殷海成，黃進，賈峰，鄭鑫

(河南工業(yè)大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001)

魚粉和豆粕是動物飼料中常用的蛋白源，但因魚粉資源短缺、價格偏高，用豆粕替代魚粉已成為降低飼料成本的現(xiàn)實選擇。然而動物尤其是幼齡動物攝食高水平添加的豆粕飼料常常導致過敏反應。主要原因在于豆粕含有多種抗原蛋白成分，如大豆球蛋白、大豆β-伴球蛋白等，其中，β-伴球蛋白(β-conglycinin)不僅含量多、熱穩(wěn)定性好，且抗原性強，是導致幼齡動物發(fā)生過敏反應最強的抗原蛋白[1]。當幼齡動物攝入大豆β-伴球蛋白后，其中的大部分被分解消化，僅有微量通過跨細胞和/或旁細胞途徑進入循環(huán)系統(tǒng)，由抗原提呈細胞提呈給T細胞，進而刺激B細胞并產(chǎn)生特異性IgE抗體，使機體致敏；當大豆β-伴球蛋白再次與特異性IgE抗體結合，會引起過敏，導致機體免疫系統(tǒng)功能紊亂和誘發(fā)腸道及全身性病理變化，使生長受阻，造成嚴重的經(jīng)濟損失[2]。Wu等[3]證實，大豆β-伴球蛋白會導致斷奶仔豬腸道過敏損傷及炎癥相關細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-8、IFN-γ等的表達增加；吳莉芳等[4]在不同食性魚類飼料中添加60 mg/g大豆球蛋白和40 mg/g的大豆β-伴球蛋白，發(fā)現(xiàn)2種抗原蛋白均能引起免疫系統(tǒng)紊亂和腸道炎癥反應，腸道炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-4和IFN-γ表達顯著上調；Guo等[5]通過基因表達獲得93%純度的大豆β-伴球蛋白，灌服大鼠后發(fā)現(xiàn)發(fā)生了Ⅰ型超敏反應，導致大鼠腸肥大細胞數(shù)量增加，脫顆粒明顯，血和脾臟中的IL-2、IL-4、IL-5含量增加；類似結果在犢牛試驗中也觀察到[6]。然而，大豆β-伴球蛋白是否引起動物頭腎組織表達炎性細胞因子變化的研究報道不多，對于魚類的研究更少。

頭腎是硬骨魚類的多功能器官，不僅參與魚類排泄也參與免疫和造血功能，尤其在調節(jié)免疫細胞增殖分化和抗過敏免疫反應方面具有重要作用[7]，因此，開展魚類頭腎免疫相關基因表達研究，不僅有助于深化其參與免疫調節(jié)的機理，還可針對養(yǎng)殖過程中的增強免疫調節(jié)及病害防控提供依據(jù)。黃河鯉Cyprinuscarpiohaematopterus是目前中國北方地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖的珍貴品種，例如河南省水產(chǎn)科學研究院培育的第8代品種(登記號：GS01-001-2004)，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大和豆粕的大量運用，由豆粕等含大豆抗原蛋白產(chǎn)品導致其免疫功能紊亂及過敏性炎癥反應，甚至繼發(fā)其他類型的疾病，給黃河鯉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。為此，本研究中以黃河鯉為試驗對象，通過飼料中添加不同水平的大豆β-伴球蛋白替代飼料中的魚粉蛋白，探討不同水平的大豆β-伴球蛋白對黃河鯉頭腎中TLR2/NF-κB p65信號通路及下游關鍵炎性因子表達的變化，以期了解大豆β-伴球蛋白對黃河鯉頭腎免疫功能造成的影響，為淡水魚類飼料中合理添加豆粕提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用黃河鯉購于河南省水產(chǎn)科學研究院種魚繁殖場，并在河南工業(yè)大學生物工程學院魚類營養(yǎng)實驗室進行為期2周的馴化，馴化期間用魚粉配制全價飼料進行飼喂。

