閻德平,呂建建,題興斌,張文,張云濱,宋柳,劉萍*

(1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧 大連 116023；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室,山東 青島 266071；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室,山東 青島 266071)

凝集素是一類重要的免疫家族基因，廣泛分布于動植物和微生物中，能參與蛋白和核酸、蛋白和脂質(zhì)、蛋白和蛋白間的反應(yīng)[1]。動物凝集素最初被劃分為C-型凝集素和S-型凝集素兩類，其中C-型凝集素是最早發(fā)現(xiàn)的種類最多的動物凝集素，可以專一性地識別病原相關(guān)分子模式(PAMP)，在免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮著多種功能，例如微生物凝集、細(xì)胞黏附、結(jié)節(jié)形成和吞噬作用等[2]。近年來，有關(guān)海洋無脊椎動物C-型凝集素的相關(guān)報道逐漸增多，包括中國對蝦Fenneropenaeuschinensis、中華絨螯蟹Eriocheirsinensis、日本對蝦Marsupenaeujaponicus等[3-5]。此外，C-型凝集素在甲殼動物中可以參與免疫識別，如凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei的CTL4可以參與亞硝酸鹽的免疫反應(yīng)[6]；中華絨螯蟹的CTL4可以參與革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌等微生物刺激下的免疫應(yīng)答[4]。

三疣梭子蟹Portunustrituberculatus是中國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟蟹類，近年來，隨著集約化養(yǎng)殖程度的提高和養(yǎng)殖環(huán)境的污染，細(xì)菌和病毒引起的各種疾病給三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[7-8]。而對蝦白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)和副溶血弧菌是造成梭子蟹發(fā)病的主要病原之一，可作為一種免疫刺激劑來刺激梭子蟹，并通過觀察梭子蟹組織中基因的表達(dá)情況驗證基因的免疫功能。到目前為止，三疣梭子蟹中已發(fā)現(xiàn)4種不同的C-型凝集素可以參與免疫應(yīng)答反應(yīng)，包括CTL1、CTL2、CTL3和CTL4[9-12]，并證明該基因家族在三疣梭子蟹免疫中具有重要功能[1]。所在課題組前期通過轉(zhuǎn)錄組測序篩選到病原脅迫前后差異表達(dá)的C-型凝集素基因，該基因與已公開的梭子蟹凝集素基因序列差異較大，通過序列分析和功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測，明確其為三疣梭子蟹C-型凝集素家族的新成員。

本試驗中基于轉(zhuǎn)錄組中的序列，通過RACE技術(shù)成功克隆了三疣梭子蟹C-型凝集素CTL5基因(PtCTL5)cDNA全長，并分析了其在不同發(fā)育時期、不同組織，以及在副溶血弧菌Vibrioparahemolyticus和WSSV感染后主要免疫組織中的表達(dá)模式，旨在為進一步解析C-型凝集素家族基因在三疣梭子蟹免疫中的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用三疣梭子蟹來自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所試驗基地山東省濰坊市昌邑海豐水產(chǎn)有限公司。2018年8月試驗用個體為體質(zhì)量(30±2)g的80日齡三疣梭子蟹，試驗前先將試驗蟹放于若干個養(yǎng)殖池(5 m×3 m×1.5 m)中暫養(yǎng)7 d。暫養(yǎng)時水溫為(22±0.5)℃，持續(xù)供氧，鹽度為33，pH為 8.3，每天8:00更換自然海水，換水量為原來水體體積的1/3，定時投放新鮮雜魚，然后挑選活力、形態(tài)均較好的個體進行試驗。

分別根據(jù)孫穎民等[13]和薛俊增等[14]關(guān)于三疣梭子幼體發(fā)育不同時期的鑒定方法，在三疣梭子蟹苗種繁育期間采集其幼體發(fā)育各期的樣品(取3組平行樣品)，包括卵裂期(N1)、囊胚期(N2)、原腸期(N3)、眼點期(N4)、心跳期(N5)、溞狀幼體Ⅰ期(Z1)、溞狀幼體Ⅱ期(Z2)、溞狀幼體Ⅲ期(Z3)、溞狀幼體Ⅳ期(Z4)、大眼幼體期(M)、幼蟹Ⅰ期(C1)，并將樣品置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1PtCTL5基因全長cDNA的克隆

(1)總RNA提取和cDNA的合成。使用RNAiso Plus試劑，根據(jù)說明書步驟分別提取三疣梭子蟹不同發(fā)育時期總RNA，采用紫外分光光度計(NanoDrop 2000,Thermo)與10 g/L瓊脂糖凝膠電泳等方法，將提取得到的總RNA進行質(zhì)量和完整性檢測。挑選質(zhì)量好的RNA，將其混合用于制作RACE模板。

