溫媛媛，楊志強(qiáng)，徐勇飛，錢立勇

（舟山醫(yī)院，浙江 舟山 316021）

含半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域的膜相關(guān)鳥苷酸激酶蛋白（CARMA）家族包括 CARMA1、CARMA2 和CARMA3（又稱“CARD10”）三個(gè)成員，CARMA 家族蛋白成員在人核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）激活中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[1]。CARMA蛋白在不同組織中表達(dá)各異，在病理狀態(tài)下CARMA3在卵巢癌等惡性腫瘤中呈高表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲關(guān)系密切[2]。金屬蛋白酶家族-9（MMP-9）的表達(dá)與許多腫瘤的惡性進(jìn)展、細(xì)胞轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)[3]。本研究檢測乳腺浸潤性導(dǎo)管細(xì)胞癌中CARMA3與MMP-9的表達(dá)，同時(shí)在乳腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CARMA3表達(dá)質(zhì)粒后觀察CARMA3與MMP-9的表達(dá)情況，并分析轉(zhuǎn)染后對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 選取本院2018年1-12月收治的90例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織石蠟標(biāo)本，并選取其癌旁正常乳腺組織作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞系：人正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A，人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7與MDA-MB-435，均為貼壁生長細(xì)胞系，且均接種在DMEM培養(yǎng)液 （含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）中，于37℃含5% CO2濕潤空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。SP免疫組織化學(xué)檢測試劑盒（中國福州邁新生物技術(shù)公司）；CARMA3抗體（Sigma），MMP-9 抗體（Cell Signaling），β-actin 抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；CARMA3表達(dá)質(zhì)粒 pCMV6-CARMA3 購于 OriGene （Rockville）；Lipofectamine 2000（Invitrogen）；RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒（TaKaRa），PCR引物合成與測序委托大連TaKaRa公司進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 組織標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定、石蠟包埋，制成4μm厚度切片。采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶SP法，按試劑盒說明書步驟進(jìn)行抗 CARMA3（1:200）、MMP-9（1:500）抗體免疫組織化學(xué)染色，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽性切片作為陽性對(duì)照，觀察CARMA3與MMP-9蛋白在乳腺組織中的表達(dá)。用半定量法評(píng)價(jià)CARMA3與MMP-9在腫瘤區(qū)域的免疫染色。各切片在光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞的百分比。CARMA3與MMP-9均以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色，兩者染色強(qiáng)度分為三個(gè)等級(jí):0級(jí)為陰性，1級(jí)為中等著色，2級(jí)為強(qiáng)著色；染色百分率分為4個(gè)等級(jí)：1級(jí)為1%～25%，2級(jí)為26%～50%，3級(jí)為51%～75%，4級(jí)為76%～100%。積分=染色強(qiáng)度等級(jí)×染色百分率等級(jí)，積分＜4判定為陰性或低表達(dá)，積分≥4為陽性或高表達(dá)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)將pCMV6-CARMA3質(zhì)粒導(dǎo)入乳腺癌細(xì)胞MCF-7構(gòu)建CARMA3過表達(dá)細(xì)胞系。具體步驟：對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞以5×105每孔的密度接種于6孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，陰性對(duì)照為空載體組，將20μg pCMV6-CARMA3、20μg空載體、10μg MMP-9 siRNA、10μg control siRNA分別于1.5mL雙無培養(yǎng)基室溫下混勻，取60μL脂質(zhì)體于1.5mL雙無培養(yǎng)基混勻，室溫孵育5分鐘，將稀釋后的質(zhì)粒與Lipofectamine2000混勻，室溫孵育30分鐘，將上述混合液加入待轉(zhuǎn)染細(xì)胞MCF-7中，6小時(shí)后換正常培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞，進(jìn)行下一步檢測。共轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3+MMP-9 siRNA，方法按上述步驟轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3，36小時(shí)后收集細(xì)胞檢測。實(shí)驗(yàn)分為pCMV6-CARMA3組、空載體組、control siRNA組、MMP-9 siRNA組和共轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3+MMP-9 siRNA組。