1.2 方法

1.2.1 大豆β-伴球蛋白的分離純化及試驗飼料的制備 采用簡化膜中間試驗法[8]分離提取大豆β-伴球蛋白(純度為89.3%)，用于替代黃河鯉飼料中魚粉蛋白。以魚粉、玉米蛋白粉和大豆β-伴球蛋白為蛋白源，以面粉、糊精、魚油、豆油等為能源，以麥麩、纖維素為輔料，配制含大豆β-伴球蛋白為0%(對照組)、1.0%、3.0%、5.0%和7.0%的5組等氮(粗蛋白質38.0%)、等能(17.0 MJ/kg)飼料，分別記為A、B、C、D、E組，其飼料組成及營養(yǎng)水平見表1、表2。除油脂外的其他各原料組分經(jīng)粉碎過60目篩，按配方稱重，逐級放大混合，加油、加水拌勻，用SLKL-120B型制粒機(曲阜市圣魯機械廠)制成直徑為 2.0 mm的顆粒飼料，于40 ℃下烘干6 h，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 飼料組成(干物質)

注：其他成分包括玉米蛋白粉18.0%、糊精8.0%、面粉12.0%、麥麩16.0%、魚油1.4%、氯化膽堿0.5%、預混劑2.9%；預混料為每千克日糧提供：維生素A 15 000 IU、維生素E 60 mg、維生素D33000 IU、維生素K35 mg、維生素B120 mg、維生素B230 mg、維生素B615 mg、維生素B120.5 mg、煙酸200 mg、葉酸5 mg、肌醇1000 mg、生物素3.0 mg、泛酸鈣50 mg、鐵 30 mg、銅 3 mg、錳 15 mg、碘 0.8 mg、鎂 0.7 g

Note:In each diet, the followings are supplied: corn gluten 18.0%, dextrin 8.0%, wheat meal 12.0%, wheat bran 16.0%, fish oil 1.4%, choline chloride 0.5%, and premix 2.9%; The premix provides following per kg of diet: VA 15 000 IU, VE 60 mg, VD33000 IU, VK35 mg, VB120 mg, VB230 mg, VB615 mg, VB120.5 mg，niacin 200 mg, folic acid 5 mg, inositol 1000 mg, biotin 3.0 mg, calcium pantothenate 50 mg, Fe 30 mg, Cu 3 mg, Mn 15 mg, I 0.8 mg, and Mg 0.7 g

表2 飼料營養(yǎng)水平(干物質)

注：營養(yǎng)水平為實測值

Note:Nutrient levels are determined in values

1.2.2 試驗設計及養(yǎng)殖管理 馴化結束后，隨機選擇225尾體質量為(41.00 ± 0.12)g的黃河鯉分成5組，每組設3個重復，每個重復15尾魚，分養(yǎng)于裝自動循環(huán)微流水系統(tǒng)的15個水族箱中，養(yǎng)殖試驗共進行21 d。試驗期間，每天9：00和17：00投喂試驗飼料，投喂量分別為體質量的1.4%和1.6%。整個試驗期間，養(yǎng)殖用水為曝氣的自來水，水溫為25～27 ℃，溶氧大于6.0 mg/L，pH為6.8。

1.2.3 樣品采集 分別在試驗的第1、7、14、21 天從各重復組隨機取幼鯉3尾，用MS-222(0.03%)麻醉后，立即于4 ℃條件下解剖取其頭腎。用預冷的PBS(pH 7.2)清洗，液氮冷凍后于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.4 頭腎TLR2/NF-κB p65和炎性因子表達檢測 采用Trizol Reagent Kit提取黃河鯉頭腎總RNA，利用核酸內切酶Dnase水解頭腎中的總RNA中的DNA，采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用掃描分光光度計(Beckman DU-800)測定吸光度，根據(jù)OD260 nm/OD280nm值確定RNA質量。然后以mRNA為模板逆轉錄合成cDNA(大連寶生物工程有限公司，中國)。實時定量PCR按照課題組前期研究方法[9]，以合成的cDNA為模板和β-action為內參基因檢測黃河鯉頭腎中TLR2、NF-κBp65、IL-1β、IL-6、TNF-α1、IFN-γ的表達量，利用2-ΔΔCt=2-Ct(目的基因)-Ct(管家基因)進行相對表達豐度分析。目的基因引物序列見表3。

表3 目的基因引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差(mean ± S.D.)表示，采用SPSS 17.0軟件對各時間點所取樣品的檢測數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，利用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)確定取樣時間與添加劑量的交互作用，用Duncan法進行多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 大豆β-伴球蛋白添加組黃河鯉頭腎TLR2/NF-κB p65 mRNA表達的變化