5′RACE和3′RACE模板的制備參照SMARTer?RACE 5′/3′Kit(TaKaRa)說明書進行。

(2)引物合成。通過 Primer Premier 6.0軟件設(shè)計中間片段擴增引物，以及5′和3′所需要的特異性RACE引物，如表1所示，由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進行合成。

(3)PtCTL5 基因片段的克隆。利用引物CTLF/CTLR進行基因中間片段擴增，反應(yīng)程序為：94 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下循環(huán)變性30 s，60 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸1 min，共進行35個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min，于4 ℃下恒溫保存。將擴增得到的PCR產(chǎn)物送交青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進行測序，然后與轉(zhuǎn)錄組測序獲得的unigene片段進行比對，確定保守區(qū)域的正確性。

使用TaKaRa LA Taq?試劑盒進行PtCTL5基因的3′和5′擴增，先進行第一次PCR擴增，分別使用CTL3 F/CTL5 F和UPM引物進行擴增；然后以第一次PCR擴增的反應(yīng)產(chǎn)物為模板，分別使用CLT3 S/CTL5 S和NUP引物混合進行第二次PCR擴增。反應(yīng)程序同上。

將第二次擴增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA切膠回收、pMD 18-T載體連接、轉(zhuǎn)化進入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單一菌落利用通用引物M13 F/M13 R(表1)進行菌落PCR初步鑒定，篩選目的菌液送往青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成測序。

表1 試驗用引物及序列

1.2.2 序列分析 使用Vecror NTI 11.0軟件去除多余的載體序列，然后將序列正確拼接，將拼接好的目的片段使用國家生物技術(shù)信息中心NCBI-BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行比對分析。使用Bioedit和Gene Tool預(yù)測開放閱讀框(ORF)，并對編碼的氨基酸進行翻譯。通過Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/search)預(yù)測蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。通過ExPASy-ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測蛋白分子量、不穩(wěn)定性指數(shù)、消光系數(shù)、脂肪族指數(shù)、理論等電點和信號肽。使用MEGA 6.0軟件以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，對PtCTL5氨基酸序列的親緣關(guān)系進行分析。

1.2.3PtCTL5基因在不同發(fā)育時期的表達(dá)分析 提取三疣梭子蟹幼體不同發(fā)育時期的RNA，從中選取高質(zhì)量的RNA通過Reverse Transcriptase M-MLV(RnaseH)試劑盒合成cDNA，合成的cDNA模板用于后續(xù)實時熒光定量PCR。利用Primer 6.0軟件設(shè)計用于PtCTL5幼體發(fā)育不同時期表達(dá)分析的熒光定量引物CTL-q F/R，內(nèi)參基因使用β-actin(表1)。以三疣梭子蟹幼體發(fā)育不同時期的cDNA為模板，進行實時熒光定量qPCR擴增。反應(yīng)體系(10 μL)包括：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL，Template cDNA 1 μL，Primer F(10 μmol/L)0.4 μL、Primer R(10 μmol/L)0.4 μL，用ddH2O補足至10 μL。每個樣品設(shè)3個平行和1個對照，反應(yīng)程序為：95 ℃ 下預(yù)變性30 s；95 ℃ 循環(huán)變性5 s，60 ℃ 退火復(fù)性34 s，共進行40個循環(huán)。

1.2.4 不同病原刺激下的組織及健康組織中PtCTL5 mRNA的表達(dá)分析 將暫養(yǎng)7 d后體表完整活力旺的三疣梭子蟹分成生理鹽水對照組、WSSV注射組和副溶血弧菌注射組，每組各30只。然后分別于梭子蟹的游泳足第一關(guān)節(jié)基膜處注射100 μL的生理鹽水(0.1 moL/L)、WSSV(濃度為7.6×107CFU/mL)和副溶血弧菌(濃度為3.8×108CFU/mL)[15]。在人工感染后的0、3、6、12、24、48、72 h，從每組分別隨機取3只存活三疣梭子蟹的血細(xì)胞和肝胰腺樣品；另外，隨機取暫養(yǎng)7 d后健康的3只三疣梭子蟹，分別取其肝胰腺、心臟、血細(xì)胞、眼柄、肌肉、鰓、胸腺、腸、腦等組織樣品。來自3只三疣梭子蟹同組織的樣品混合成一管，試驗同時設(shè)3個平行，所有樣品于液氮中保存待測。

按照前述的方法分別提取健康三疣梭子蟹9個組織和病原脅迫后各時間點樣品的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以稀釋后的cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR。擴增體系和反應(yīng)程序同“1.2.3”節(jié)不同發(fā)育時期的基因表達(dá)分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對實時熒光定量PCR試驗結(jié)果數(shù)據(jù)采用相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法2-ΔΔCt法進行相對表達(dá)量的計算，計算出平均表達(dá)量和標(biāo)準(zhǔn)差，借助SPSS 19.0軟件使用獨立樣本T檢驗和單因素方差分析對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 PtCTL5基因序列分析

