劉 軍，魯緒強(qiáng)，時(shí)玉強(qiáng)，李 敏，尹成文，劉代成

(1.山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司，山東 禹城 251200； 2.山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250014)

大豆異黃酮有抗癌、抗心血管疾病、抗骨質(zhì)疏松、抗老年性癡呆、抗機(jī)體免疫力下降、抗菌消炎、抗衰老等生理功能，是天然的植物保健品[1-4]。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2001年全球的大豆異黃酮需求量是1 500 t，而每年的實(shí)有產(chǎn)量只有500 t[5]。2001年至今，雖然未見(jiàn)全球大豆異黃酮需求量市場(chǎng)預(yù)測(cè)的報(bào)道，但從國(guó)內(nèi)外大豆異黃酮的研究來(lái)看，科學(xué)研究越來(lái)越深入，應(yīng)用面不斷擴(kuò)展，其需求量逐年增加，供需差距會(huì)越來(lái)越大。大豆異黃酮的提取原料主要為脫脂豆粕[4，6-8]、大豆胚[9]、大豆[1,10]和豆芽[10]，生產(chǎn)上以脫脂豆粕為主，可用于生產(chǎn)大豆異黃酮的其他資源極少，是導(dǎo)致大豆異黃酮產(chǎn)量少、供需矛盾突出的重要原因。

大豆分離蛋白的生產(chǎn)以低溫脫脂豆粕為原料，低溫脫脂豆粕經(jīng)堿溶酸沉分離出蛋白的同時(shí)，排出大豆乳清水。大豆乳清水中經(jīng)3次添加聚合氯化鋁和聚丙烯酰胺絮凝后，鼓氣成一、二、三級(jí)泡沫，再經(jīng)捕沫、破泡和板框過(guò)濾得浮渣，其中一級(jí)浮渣富含大豆異黃酮。由于一級(jí)浮渣中所含聚丙烯酰胺和聚合氯化鋁有一定毒性，只能作為廢物燃燒。將大豆乳清水一級(jí)浮渣中含有的大豆異黃酮提取純化成大豆異黃酮產(chǎn)品，不僅可解決大豆異黃酮原料短缺問(wèn)題，還可變廢為寶獲得良好經(jīng)濟(jì)效益。

大豆乳清水一級(jí)浮渣是制備大豆異黃酮的新原料，至今未有學(xué)者研究。本文致力于建立從大豆乳清水一級(jí)浮渣中提取、分離、純化大豆異黃酮的工藝，為大豆乳清水一級(jí)浮渣的回收利用提供新方向。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大豆乳清水一級(jí)浮渣粉(SP)，山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司；二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙酸、磷酸鈣、碳酸氫鈣、乙醇，分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司；黃豆黃苷、大豆苷、染料木苷、黃豆黃素、大豆苷元、染料木素，色譜純，北京索萊寶科技有限公司。大孔樹(shù)脂ADS-21、AB-8、HPD600、D4020、D4006，西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司。

HH-S型恒溫水浴鍋； TLC scanner III型薄層掃描儀(WINCATS1.4.4軟件)，瑞士CAMAG公司；JY02G型凝膠成像儀；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，EYELA株式會(huì)社；GF254硅膠板(10 cm×20 cm)；JM膠體磨。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆異黃酮的提取

將一定量的大豆乳清水一級(jí)浮渣粉(SP)用體積分?jǐn)?shù)40%～95%的乙醇(料液比1∶5)在40～100℃膠體磨提取0.75 h，過(guò)濾得濾液，重復(fù)提取1次。合并2次濾液，于35～70℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后得粉狀物。

1.2.2 大豆異黃酮的分離

將1.2.1提取的粉狀物和一定量的Ca3(PO4)2以及Ca(HCO3)2加入蒸餾瓶中，按料液比1∶20加入95%乙醇，沸騰回流1 h后過(guò)濾。上清液于35～70℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后得膏狀物。

