李建鳳，黃茜，廖立敏，*

（1.果類廢棄物資源化四川省高等學(xué)校重點實驗室，四川內(nèi)江641100；2.內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川內(nèi)江641100）

杏鮑菇又名刺芹側(cè)耳，隸屬于擔(dān)子菌亞門，層菌綱，無隔擔(dān)子菌亞綱，傘菌目，側(cè)耳科，側(cè)耳屬[1-2]。杏鮑菇富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素及鈣、鎂、銅、鋅等多種營養(yǎng)成分，此外還含有多糖、多肽、酚類、黃酮類化合物等多種活性物質(zhì)，具有抗癌、降血脂、促進腸胃消化、防止心血管病等多種功效[3-4]，目前報道對杏鮑菇的研究側(cè)重在產(chǎn)品加工方面，杏鮑菇提取方面的研究尤其是黃酮化合物提取的研究還未引起足夠的重視[5-6]，由此開展超聲波輔助提取杏鮑菇中的黃酮研究。黃酮類化合物是廣泛存在于自然界的一大類化合物[7-9]，到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有5 000 多種植物中含有黃酮類和異黃酮類化合物，黃酮類化合物能夠抗心律失常和改善冠脈循環(huán)，黃酮類化合物也具有抗癌、防癌的作用。黃酮類化合物還能夠促進胰島B 細胞的恢復(fù)，降低血糖和血清膽固醇，改善糖耐量，調(diào)節(jié)對抗腎上腺素的升血糖作用[10-11]。但黃酮類化合物在人體不能直接合成，只能從食品中獲得，由此，黃酮的提取在現(xiàn)實中有重要的作用。目前，植物中黃酮提取方法有多種，用超聲波輔助提取黃酮類物質(zhì)，是目前比較新的方法。其原理主要是利用超聲波在液體中的空化作用加速植物有效成份的浸出提取。另外，還利用其次效應(yīng)，如機械振動、擴散、擊碎等，使其加速被提取成份的擴散[12]，利用超聲波輔助提取杏鮑菇中黃酮的方法可以用于現(xiàn)實生活。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

杏鮑菇：內(nèi)江市北京華聯(lián)超市；無水乙醇：成都金山化學(xué)試劑有限公司；去離子水（優(yōu)質(zhì)超純水機）：四川優(yōu)普超純科技有限公司；氫氧化鈉、三氯化鋁、亞硝酸鈉（均為分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司。

電子分析天平（JA2003A）：上海精天電子儀器有限公司；紫外可見分光光度計（UV-mini-1240）：島津制作所；手提式高速粉碎機（DFT-100）：溫嶺市林大機械有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9245A）、高功率數(shù)控超聲波清洗器（KQ-400KDB）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；低速大容器離心機（DTL-5-A）：上海安亭科技儀器有限公司；優(yōu)質(zhì)超純水機（UPT-Ⅱ-10T）：成都超純科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 杏鮑菇的預(yù)處理

將市售的新鮮杏鮑菇清洗干凈，手撕成小片，用干燥箱在60 ℃下干燥到恒重，將杏鮑菇放入高速粉碎機中粉碎3 min，制得杏鮑菇干粉，用塑料密封袋裝好，放入裝有干燥劑的罐子中備用。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：用分析天平精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.020 0 g，使用60%的乙醇溶液進行溶解，完全溶解后轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，用60%乙醇進行定容，即得到質(zhì)量濃度為400 μg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

測定波長的選擇：精確量取蘆丁對照液1.0 mL 于25 mL 比色管中，加入5%亞硝酸鈉1.0 mL，混勻，靜置6 min，再向其中加入10%硝酸鋁1.0 mL，混勻，靜置6 min，最后向其加入4%氫氧化鈉10.0 mL，用60%乙醇稀釋至刻度線，混勻，靜置15 min，等待顯色，用比色皿在300 nm～900 nm 測定顯色劑的吸收光譜，得到最大吸收波長為510 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別的精密的吸取上述的蘆丁試劑 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 到 25 mL 的比色管中，配置成 0.00、16.00、32.00、48.00、64.00 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)系列。以蘆丁空白試劑作參比，用1 cm 比色皿在波長為510 nm 處分別測定它的吸光度，然后以吸光度A作為它的橫坐標(biāo)，并以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C（單位μg/mL）作為它的橫坐標(biāo)[13]，然后用最小二乘法作線性回歸，則計算的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為C=0.010 07A+0.001 1，R2=0.999 7。

1.2.3 杏鮑菇黃酮的提取及測定

稱取1.000 0 g 杏鮑菇粉末于100 mL 干燥錐形瓶，加入一定量一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，用保鮮膜封住，在一定功率超聲波中提取一定的時間，溫度控制在60 ℃，將提取液轉(zhuǎn)移至離心管，在4 000 r/min 離心10 min，對沉淀及提取液進行分離，將所得的提取液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，用水定容至，搖勻，用吸量管移取1.0 mL 于25 mL 比色管中，按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法測定。

1.2.4 杏鮑菇黃酮提取率計算公式

當(dāng)比色管中的提取液顯色完全以后，以空白試劑蒸餾水為參比，測定其吸光度，通過所得的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程C=0.010 07A+0.001 1 和式（1）計算提取率。