PtCTL5基因全長1026 bp，包含1個732 bp的開放閱讀框，編碼243個氨基酸(圖1)。預(yù)測其帶有負(fù)性電荷的氨基酸殘基為20個(Asp+Glu)，帶有正電荷的氨基酸殘基為15個(Lys+Arg)。

用ExPASy-ProtParam tool 預(yù)測其編碼的蛋白相對分子質(zhì)量為26 000,等電點為6.09，不穩(wěn)定系數(shù)為44.42，為不穩(wěn)定蛋白，蛋白濃度為1 mg/mL時消光系數(shù)為2.352，脂肪族系數(shù)為67.74。借助Pfam數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析PtCTL5氨基酸結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果顯示，該氨基酸序列具有C-型凝集素家族典型特征(圖2)，包括在N末端有1個16個氨基酸的信號肽，第81～229個氨基酸為C-型凝集素特有的碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域(CRD)，第103～133個氨基酸為FNI結(jié)構(gòu)域，且CRD內(nèi)含有6個半胱氨酸參與反應(yīng)，分別為Cys81、Cys104、Cys119、Cys200、Cys220、Cys228。PtCTL5的CRD結(jié)構(gòu)域中決定糖結(jié)合特異性的基序是“QPD”(Gln-Pro-Asp)，能夠與半乳糖和半乳糖的衍生物結(jié)合。

2.2 PtCTL5氨基酸序列的相似性及進化樹分析

Blast比對結(jié)果顯示，三疣梭子蟹CTL5氨基酸序列與克氏原螯蝦ProcambarusclarkiiCTL的一致性最高，為41.84%。

利用MEGA6.0軟件對三疣梭子蟹C-型凝集素CTL5和其他甲殼動物CTL的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹分析，由圖3可知，三疣梭子蟹CTL5先單獨聚為一支，隨后與日本對蝦CTL1和凡納濱對蝦CTL6聚為一支，表明其親緣關(guān)系較近，而與三疣梭子蟹的另外4種C-型凝集素CTL1、CTL2、CTL3、CTL4距離較遠(yuǎn)，即親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 PtCTL5基因在發(fā)育各時期的表達(dá)

三疣梭子蟹幼體不同發(fā)育階段CTL5的表達(dá)情況如圖4所示。從圖4可見：PtCTL5在溞狀幼體Ⅲ期的相對表達(dá)量最高，大眼幼體期次之，溞狀幼體Ⅱ期再次之，且均顯著高于卵裂期(P<0.05)，PtCTL5基因在溞狀幼體Ⅲ期的相對表達(dá)量是卵裂期的28.4倍；從卵裂期到幼蟹Ⅰ期，PtCTL5基因的相對表達(dá)量顯著上調(diào)，雖然在眼點期、心跳期和溞狀幼體Ⅳ期時的表達(dá)量較前一時期有明顯的下降，但隨著三疣梭子蟹幼體的發(fā)育，PtCTL5基因的相對表達(dá)量總體呈上升的趨勢。

2.4 PtCTL5基因在不同組織中的表達(dá)

以β-actin為內(nèi)參基因，利用q-PCR技術(shù)對PtCTL5基因在三疣梭子蟹不同組織中的表達(dá)分布進行檢測。從圖5可見，PtCTL5在三疣梭子蟹9個組織中均有表達(dá)，其中，PtCTL5在血細(xì)胞中的相對表達(dá)量最高，肝胰腺次之，在胸腺中相對表達(dá)量最少。

2.5 PtCTL5基因在副溶血弧菌和WSSV感染后的表達(dá)響應(yīng)

利用qPCR技術(shù)對病原感染后PtCTL5基因在血細(xì)胞和肝胰腺中的表達(dá)情況進行檢測。從圖6可見：注射副溶血弧菌感染后，PtCTL5在肝胰腺和血細(xì)胞中的相對表達(dá)量均呈一定程度的下調(diào)，分別于12、24 h達(dá)到最低值，均于48 h后開始上調(diào)，72 h時達(dá)到峰值且均極顯著高于生理鹽水對照組(P<0.01)，分別為對照組的20.9、5.6倍；注射WSSV感染后，PtCTL5在肝胰腺中的相對表達(dá)量在12 h達(dá)到峰值，為對照組的9.1倍，12 h后逐漸下降，72 h后達(dá)到最低值且與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)，而在血細(xì)胞中0～72 h的表達(dá)量總體呈上升趨勢，72 h時達(dá)到峰值且極顯著高于對照組(P<0.01)，為對照組的48.9倍。