1.2.3 CARMA3與MMP-9蛋白的表達(dá) 采用Western blot法對(duì)比乳腺癌細(xì)胞系與乳腺正常上皮細(xì)胞系中CARMA3與MMP-9蛋白的表達(dá)。收集乳腺癌及乳腺正常上皮細(xì)胞，提取總蛋白，加樣，上樣蛋白量為60μg。聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫下5%正常小牛血清封閉2小時(shí)，加入一抗，一抗分別為兔抗人 CARMA3（1:200），山羊抗人MMP-9（1:1000）和鼠抗人 β-actin（1:200），4℃孵育過夜。然后加入二抗（1:2000）中，室溫孵育2小時(shí)，ECL發(fā)光。

1.2.4 CARMA3與MMP-9mRNA的表達(dá) 采用RT-PCR法檢測乳腺癌細(xì)胞與乳腺正常上皮細(xì)胞系中CARMA3與MMP-9 mRNA的表達(dá)。使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA后逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR引物經(jīng)在GeneBank上Blast比對(duì)后合成，以β-actin為內(nèi)對(duì)照。PCR引物分別為：（1）CARMA3：上游：5′-CCCCTAAGAGATCCTTCAGCAG-3′， 下游：5′-CCACACGCTGTCAGAGGATG-3′；（2）MMP-9：上游：5′-ACTTTGACAGCGACAAGAAGTG-3′，下游：5′-GGCACTGAGGAATGATCTAAGC-3′；（3）β-actin：上游：5′-AAATCGTGCGTGACATTAA-3′，下游：5′-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3′。 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后成像分析。

1.2.5 細(xì)胞增殖能力檢測 采用MTT法檢測各組細(xì)胞增殖能力。將各組細(xì)胞懸液分別接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔含1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)，每孔加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，加入DMSO，490nm波長下測定各孔吸收值，以不含細(xì)胞的等體積培養(yǎng)基作對(duì)照，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.6 細(xì)胞侵襲能力檢測 利用基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)（Transwell法）分析各組細(xì)胞的侵襲能力。在孔徑為8mm的24孔Transwell小室，上室中加入100μL預(yù)冷Matrigel基質(zhì)膠，下室中加入600μL含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染后24小時(shí)的細(xì)胞接種到人工基底膜室上部培養(yǎng)32小時(shí)，PBS清洗，甲醇固定，蘇木素染色，室溫干燥過夜。取下微孔膜，置載玻片上，顯微鏡下計(jì)數(shù)侵襲至濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)，每張濾膜隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野（×400），取平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用（±s）表示，采用 Spearman 等級(jí)相關(guān)分析CARMA3和MMP-9表達(dá)的關(guān)系，RTPCR、Western blot及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化表現(xiàn) SP染色后可見CARMA3、MMP-9在乳腺正常組織中呈低表達(dá)或不表達(dá)，但兩者在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中呈高表達(dá)，均定位于細(xì)胞質(zhì)。詳見圖1-4。

圖1 CARMA3在乳腺正常組織中呈低表達(dá)或不表達(dá)（SP×200）

圖2 MMP-9在乳腺正常組織中呈低表達(dá)或不表達(dá)（SP×200）

圖3 CARMA3在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中呈高表達(dá)，定位于細(xì)胞質(zhì)（SP×200）。

圖4 MMP-9在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中呈高表達(dá)，定位于細(xì)胞質(zhì)（SP×200）。

2.2 乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染后CARMA3和MMP-9的表達(dá) CARMA3 mRNA與蛋白在MDA-MB-435與MCF-7中表達(dá)均明顯高于乳腺正常上皮細(xì)胞系MCF-10A，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表 1、圖5。與空載體組相比，在MCF-7中轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3 48小時(shí)后，CARMA3、MMP-9的 mRNA與蛋白表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表 2、圖 5。

表1 CARMA3在不同乳腺細(xì)胞系的相對(duì)表達(dá)量（±s）

表1 CARMA3在不同乳腺細(xì)胞系的相對(duì)表達(dá)量（±s）

與MCF-10A細(xì)胞系比較*P＜0.05

細(xì)胞系 CARMA3 mRNA CARMA3蛋白MCF-10A 0.56±0.05 0.47±0.04 MCF-7 1.28±0.10* 1.06±0.09*MDA-MB-435 1.73±0.15* 1.48±0.13*