飼料中大豆β-伴球蛋白添加劑量和飼喂時間顯著影響黃河鯉頭腎的TLR2和NF-κBp65表達(P<0.05)，但二者間無交互作用(P>0.05)(表4)。

表4 β-伴球蛋白劑量和時間對各基因表達的雙因素方差分析

Tab.4 Two-way ANOVA of dietary β-conglycinin levels and time on expression of various genes

因素factorTLR2NF-κBp65IL-1βIL-6TNF-α1IFN-γ劑量dose??????時間period?????ns劑量×時間nsnsnsnsnsns

注：*表示有顯著性影響(P<0.05)；ns表示無顯著性影響(P>0.05)

Note: *means significant effect(P<0.05)；ns means no significant effect(P>0.05)

從表5可見：隨時間的延長，飼料中大豆β-伴球蛋白各添加量組中黃河鯉頭腎TLR2、NF-κBp65相對表達量總體呈先升高后降低的趨勢，總體上在第14天時相對表達量最高；在第1天時，隨著大豆β-伴球蛋白添加量的增加，各處理組中TLR2和NF-κBp65表達量上調，最高為7.0%添加組且顯著高于對照組、1.0%和3.0%添加組(P<0.05)；在第7、14、21天時，對照組的黃河鯉頭腎TLR2和NF-κBp65表達量與1.0%添加組無顯著性差異(P>0.05)，但均顯著低于其他添加組(P<0.05)，各時間點下，TLR2 和NF-κBp65最高表達量分別出現(xiàn)在5.0%和7.0%添加組。

2.2 大豆β-伴球蛋白添加組黃河鯉頭腎IL-1β、IL-6、TNF-α1和IFN-γ mRNA表達的變化

大豆β-伴球蛋白添加劑量和飼喂時間顯著影響黃河鯉頭腎的IL-1β、IL-6和TNF-α1表達(P<0.05)，但二者間無交互作用(P>0.05)；而IFN-γ表達僅受添加劑量的顯著影響(P<0.05)(表4)。

從表6可見：隨著時間的延長，飼料中大豆β-伴球蛋白各添加量組黃河鯉頭腎中IL-1β、IL-6、TNF-α1和IFN-γ相對表達量總體呈先升高后降低的趨勢，總體上在第14天時相對表達量最高；在第1天時，隨著大豆β-伴球蛋白添加量的增加，各組黃河鯉頭腎IL-1β、IL-6和TNF-α1表達上調，IFN-γ表達先增后降，其中，7.0%添加組的IL-1β和IL-6表達量最高且顯著高于其他組(P<0.05)，而7.0%添加組TNF-α1表達量和5.0%添加組IFN-γ表達量最高且顯著高于對照組和1.0%組(P<0.05)；第7天時，各組黃河鯉頭腎中IL-1β、IL-6、TNF-α1和IFN-γ表達與第1天時相似，其中，5.0%和7.0%添加組的IL-1β、IL-6、TNF-α1表達量較高且顯著高于對照組、1.0%添加組(P<0.05)，3.0%添加組的IFN-γ表達量最高且顯著高于其他組(P<0.05)；第14、21天時，隨著大豆β-伴球蛋白添加量的增加，各組黃河鯉頭腎IL-6表達量上調，而IL-1β、TNF-α1和IFN-γ表達量先增后降；其中，7.0%添加組IL-6表達量最高且顯著高于對照組、1.0%和3.0%組(P<0.05)；5.0%組IL-1β和TNF-α1表達量最高且顯著高于對照組、1.0%組(P<0.05)；而IFN-γ表達最高值出現(xiàn)在3.0%組。

表5 飼料中不同水平的大豆β-伴球蛋白對黃河鯉頭腎TLR2/NF-κBp65基因相對表達量的影響

Tab.5 Effects of dietary β-conglycinin levels on relative expression levels of TLR2/NF-κB p65 mRNA in head kidney of juvenile common carpCyprinuscarpiohaematopterus