1.2.3 大豆異黃酮的純化

1.2.3.1 大孔樹(shù)脂的選擇

大孔樹(shù)脂預(yù)處理：將大孔樹(shù)脂ADS-21、HPD600、D4006、D4020、AB-8均置于95%乙醇中浸泡24 h以上(中間攪拌數(shù)次，并更換一次浸泡液)。

樹(shù)脂的選擇：取2.0 g濕樹(shù)脂，將160 mg 大豆異黃酮超聲溶解于50 mL水中后倒入其中。室溫下振蕩吸附24 h，測(cè)其上清液中的大豆異黃酮濃度，計(jì)算樹(shù)脂吸附大豆異黃酮的質(zhì)量及吸附率。濾除上清液，去離子水洗滌樹(shù)脂，過(guò)濾后加入50 mL 95%乙醇，室溫下振蕩解吸24 h，測(cè)其解吸液中大豆異黃酮含量，計(jì)算大豆異黃酮的解吸量和解吸率。

1.2.3.2 大孔樹(shù)脂純化大豆異黃酮

大孔樹(shù)脂按1.2.3.1處理后，取40 g濕大孔樹(shù)脂進(jìn)行濕法裝柱(3 cm×30 cm)，不超過(guò)柱體積的1/3，保持大孔樹(shù)脂一直浸泡于溶液中，防止空氣進(jìn)入其中。2 BV去離子水沖洗乙醇，向柱面加入分離制備的膏狀物3.05 g。用4～8 BV去離子水洗脫膏狀物中水溶性雜質(zhì)后，用2 BV 95%乙醇進(jìn)行洗脫，先流出的淡黃色液體棄掉，保留深黃色洗脫液，再加8～12 BV 95%乙醇直到深黃色帶全部洗脫出。將所得洗脫液在57℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇得大豆異黃酮結(jié)晶。

1.2.4 大豆異黃酮含量的測(cè)定

樣品液的配制：用乙酸乙酯分別將0.32 g樣品(包括提取物、分離的膏狀物以及純化的結(jié)晶)定容至3 mL，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：用甲醇分別將黃豆黃苷、大豆苷、染料木苷、黃豆黃素、大豆苷元定容為1.58、1.18、1.09、0.32、1.38 mg/mL。用乙酸乙酯將染料木素定容為1.04 mg/mL。

按參考文獻(xiàn)[11]的方法檢測(cè)樣品中大豆異黃酮含量，將大豆異黃酮苷元及苷總量作為大豆異黃酮的量。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆異黃酮提取條件的選擇

常用的提取大豆異黃酮的溶劑為乙醇、甲醇和丙酮等。從毒性、經(jīng)濟(jì)成本以及生產(chǎn)要求考慮，決定使用乙醇為提取溶劑?，F(xiàn)有研究亦大多采用乙醇作為提取溶劑。按1.2.1對(duì)SP中大豆異黃酮進(jìn)行提取，探討了提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大豆異黃酮提取量的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，在料液比1∶5、膠體磨提取時(shí)間0.75 h、提取2次、提取溫度60～70℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)，大豆異黃酮的提取量最大。按照該提取方法重復(fù)3次，結(jié)果穩(wěn)定。每100 g SP可提取干物質(zhì)20 g，其中含415 mg 大豆異黃酮，大豆異黃酮含量為2.08%(干基)，雜質(zhì)較多。

表1 提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大豆異黃酮提取量的影響

前人以脫脂豆粕、大豆和豆芽為原料提取大豆異黃酮所用乙醇的有效體積分?jǐn)?shù)為50%～80%，料液比為1∶(3～50)，提取溫度為50～80℃，提取次數(shù)為1～3次，提取時(shí)間為1～9 h[1,3-4,6,10,12-16]。 據(jù)長(zhǎng)期生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，乙醇的用量大會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)成本高、投資大，提取次數(shù)多、提取時(shí)間長(zhǎng)會(huì)影響生產(chǎn)周期和產(chǎn)量。經(jīng)多次預(yù)試驗(yàn)，我們認(rèn)為膠體磨可代替攪拌，且效果比攪拌更均勻。本文采用膠體磨提取的方法，以60%乙醇為提取溶劑，料液比1∶5，提取溫度60～70℃，提取時(shí)間0.75 h，提取2次，可以把SP中的大豆異黃酮提取出來(lái)。

