使導(dǎo)管固定于膀胱且無(wú)漏尿。造瘺管1與BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)相連，造瘺管2與蠕動(dòng)泵相連，系統(tǒng)排盡殘留空氣后調(diào)零，輕壓腹部排凈尿液，將膀胱基礎(chǔ)壓力調(diào)整至基線。膀胱灌注溫生理鹽水（灌注速度為0.1ml/min）。記錄尿流動(dòng)力學(xué)波形圖及排尿壓峰值（mmHg）、排尿間隔時(shí)間（s）。至少記錄3個(gè)排尿周期。

測(cè)定結(jié)束時(shí)導(dǎo)尿管連接注射器將膀胱中殘余尿液吸出，記錄剩余尿量（ml）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取大鼠膀胱組織，稱重記錄膀胱濕重（mg），計(jì)算膀胱指數(shù)：

膀胱指數(shù) （%）=膀胱濕重 （mg）/大鼠體重（g）x100%

2.2.3 大鼠血清中NGF含量測(cè)定

尿流動(dòng)力學(xué)測(cè)定后大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，離心分離上清，-80℃凍存?zhèn)溆谩２捎肊LISA法嚴(yán)格按照說(shuō)明書的指導(dǎo)測(cè)定大鼠血清中神經(jīng)生長(zhǎng)因子的含量變化。

2.2.4 大鼠膀胱組織中SOD、MDA、IL-1β的含量測(cè)定

取血后取大鼠膀胱組織，液氮速凍后轉(zhuǎn)-80℃凍存?zhèn)溆?。取適量膀胱組織，加入冰生理鹽水，置于冰浴中用組織勻漿器制成膀胱組織勻漿，離心取上清液，離心條件4℃下，3500 r/min，10 min。取適量上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書的要求測(cè)定膀胱組織上清液中IL-1β含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書的要求測(cè)定膀胱組織上清液中SOD、MDA含量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行。根據(jù)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)資料的正態(tài)性和方差齊性，各組數(shù)據(jù)均用x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)比較差異的顯著性。P＜0.05即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀況

造模大鼠出現(xiàn)不同程度全身癥狀，如體質(zhì)量下降，進(jìn)食量減少，毛色暗淡大量脫毛，精神萎靡懶動(dòng)，口鼻眼滲血，出現(xiàn)肉眼尿血。各給藥組全身癥狀有不同程度改善。

3.2 大鼠尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

對(duì)照組大鼠膀胱充盈期呈低壓狀態(tài)，排尿期膀胱壓明顯升高隨排尿活動(dòng)進(jìn)行而逐漸降低，具有規(guī)律的尿流動(dòng)力學(xué)波形；與對(duì)照組相比，模型組大鼠膀胱充盈期出現(xiàn)逼尿肌不穩(wěn)定收縮，收縮頻率明顯增高，形成不規(guī)則的鋸齒狀圖形；與模型組性比各給藥組波形有不同程度的改善，其中穩(wěn)尿膠囊高劑量組與陽(yáng)性藥組更接近于正常組尿流動(dòng)力學(xué)波形。各組尿流動(dòng)力學(xué)波形見(jiàn)圖1。與對(duì)照組相比，模型組大鼠排尿間隔時(shí)間縮短、排尿壓峰值降低、膀胱剩余尿量增多、膀胱指數(shù)升高，均有顯著性差異（P＜0.01）；與模型組相比，穩(wěn)尿膠囊高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組可延長(zhǎng)排尿間隔時(shí)間、升高排尿壓峰值、使膀胱殘余尿量減少，均具有顯著性差異（P＜0.01），可降低膀胱指數(shù)（P＜0.05）。 尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 穩(wěn)尿膠囊對(duì)膀胱過(guò)度活動(dòng)大鼠尿流動(dòng)力學(xué)影響結(jié)果

表1 穩(wěn)尿膠囊對(duì)膀胱過(guò)度活動(dòng)大鼠尿流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及膀胱指數(shù)的影響結(jié)果（x±s）