3 討論

3.1 PtCTL5的序列特征

C-型凝集素在甲殼動物的先天免疫中發(fā)揮著重要作用[16]。C-型凝集素一般通過EPD和QPD基序參與糖基分子的結(jié)合，EPD可以識別甘露糖，而QPD可以識別半乳糖。三疣梭子蟹CTL5與許多甲殼動物C-型凝集素的結(jié)構(gòu)相似，含有1個CRD結(jié)構(gòu)域、1個QPD基序和6個保守的半胱氨酸殘基，表明其應(yīng)為半乳糖結(jié)合型凝集素[17-19]。本研究中，對三疣梭子蟹CTL5和其他甲殼動物C-型凝集素的糖識別結(jié)構(gòu)域(CRD)進行了系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三疣梭子蟹CTL5與日本對蝦CTL1、凡納濱對蝦CTL6氨基酸序列在進化上距離最近，而與三疣梭子蟹中另外4種C-型凝集素氨基酸序列在進化上距離較遠(yuǎn)，這表明，CTL5是三疣梭子蟹C-型凝集素家族的新成員。

3.2 PtCTL5 基因的免疫防御機制

本研究中實時熒光定量結(jié)果顯示，PtCTL5在胚胎及幼體發(fā)育過程中均可檢測到，推測其在三疣梭子蟹的胚胎和幼體發(fā)育中發(fā)揮一定的功能。在胚胎發(fā)育階段，PtCTL5的表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢，原腸期達(dá)到峰值且顯著高于卵裂期(P<0.05)。在溞狀幼體發(fā)育階段，PtCTL5的表達(dá)量在溞狀幼體Ⅲ期達(dá)到峰值。特別指出，該基因在幼體發(fā)育不同時期的相對表達(dá)量與三疣梭子蟹人工育苗過程中幼體的死亡規(guī)律相關(guān)。如心跳期、溞狀幼體Ⅳ期死亡率較高，而該時期PtCTL5基因的表達(dá)量也相應(yīng)較低[19]。推測該基因在胚胎及幼體不同發(fā)育期，可能發(fā)揮了一定的維持正常發(fā)育或抵御外界病原感染的功能。

本研究中，組織表達(dá)分布結(jié)果顯示，CTL5基因在三疣梭子蟹9個組織中均具有分布,其中，在血細(xì)胞中表達(dá)量最高，肝胰腺中次之，這與對其他甲殼動物C-型凝集素基因的研究結(jié)果相似。如三疣梭子蟹CTL1和CTL4基因也在肝胰腺中表達(dá)量最高[9,12]。血細(xì)胞和肝胰腺是三疣梭子蟹重要的免疫組織，CTL5基因在這兩個免疫組織中高表達(dá)，暗示其可能發(fā)揮重要的免疫功能[8,20]。

為進一步研究PtCTL5在先天免疫中的作用，本試驗中利用副溶血弧菌和WSSV兩種病原對三疣梭子蟹進行了人工感染試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種病原感染后PtCTL5基因的表達(dá)模式相比對照組均呈現(xiàn)顯著的變化，其中副溶血弧菌感染組整體呈先下調(diào)后上調(diào)的表達(dá)趨勢，而WSSV感染組整體呈現(xiàn)上調(diào)的表達(dá)趨勢。之前的研究結(jié)果表明，甲殼類動物C-型凝集素在受到不同病原感染刺激后會產(chǎn)生不同的免疫應(yīng)答。例如，日本沼蝦MacrobrachiumnipponenseCTL可以加速金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus和副溶血弧菌的清除；中國對蝦重組CTL對部分革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有鈣依賴性凝集活性[3,21]。本試驗中，根據(jù)病原感染后PtCTL5基因的應(yīng)答情況，推斷該基因在三疣梭子蟹對細(xì)菌和病毒的免疫防御過程中也發(fā)揮了重要的作用。另外，本研究中觀察到病原感染后該基因在兩個不同的免疫組織中的表達(dá)規(guī)律不同，表明其在不同免疫組織中發(fā)揮功能的通路可能也不同，需要后續(xù)進一步解析其潛在的分子機制。

綜上所述，本研究中成功克隆了三疣梭子蟹CTL5 cDNA序列全長，發(fā)現(xiàn)該基因在三疣梭子蟹各組織和幼體發(fā)育不同階段均有表達(dá)，且初步探究了該基因在三疣梭子蟹受到WSSV和副溶血弧菌感染后血細(xì)胞和肝胰腺中的表達(dá)模式，進一步證實了該基因在三疣梭子蟹免疫應(yīng)答中發(fā)揮了一定的作用，本研究結(jié)果可為深入探究C-型凝集素在三疣梭子蟹中的免疫防御機制提供數(shù)據(jù)支持。