表2 MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3后CARMA3與MMP-9 的相對(duì)表達(dá)（±s）

表2 MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3后CARMA3與MMP-9 的相對(duì)表達(dá)（±s）

與空載體組比較*P＜0.05

M M P-9蛋白空載體組 0.9 5±0.1 1 1.0 8±0.1 0 1.1 5±0.4 3 1.0 8±0.3 8 p C M V 6-C A R M A 3 組 4.0 2±0.9 7*3.5 4±0.8 2*2.8 4±0.6 8*2.4 9±0.5 5*轉(zhuǎn)染分組 C A R M A 3 m R N A C A R M A 3蛋白M M P-9 m R N A

圖5 乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中過表達(dá)CARMA3可上調(diào)MMP-9表達(dá)。5A：CARMA3 mRNA在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7與MDA-MB-435中表達(dá)高于乳腺正常上皮細(xì)胞系MCF-10A；5B：CARMA3蛋白在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7與MDAMB-435中表達(dá)高于乳腺正常上皮細(xì)胞系MCF-10A；5C：與轉(zhuǎn)染空載體組相比，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3質(zhì)粒后CARMA3與MMP-9 mRNA表達(dá)均增加；5D：與轉(zhuǎn)染空載體組相比，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3質(zhì)粒后，CARMA3與MMP-9蛋白表達(dá)增加。

2.3 CARMA3、MMP-9表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞增殖的關(guān)系 在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中采用MMP-9 siRNA沉默MMP-9的表達(dá)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MMP-9 siRNA 48小時(shí)后，MMP-9 mRNA與蛋白表達(dá)在MMP-9 siRNA組表達(dá)較control siRNA組下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表 3、圖 6A-6B。 將MCF-7細(xì)胞分成兩組，一組共轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3與MMP-9 siRNA，一組單獨(dú)轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3，共轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3+MMP-9 siRNA組MMP-9 mRNA與蛋白表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表 4、圖 6C-6D。 與空載體組相比，MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3 3-5天后其增殖能力增加；MCF-7細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3與MMP-9 siRNA 3-5天后，與轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3組相比細(xì)胞增殖能力下降；與control siRNA組、MMP-9 siRNA組相比增殖能力無明顯差別，詳見圖6E。

圖6 乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中過表達(dá)CARMA3可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖。6A：與control siRNA組相比，MCF-7中轉(zhuǎn)染MMP-9 siRNA后MMP-9 mRNA表達(dá)減弱；6B：與control siRNA組相比，MCF-7中轉(zhuǎn)染MMP-9 siRNA后MMP-9蛋白表達(dá)減弱；6C：與單獨(dú)轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3質(zhì)粒相比，MCF-7中共轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3與MMP-9 siRNA后，MMP-9 mRNA表達(dá)減弱；6D：與單獨(dú)轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3質(zhì)粒相比，MCF-7中共轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3與MMP-9 siRNA后，MMP-9蛋白表達(dá)減弱；6E：與單獨(dú)轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3質(zhì)粒相比，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中共轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3與MMP-9 siRNA 3-5天后，乳腺癌細(xì)胞增殖能力減弱。

表3 MMP-9 mRNA與蛋白的相對(duì)表達(dá)量（±s）

表3 MMP-9 mRNA與蛋白的相對(duì)表達(dá)量（±s）

與control siRNA組比較*P＜0.05

組別 MMP-9 mRNA MMP-9蛋白control siRNA 組 1.78±0.48 1.56±0.43 MMP-9 siRNA 組 0.31±0.05* 0.28±0.06*

表4 CARMA3、MMP-9的mRNA與蛋白在MCF-7各轉(zhuǎn)染組中的相對(duì)表達(dá)量（±s）

表4 CARMA3、MMP-9的mRNA與蛋白在MCF-7各轉(zhuǎn)染組中的相對(duì)表達(dá)量（±s）

與pCMV6-CARMA3組比較*P＜0.05

M M P-9蛋白p C M V 6-C A R M A 3 組4.5 6±0.9 1 4.0 5±0.6 8 2.6 4±0.4 3 2.0 4±0.4 0 p C M V 6-C A R M A 3+M M P-9 s i R N A組 3.9 2±0.9 5 3.6 7±0.5 9 0.5 9±0.0 9*0.5 5±0.0 5*轉(zhuǎn)染組別 C A R M A 3 m R N A C A R M A 3蛋白M M P-9 m R N A