3.3 大鼠體內(nèi)NGF、SOD、MDA、IL-1β含量測(cè)定結(jié)果

與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中NGF含量顯著增加（P＜0.01），膀胱組織上清液中 MDA、IL-1β 含量顯著增加（P＜0.01，P＜0.05），SOD 含量顯著減少（P＜0.01）；與模型組相比，穩(wěn)尿膠囊高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組顯著降低大鼠血清中NGF含量，降低膀胱組織上清液中 MDA、IL-1β 含量（P＜0.01，P＜0.05），顯著升高SOD含量（P＜0.01）。各因子測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 穩(wěn)尿膠囊對(duì)膀胱過(guò)度活動(dòng)大鼠體內(nèi)各因子含量的測(cè)定結(jié)果（x±s）

4 討論

膀胱過(guò)度活動(dòng)癥（overactive bladder，OAB）是由膀胱逼尿肌的過(guò)度活動(dòng)引起的以尿頻、尿急、尿不盡、夜尿等癥狀為主、伴或不伴急迫性尿失禁的常見(jiàn)泌尿外科疾病，可由膀胱炎癥、下尿路梗阻、前列腺炎、盆腔炎癥等疾病引起。逼尿肌的過(guò)度活動(dòng)常導(dǎo)致膀胱頻繁無(wú)規(guī)律性收縮，使膀胱喪失儲(chǔ)尿功能，隨著患病時(shí)間增長(zhǎng)可引起其他尿道—膀胱功能障礙。

尿流動(dòng)力學(xué)檢查是臨床診斷膀胱過(guò)度活動(dòng)癥排尿功能障礙的重要手段，可客觀反映膀胱與下尿道功能狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠的尿流動(dòng)力學(xué)曲線呈無(wú)規(guī)則鋸齒狀，提示膀胱逼尿肌無(wú)自主收縮頻繁；排尿壓峰值明顯低于正常組大鼠，提示儲(chǔ)尿期變短即排尿間隔時(shí)間縮短；排尿壓降低使膀胱內(nèi)剩余尿液不能完全排出致使剩余尿量增加。有文獻(xiàn)報(bào)道稱當(dāng)膀胱逼尿肌常處于過(guò)度活躍狀態(tài)可導(dǎo)致膀胱壁順應(yīng)性降低，出現(xiàn)尿失禁癥狀，而膀胱內(nèi)持續(xù)的炎癥刺激可導(dǎo)致膀胱壁水腫增厚，是膀胱順應(yīng)性降低的另一主要原因。環(huán)磷酰胺常用于模擬炎癥引起的膀胱過(guò)度活動(dòng)癥模型，是廣譜抗腫瘤藥之一，其體內(nèi)代謝物丙烯醛常沉積于膀胱及下尿路，持續(xù)刺激膀胱內(nèi)壁引起炎癥，是癌癥患者并發(fā)出血性膀胱炎的首要原因。

神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）在膀胱上皮細(xì)胞及膀胱黏膜組織中均有表達(dá)，膀胱過(guò)度活動(dòng)時(shí)可在血液及尿液中發(fā)現(xiàn)大量NGF。許多研究表明膀胱過(guò)度活動(dòng)癥患者血液及尿液中NGF表達(dá)升高，在膀胱平滑肌和黏膜組織中分泌明顯增加[3]。尿液中NGF的表達(dá)升高提示膀胱處于過(guò)度活動(dòng)狀態(tài)，可有望成為無(wú)創(chuàng)確診膀胱過(guò)度活動(dòng)癥的指標(biāo)之一[4～5]。丙二醛、超氧化物歧化酶及白細(xì)胞介素-1β是常見(jiàn)的致炎因子，可導(dǎo)致膀胱炎癥加劇引起膀胱過(guò)度活動(dòng)癥[6]。

穩(wěn)尿膠囊是根據(jù)多年治療膀胱過(guò)度活動(dòng)癥的臨床經(jīng)驗(yàn)而總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)方，具有益氣固本、散濁利尿的作用。組方中的君藥黃芪具有補(bǔ)氣固表、利尿排毒的作用，常用來(lái)治療自汗、水腫、慢性腎炎蛋白尿等疾病。已有研究表明，黃芪可抑制體外膀胱逼尿肌收縮頻率和張力，改善逼尿肌不穩(wěn)定大鼠下尿路癥狀[7]。綜上，穩(wěn)尿膠囊可能通過(guò)改善尿流動(dòng)力學(xué)、抑制NGF表達(dá)、抑制促炎因子表達(dá)等治療膀胱過(guò)度活動(dòng)癥，其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。