2.2 大豆異黃酮分離條件的選擇

按1.2.2方法，向20 g SP提取物中加入95%乙醇及一定量的Ca3(PO4)2和Ca(HCO3)2進(jìn)行沸騰回流1 h，濾液濃縮成膏狀物。Ca3(PO4)2和Ca(HCO3)2添加量對(duì)大豆異黃酮含量的影響見(jiàn)表2。

表2 Ca3(PO4)2和Ca(HCO3)2添加量對(duì)大豆異黃酮含量的影響

由表2可知，20 g SP提取物，加20 g Ca3(PO4)2和8 g Ca(HCO3)2回流去雜效果最好，可得膏狀物3.05 g，大豆異黃酮含量約為13.6%(干基)，大豆異黃酮在去雜過(guò)程中基本無(wú)損失。

關(guān)于乙醇提取的大豆異黃酮粗提物去雜分離，董文賓等[14]采用酸解法，用0.2 mol/L HCl在料液比1∶6、85℃下酸解2 h，可使大豆異黃酮糖苷轉(zhuǎn)為苷元，并沉淀出部分雜質(zhì)。高榮海等[6]對(duì)乙醇提取濃縮物采用等電點(diǎn)沉淀除蛋白的方法，用4 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4～4.5，然后離心沉降除去蛋白質(zhì)。袁建等[17]將大豆異黃酮提取液濃縮后，向濃縮液中加入2 mol/L HCl調(diào)至等電點(diǎn)，經(jīng)離心除去上層漂浮物和下層沉淀，清液調(diào)至中性后超濾除去蛋白。李文亮[12]將乙醇提取液濃縮后采用酸解的方法除雜，用0.1 mol/L HCl，在料液比1∶5、40℃下酸解3 h，分解率為5.25%。牛新春[13]對(duì)大豆異黃酮提取液離心后采用超濾方法分離雜質(zhì)，膜截留相對(duì)分子質(zhì)量10 kDa，過(guò)膜壓力137.9 kPa，過(guò)膜溫度40℃，溶液質(zhì)量濃度0.25～0.37 mg/mL，純度比超濾前提高26.1%。胡衛(wèi)新等[15]對(duì)大豆異黃酮提取液加0.03 g/mL ZnCl2后，靜置分層，鹽析沉淀蛋白，上清液在4 000 r/min離心15 min，除雜效果較好。上述除雜方法均效果良好。但本文對(duì)酸解、調(diào)節(jié)等電點(diǎn)、離心沉淀等方法預(yù)試驗(yàn)后未獲得良好效果(該試驗(yàn)數(shù)據(jù)未列入本文)，這可能與本文所使用的新原料SP有關(guān)。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)明確SP提取物中的雜質(zhì)主要是蛋白、多糖、油脂、脂肪酸等，油脂、蛋白、多糖在乙醇中溶解性低，可被Ca3(PO4)2吸附和沉淀，羧酸類物質(zhì)雖然在乙醇中溶解性高，但可以與Ca(HCO3)2結(jié)合成鈣鹽而沉淀。另外，這兩種添加物能夠保持大豆異黃酮的分子結(jié)構(gòu)。因此，這是一種適合于乙醇提取大豆乳清水一級(jí)浮渣粉中大豆異黃酮工藝的分離除雜的新方法。