式中：X 為杏鮑菇總黃酮得率，%；C 為杏鮑菇總黃酮的質(zhì)量濃度，μg/mL；N 為體積，mL；V 為稀釋倍數(shù)；m 為稱取杏鮑菇粉末質(zhì)量，g。

1.2.5 單因素試驗設(shè)計

固定超聲溫度為60 ℃的情況下，共考察分析了液料比、乙醇濃度、超聲功率、超聲時間4 個單因素對杏鮑菇黃酮提取率的影響。以液料比30 mL/g、乙醇濃度70%、超聲功率240 W、超聲時間30 min 為基礎(chǔ)，固定3 個條件，改變1 個條件，研究其對杏鮑菇黃酮提取率的影響。

1.2.6 正交試驗設(shè)計

通過對單因素試驗的數(shù)據(jù)的分析，選擇液料比、乙醇濃度、超聲功率、超聲時間4 項條件為提取因素，用來研究對杏鮑菇中黃酮含量的影響，各因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels orthogonal design

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

不同液料比對杏鮑菇黃酮提取率的影響如圖1。

圖1 液料比對提取的影響Fig.1 Effect of liquid-material ratio on extraction

溶劑量較小時，杏鮑菇粉末表面與少量溶劑產(chǎn)生濃度差，有一定的提取率。隨著溶劑量的增加，原料表面與溶劑的濃度差也相對增大，進而黃酮的提取率不斷提高，當(dāng)液料比到達30 mL/g 時，杏鮑菇黃酮的提取率到達最大值。在此溶劑量之后，提取率又出現(xiàn)下降趨勢，可能是原料與溶劑邊界層黃酮因濃度差而生的擴散推動力更大[14]，產(chǎn)生更多的雜質(zhì)，此時溶液的滲透壓對黃酮提取成負影響，因此選擇30 mL/g 為最佳液料比。不同乙醇濃度對杏鮑菇黃酮提取率的影響如圖2。

乙醇濃度較小時，杏鮑菇中黃酮提取的強度不夠，得到較小的提取率，隨著乙醇濃度的增加，杏鮑菇粉末中黃酮的提取率不斷增加，當(dāng)乙醇濃度到達70%時，杏鮑菇黃酮的提取率到達最大值。在乙醇濃度超過70%以后，黃酮的提取率出現(xiàn)逐漸降低的趨勢，分析其原因，黃酮是一種有一定極性的物質(zhì)，增加乙醇濃度時，乙醇水溶劑極性減弱，按照相似相溶原理，70 %乙醇的與黃酮能更好地相容[15]，當(dāng)乙醇濃度大于70 %時，乙醇水溶劑易溶出其他醇溶性物質(zhì)，影響提取，因此乙醇濃度選擇70%為最佳。不同超聲功率對杏鮑菇黃酮提取率的影響如圖3。

圖2 乙醇濃度對提取的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on extraction

圖3 超聲功率對提取的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction

由于超聲波輻射壓強主要會對原料產(chǎn)生空化作用，當(dāng)超聲功率強度較小時，對杏鮑菇細胞壁的破碎作用不夠，黃酮沒有完全溶出，提取率相對較小。隨著超聲功率的增加，提取率不斷上升，當(dāng)超聲功率到達360 W 時，杏鮑菇黃酮的提取率到達最大值。超聲功率過強，超聲波可能會降解杏鮑菇中的有效成分，并且此時溶劑溫度上升較快，高溫受熱使黃酮損失同時溫度升高使乙醇揮發(fā)[16]，考慮多種原因的影響，選擇最佳超聲功率為360 W。不同超聲時間對杏鮑菇黃酮提取率的影響如圖4。

超聲時間不夠時，杏鮑菇中黃酮沒有完全溶出，但隨著超聲時間的增加，杏鮑菇粉末中黃酮的提取率不斷增多，當(dāng)超聲時間到達30 min 時，杏鮑菇黃酮的提取率接近最大值。綜合考慮，隨著超聲時間繼續(xù)增長，杏鮑菇黃酮結(jié)構(gòu)容易被破壞，進而失去活性，影響提取，并影響最終濃度的測定[17]，而且超聲處理時間增多，超聲產(chǎn)生的噪音增加，還浪費提取時間，因此提取時間選擇30 min 時最佳。

圖4 超聲時間對提取的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction

2.2 正交設(shè)計試驗及結(jié)果分析

2.2.1 試驗安排及結(jié)果

選用L1（644）正交表安排試驗，得到不同水平下黃酮的提取率，分析黃酮提取的最佳工藝，各個因素對黃酮提取率的強弱影響，以及模型預(yù)測的提取率數(shù)值。試驗安排及結(jié)果見表2。

表2 L16（44）正交試驗安排及結(jié)果Table 2 L16（44）orthogonal experimental design and results