大豆β-伴球蛋白水平/%β-conglycininlevelTLR2NF-κBp651d7d14d21d1d7d14d21d0(對照)1.00±0.00c1.04±0.00c1.05±0.01c1.08±0.01c1.00±0.00c1.01±0.00c1.01±0.00c1.04±0.01c1.01.07±0.01c1.33±0.02c1.32±0.02c1.24±0.01c1.03±0.01c1.11±0.01c1.14±0.01c1.12±0.02c3.01.19±0.02b2.61±0.01b3.14±0.02b3.29±0.02b1.06±0.00c1.30±0.01b1.28±0.01b1.31±0.02b5.01.37±0.02ab4.02±0.03a4.27±0.03a4.01±0.03a1.13±0.01ab1.57±0.03ab1.66±0.03a1.48±0.01a7.01.42±0.02a3.58±0.03ab4.01±0.02ab3.45±0.03ab1.15±0.02a1.71±0.01a1.69±0.02a1.53±0.03a

注：同列中標有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同

Note:The means with different letters within the same column are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences, et sequentia

表6 飼料中不同水平的大豆β-伴球蛋白對黃河鯉頭腎IL-1β、IL-6、TNF-α1和IFN-γ基因相對表達量的影響

Tab.6 Effects of dietary β-conglycinin levels on relative expression levels ofIL-1β,IL-6,TNF-α1 andIFN-γmRNA in head kidney of juvenile common carpCyprinuscarpiohaematopterus

大豆β-伴球蛋白水平/%β-conglycininlevelIL-1βIL-6TNF-α1IFN-γ1d7d14d21d1d7d14d21d1d7d14d21d1d7d14d21d0(對照)1.00±0.00c1.01±0.00c1.03±0.01c1.07±0.01c1.00±0.00c1.02±0.01c1.03±0.01c1.06±0.01c1.00±0.00c1.09±0.01c1.12±0.01c1.13±0.01c1.00±0.00c1.02±0.00c1.06±0.01c1.10±0.01c1.01.02±0.01c1.06±0.01c1.13±0.02c1.09±0.02c1.16±0.02c1.44±0.01b1.75±0.03b1.45±0.01b1.16±0.02bc1.19±0.01c1.31±0.02c1.25±0.01c1.22±0.01b1.85±0.01b1.98±0.02b1.88±0.03ab3.01.09±0.01b3.66±0.05b5.01±0.04a4.12±0.03a1.28±0.02bc1.83±0.02b2.99±0.01b2.41±0.02b1.35±0.02b2.82±0.01b3.74±0.04b2.37±0.02b1.43±0.03ab2.29±0.02a2.97±0.02a2.08±0.03a5.01.13±0.01b4.45±0.03ab5.51±0.03a3.23±0.02ab1.32±0.01b1.97±0.03a3.79±0.02ab2.63±0.02a1.79±0.03a3.81±0.03ab5.73±0.03a4.27±0.03a1.72±0.03a1.91±0.02b1.13±0.01bc1.54±0.01b7.01.74±0.03a5.06±0.03a4.30±0.02b2.75±0.03b1.48±0.02a2.14±0.03a4.28±0.03a2.94±0.03a1.82±0.03a4.14±0.04a5.35±0.03a4.03±0.02a1.14±0.01b0.95±0.00c0.81±0.01c1.12±0.02c

3 討論

3.1 大豆β-伴球蛋白對TLR2/NF-κB p65 mRNA表達影響

TLR2是進化上相對保守的模式識別受體TLRs 家族成員之一，廣泛表達于免疫細胞、上皮細胞等多種細胞的細胞膜上，通過識別病原體相關的分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)與細胞內信號結構域及接頭分子相互作用，激活NF-κB等信號通路，釋放大量的TNF-α、IL-6、IL-1β等效應分子參與免疫功能的調節(jié)并誘導炎癥反應[10]。Supajatura等[11]研究證實，過敏小鼠肥大細胞的TLR2 mRNA表達上調、NF-κB移位和過度激活，釋放大量的炎性因子，說明TLR2可能對下游信號通路的異常調節(jié)而導致炎癥反應的發(fā)生，推測腸上皮細胞接受大豆伴球蛋白刺激后，引起TLR2激活，產(chǎn)生炎癥反應。頭腎作為魚類重要的免疫器官，是免疫細胞增殖分化的主要場所，對抗原應激極為敏感；過敏反應對頭腎的影響主要表現(xiàn)在免疫細胞的增殖分化失衡和相關炎癥細胞因子的差異表達等[7]。丁旭[12]研究發(fā)現(xiàn)，在聚肌胞苷酸(Poly I∶C)刺激斜帶石斑魚頭腎白細胞1.5 h后，TLR2 mRNA表達量顯著上調，3～6 h后表達量持續(xù)升高，并最終激活NF-κB，使其表達上調。本試驗表明，TLR2/NF-κBp65表達在添加3.0%～7.0%的大豆β-伴球蛋白后，除第1天時NF-κBp65表達與對照組無顯著性差異外，其他時間點TLR2/NF-κBp65表達均顯著增加。TLR2/NF-κB表達增加可能與其過敏有關[13]。另外，本研究中發(fā)現(xiàn)，到第21天時，黃河鯉頭腎TLR2/NF-κB表達較第14天時趨于下調，這可能是因為第21天后，黃河鯉的免疫系統(tǒng)逐漸恢復與重建，對大豆β-伴球蛋白產(chǎn)生免疫耐受。