2.3 大豆異黃酮的純化

2.3.1 大孔樹(shù)脂的選擇

大孔樹(shù)脂純化大豆異黃酮作為一個(gè)有效方法已被多次研究證實(shí)。高榮海等[6]對(duì)乙醇提取的大豆異黃酮粗提物等電點(diǎn)沉淀分離后經(jīng)大孔樹(shù)脂HPD600吸附洗脫、濃縮、丙酮精制，大豆異黃酮產(chǎn)品純度為70.56%。袁建等[17]對(duì)大豆異黃酮分離液用聚酰胺和大孔樹(shù)脂吸附洗脫、精制，產(chǎn)品純度為65.4%。李文亮[12]用S-8大孔樹(shù)脂對(duì)大豆異黃酮分離液進(jìn)行吸附洗脫，效果良好。牛新春[13]研究了大孔樹(shù)脂精制大豆異黃酮方法，比較了AB-8、D-101、ADS-213型大孔樹(shù)脂的精制效果，認(rèn)為ADS-21效果最佳。潘廖明等[18]對(duì)9種大孔樹(shù)脂吸附大豆異黃酮的特性進(jìn)行了詳細(xì)研究，認(rèn)為L(zhǎng)SA-8有較好的選擇性和解吸能力，所得產(chǎn)品中大豆異黃酮含量可達(dá)57%，比原樣純度提高了4.8倍。蔡立等[3]研究了7種大孔樹(shù)脂對(duì)大豆異黃酮的吸附解吸效果，結(jié)果表明D4006和H103型大孔樹(shù)脂有較好的吸附解吸效果，3%大豆異黃酮樣品經(jīng)D4006型大孔樹(shù)脂吸附洗脫(洗脫劑為80%乙醇)后大豆異黃酮含量提高到30.58%。大豆乳清水一級(jí)浮渣粉是制備大豆異黃酮的新原料，其大豆異黃酮的提取分離工藝是一個(gè)新工藝，利用大孔樹(shù)脂吸附洗脫該樣品大豆異黃酮有很多不確定因素，因此必須探討所選擇大孔樹(shù)脂的吸附洗脫生產(chǎn)參數(shù)。本文按照1.2.3.1方法對(duì)ADS-21、AB-8、HPD600、D4020、D4006 5種大孔樹(shù)脂進(jìn)行了比較，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同類型大孔樹(shù)脂的吸附率、吸附量、解吸量及解吸率比較

由表3可知，5種大孔樹(shù)脂相比較，ADS-21對(duì)大豆異黃酮的吸附率、吸附量、解吸量最高，解吸率較高。所以，選擇ADS-21用于純化大豆異黃酮。

2.3.2 大孔樹(shù)脂ADS-21純化大豆異黃酮的結(jié)果

按照1.2.3.2方法，采用ADS-21大孔樹(shù)脂純化大豆異黃酮，得到的黃色結(jié)晶質(zhì)量為489.82 mg，大豆異黃酮含量為83.5%，為洗脫前膏狀物的6.14倍。試驗(yàn)結(jié)果良好，為SP制備大豆異黃酮提供了生產(chǎn)技術(shù)基礎(chǔ)。

3 結(jié) 論

本文以大豆乳清水一級(jí)浮渣粉(SP)為原料制備大豆異黃酮，選擇60%乙醇作提取溶劑，在料液比1∶5、提取溫度60～70℃下采用膠體磨提取2次，每次0.75 h，每100 g SP可提取干物質(zhì)20 g，其中大豆異黃酮含量為2.08%。該20 g提取物加20 g Ca3(PO4)2、8 g Ca(HCO3)2和400 mL 95%乙醇沸騰回流1 h，過(guò)濾濃縮后可得3.05 g膏狀物，大豆異黃酮含量為13.6%，除雜分離效果好。用大孔樹(shù)脂ADS-21對(duì)膏狀物吸附洗脫，濃縮得大豆異黃酮產(chǎn)品，含量為83.5%，為洗脫前膏狀物的6.14倍。整個(gè)提取、分離、純化工藝完善，所得大豆異黃酮純度較高，為以大豆乳清水一級(jí)浮渣粉作原料制備大豆異黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)指導(dǎo)。