2.4 CARMA3、MMP-9表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的關(guān)系 轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3組與空載體組比較，通過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3組相比，共轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3與MMP-9 siRNA后通過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與control siRNA組比較，轉(zhuǎn)染MMP-9 siRNA后通過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 詳見表 5、圖 7-8。

圖7 顯微鏡下各組侵襲的乳腺癌細(xì)胞數(shù)（×400）。7A：空載體組；7B：pCMV6-CARMA3組；7C：pCMV6-CARMA3+MMP-9 siRNA 組；7D：MMP-9 siRNA 組；7E：control siRNA 組。

圖8 各組侵襲的乳腺癌細(xì)胞數(shù)比較

表5 各組穿透基質(zhì)膠細(xì)胞個(gè)數(shù)（±s）

表5 各組穿透基質(zhì)膠細(xì)胞個(gè)數(shù)（±s）

與空載體組比較△P＜0.01；與pCMV6-CARMA3組比較#P＜0.01；與 control siRNA 組比較 *P＜0.05。

穿透個(gè)數(shù)空載體組 1 4 5.0±1 9.0 p C M V 6-C A R M A 3 組 3 8 9.0±2 8.0△p C M V 6-C A R M A 3+M M P-9 s i R N A 組 1 6 4.0±1 6.0#M M P-9 s i R N A 組 3 4.0±8.0*c o n t r o l s i R N A 組 1 5 2.0±1 7.0組別

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，CARMA3在許多腫瘤發(fā)生中起重要作用，且CARMA3高表達(dá)與腫瘤高TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ki67增殖指數(shù)密切相關(guān)，CARMA3可通過NF-κB調(diào)控Cyclin D1來促進(jìn)細(xì)胞增殖[4]。CARMA3在腎細(xì)胞癌中表達(dá)高于配對(duì)的癌旁正常腎臟組織，且CARMA3高表達(dá)與腫瘤的高分期和低分化呈正相關(guān)、與腎細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后相關(guān)[5]。本組免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CARMA3在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中呈高表達(dá)，在乳腺正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)，在乳腺癌細(xì)胞中CARMA3蛋白和mRNA表達(dá)均高于乳腺正常上皮細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌[6]與胰腺癌[7]中沉默CARMA3表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞與胰腺癌細(xì)胞增殖與侵襲。在膽管細(xì)胞癌中抑制CARMA3表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖和侵襲[8]。本研究在乳腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CARMA3表達(dá)質(zhì)粒后發(fā)現(xiàn)乳腺癌侵襲能力增強(qiáng)，同時(shí)觀察到過表達(dá)CARMA3后乳腺癌細(xì)胞生長增殖能力均明顯提高。這些結(jié)果提示，CARMA3作為癌基因在乳腺癌惡性表型中發(fā)揮一定的作用。

MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族成員，能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原，在腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[9]。CARMA3可通過G protein-coupled受體來誘導(dǎo)NF-κB激活，參與調(diào)控MMP-9表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞侵襲[10]。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族參與了腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，NF-κB可通過上調(diào)一系列細(xì)胞增殖因子如Cyclin D1、c-myc和細(xì)胞凋亡抑制因子來促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡[11]。另外，NF-κB激活可通過上調(diào)MMP家族蛋白表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲[12]。本研究免疫組化發(fā)現(xiàn)，MMP-9蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中呈高表達(dá)。轉(zhuǎn)染CARMA3表達(dá)質(zhì)粒pCMV6-CARMA3后發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)CARMA3可上調(diào)MMP-9表達(dá)。本研究采用MMP-9 siRNA干擾MMP-9表達(dá)，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3相比，乳腺癌細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3與MMP-9 siRNA，其細(xì)胞增殖和侵襲力明顯減弱，這些結(jié)果提示CARMA3可通過上調(diào)MMP-9表達(dá)來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞侵襲。

綜上，CARMA3在乳腺癌惡性進(jìn)程中發(fā)揮一定作用，CARMA3可能通過調(diào)控MMP-9表達(dá)來影響乳腺癌的生物學(xué)行為。