3.2 大豆β-伴球蛋白對IL-1β、IL-6、TNF-α1和IFN-γ mRNA表達影響

被激活的機體免疫反應，免疫細胞和/或非免疫細胞都可合成和分泌抗炎或促炎細胞因子參與免疫等生理功能的調節(jié)。目前，關于抗原誘導的魚類過敏反應研究表明，LPS誘導下的鱸[14]、鯉[15]頭腎白細胞IL-1β表達顯著升高；Zhang等[16]用含8%的大豆β-伴球蛋白飼料飼喂幼建鯉Cyprinuscarpiovar.jian，其腸上皮細胞IL-1β表達顯著增加；本研究前期利用大豆β-伴球蛋白誘導黃河鯉的腸上皮細胞也發(fā)現(xiàn)IL-1β表達上調[9]。本試驗中，在1～14 d時，IL-1β表達隨大豆β-伴球蛋白替代魚粉量的增加顯著上調，同樣結果也發(fā)生在IL-6和TNF-α1細胞因子。這可能由于過敏導致大量的炎癥細胞浸潤黃河鯉頭腎組織，使促炎細胞因子分泌增加。而Urán等[17]認為，炎性細胞因子分泌增加主要與大豆抗原蛋白添加量、飼喂時間有關，表現(xiàn)在劑量-時間的依賴關系。IL-6是促炎細胞因子的代表，并通過正反饋調節(jié)，加速免疫細胞進一步增殖分化及B細胞分泌IgE抗體，從而促使過敏反應的快速發(fā)生[18]。本試驗中，添加1.0%的大豆β-伴球蛋白組，第7天時IL-6表達量較對照組顯著增加，而IL-1β和TNF-α1表達量與對照組無顯著性差異，說明過敏反應中IL-6表達較快；隨大豆β-伴球蛋白替代魚粉量的增加，第7～14天時IL-1β、IL-6和TNF-α1表達量快速增加，表明大豆β-伴球蛋白引起的黃河鯉過敏呈現(xiàn)劑量-時間的依賴關系。但在第21天時，IL-1β、IL-6 和TNF-α1表達量有所降低，低于第14天時的表達，其主要原因可能是黃河鯉的免疫系統(tǒng)逐漸恢復與重建及TLR2/NF-κBmRNA表達下調引起。另外，在機體抗過敏的免疫應答中，IFN-γ同樣發(fā)揮重要作用，不僅可激活T細胞以啟動細胞免疫，還能夠促進CD4+T細胞向Th1細胞的分化，以抑制過敏反應引起的IL-1β和TNF-α1表達增加[19]。本試驗中，1.0%和3.0%的大豆β-伴球蛋白替代魚粉組，IFN-γ的表達量顯著高于對照組，而7.0%的大豆β-伴球蛋白替代魚粉組，IFN-γ的表達量在第7、14和21天時又與對照組無顯著性差異，而IL-1β、IL-6 和TNF-α1表達則顯著高于對照組，說明在炎性反應過程中，產(chǎn)生的IFN-γ不足以下調IL-1β和TNF-α1表達[18]。IFN-γ表達在第21天時與IL-1β、IL-6 和TNF-α1表達不同，不降反升，可能是因為黃河鯉免疫系統(tǒng)的恢復使IFN-γ的表達回升，但確切機制還需進一步研究。

綜上所述，大豆β-伴球蛋白能促進黃河鯉頭腎內TLR2/NF-κB p65信號通路及炎性因子的表達，表現(xiàn)為劑量-時間依賴關系，但無交互作用。