2.2.2 極差及方差分析

將表2 中數(shù)據(jù)進行極差分析，結(jié)果見表3。

由表3 可知，極差 D＞B＞A＞C，提取率受到各因素交叉影響的同時，也有著因素影響的強弱順序，超聲時間對黃酮提取率影響最為顯著，其次是乙醇濃度，再者是液料比、超聲功率。由表3 得出，不同水平情況中，料液比 k3＞ k4＞ k2＞k1，選擇 A3為最佳水平，乙醇濃度 k2＞ k3＞ k1＞k4，選擇 B2為最佳水平，超聲功率 k3＞ k4＞k2＞k1，選擇 C3為最佳水平，超聲處理時間 k3＞ k2＞ k4＞k1，選擇D3為最佳水平，可得到最佳水平組合為：液料比為30 mL/g，乙醇濃度為70%，超聲功率為360 W，超聲時間為30 min。將表2 中數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果見表4。

表3 正交試驗結(jié)果極差分析Table 3 Orthogonal experiment result range analysis

表4 正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of the orthogonal experience results

由表4 得出，D 的F 值最大，對杏鮑菇黃酮提取率影響最大；B 的F 值排第二，說明其對杏鮑菇黃酮提取率影響排第二；A 的F 值排第三、C 的F 值最小。以上說明影響次序依次為D＞B＞A＞C，方差分析所得出的因素影響強弱與極差分析所得出的結(jié)論相同，可雙重驗證超聲時間對黃酮提取率的影響明顯[18]。

2.2.3 數(shù)據(jù)建模分析

按照下列二次多項式模型將液料比、乙醇濃度、超聲功率、超聲時間，以及各因素的交叉乘積等影響因素作為自變量，黃酮提取率作為因變量，用普通多項式回歸方法，對試驗數(shù)據(jù)進行擬合。

式中：y 作為因變量是黃酮提取率；β0、βi、βii、βij是影響因素的系數(shù)；xi、xj作為各個影響因素是自變量。方程（2）即為描述因變量（黃酮提取率）y 與自變量（液料比、乙醇濃度、超聲功率、超聲時間一次方、二次方及其相互作用）的經(jīng)驗?zāi)Ｐ蚚19]。對式（2）進行分析，可以預(yù)測正交試驗的不同水平條件下杏鮑菇黃酮的提取率。

利用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 13.0[20]對試驗結(jié)果進行普通回歸分析，得杏鮑菇黃酮提取率的二次擬合模型回歸方程為：

式中：y 為黃酮提取率；x1、x2、x3、x4分別為液料比、乙醇濃度、超聲功率和超聲時間。該模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R 為0.934，標(biāo)準(zhǔn)誤差SD 為0.299，數(shù)據(jù)說明數(shù)學(xué)模型擬合程度較好。通過計算得知試驗擬合誤差小，并且數(shù)學(xué)模型具有較高的穩(wěn)定性，預(yù)測能力較強，可以利用此模型對杏鮑菇粉末中黃酮提取率進行分析和預(yù)測，模型[式（3）]對各提取條件下黃酮提取率的計算值見表2。為便于觀察，將計算值與試驗值相關(guān)圖繪于圖5，模型值誤差（Err）分布圖繪于圖6。

圖5 模型值與預(yù)測值相關(guān)圖Fig.5 Plot of Cal.values and experimental values

圖6 模型值殘差分布圖Fig.6 Residuals scattered between the Exp.and Cal.of model

圖5 顯示，全部模型計算值與正交得出的試驗值十分相近，同樣圖6 顯示所有樣本的誤差都分布在零附近，處于2 倍SD 以內(nèi)。說明杏鮑菇黃酮提取率的模型預(yù)測值與試驗值十分接近，誤差較小，此模型對黃酮提取率估計的準(zhǔn)確性較高，可以利用該模型對杏鮑菇黃酮提取進行分析并為試驗提供參考。利用上述模型對上述初步確定的提取條件下的黃酮提取率進行了預(yù)測，結(jié)果為2.23%，接近表2 中提取率最大值，說明正交試驗分析得出的最佳提取條件是基本正確的。

2.3 最優(yōu)條件的確定

正交試驗及模型分析，得出乙醇溶液為溶劑，超聲波輔助提取杏鮑菇黃酮的最合理提取工藝：液料比為30 mL/g、乙醇濃度為70%、超聲功率為360 W、超聲時間為30 min。為驗證提取工藝是否正確，在此試驗條件下做平行試驗3 次，得到杏鮑菇黃酮的提取率分別為2.28%、2.32%、2.38%，平均值為2.33%，試驗數(shù)據(jù)穩(wěn)定，重現(xiàn)性較好，具有一定的現(xiàn)實意義，黃酮的收率高，再次說明正交試驗得出的黃酮提取工藝是可取的。

3 結(jié)論

采用超聲波輔助提取杏鮑菇中的黃酮，分析液料比、乙醇濃度、超聲功率和超聲時間4 個單因素對黃酮提取率影響。通過正交設(shè)計試驗得到了超聲波輔助提取杏鮑菇黃酮的合理工藝為液料比30 mL/g、乙醇濃度70%、超聲功率360W、超聲時間30 min。在最佳提取下，得到的黃酮的最高得率為2.33%，工藝穩(wěn)定可行，具有一定的參考價值。