張豪

（溫州市中心醫(yī)院，浙江 溫州325000）

熱休克蛋白90（HSP90）是一種分子伴侶，參與多種細胞功能和信號通路，并參與細胞的增殖、分化和凋亡[1]。有證據(jù)表明，HSP90的異常激活可促進癌癥的發(fā)展，并與腫瘤的侵襲、遠處轉移和免疫逃逸等惡性發(fā)展過程有關[2]。據(jù)報道，抑制HSP90能增強抗癌藥物誘導的侵襲性腫瘤細胞凋亡[3]。相關研究[4]為抑制HSP90作為肝細胞癌（HCC）的抗癌靶標提供了理論依據(jù)，但抑制HSP90與放射的聯(lián)合作用尚不明確。NVP-AUY922（AUY922）屬于間苯二酚異惡唑類似物，是HSP90有效的合成小分子抑制劑之一[4]。單一藥物AUY922具有抗多種腫瘤（包括甲狀腺癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌和結腸癌等）的作用[5-6]。體外實驗發(fā)現(xiàn)，AUY922具有放射增敏劑的作用[7]，本研究探討 HSP90抑制劑AUY922對肝癌細胞系HepG2的放射增敏作用及機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 肝癌細胞系HepG2（中國科學院上海細胞庫）、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM，美國 Gibco 公司）、AUY922（Novartis諾華公司）溶解于二甲基亞砜（DMSO，Sigma 公司）、Annexin VFITC、碘化丙啶（PI）細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術公司）、流式細胞儀（美國BECK-COULTER公司）、酶標儀（美國 BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組 肝癌細胞系HepG2于添加了10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基37℃、5% CO2加濕的培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，以70%～80%的融合率傳代培養(yǎng)，實驗都在指數(shù)生長期的細胞中進行。細胞照射采用醫(yī)科達直線加速器，射線能量為6MV，照射野面積20cm×20cm，源皮距100cm，劑量率為400cGy/min。將細胞分為對照組（DMSO 處理）、AUY922 組（IC20 濃度）、照射組（劑量照射6Gy）及AUY922+照射組（先用IC20濃度的AUY922處理24小時后用6Gy劑量照射）。

1.2.2 細胞毒性檢測 文獻[8]所述用細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）檢測AUY922對HepG2的細胞毒性，計算IC20（20%藥物抑制濃度）。HepG2細胞經胰蛋白酶消化后接種于96孔板中，設置 1、5、10、50和100nM濃度梯度處理AUY922細胞，以僅加入培養(yǎng)液進行對照。作用48小時后，每孔加入10μL含CCK-8工作液的無血清培養(yǎng)基，5% CO2、37℃孵育1小時，用酶標儀測450nm處的吸光度值。細胞增殖抑制率=（1-藥物組吸光度值／對照組吸光度值）×100%，以IC20時的藥物濃度作為后續(xù)實驗的藥物作用濃度。

1.2.3 放射增敏檢測 計數(shù)處于指數(shù)生長期的HepG2細胞，并鋪在10cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24小時細胞貼壁后添加AUY922繼續(xù)培養(yǎng)24小時，以0、2、4、6、8Gy 的劑量對照射細胞，24 小時后通過新鮮添加生長培養(yǎng)基除去藥物，隨后每7天補充1次。14天后甲醇／乙酸（3:1）固定，結晶紫染色，在倒置相顯微鏡下對克隆計數(shù)，克隆定義為包含至少50個細胞。集落形成率（PE）%=克隆數(shù)／接種細胞；細胞存活分數(shù)（SF）%=各照射劑量PE/未照射PE×100%，采用SPSS統(tǒng)計軟件的多靶單擊模型（SF=1-（1-e-D/D0）N）擬合細胞存活曲線，得出平均致死劑量（D0）、準閾劑量（Dq），計算放射增敏比（SER）=單純照射的Dq值/對照加藥的Dq值。

1.2.4 細胞凋亡檢測和細胞周期分析 HepG2細胞以每孔3×105個細胞的密度接種在6孔板中，貼壁生長24小時后將細胞按上述四組處理。（1）分離細胞，在PBS溶液中重懸，離心去除上清液，加入FITC Annexin V（5μL 儲備液/100μL 緩沖液）4℃避光孵育15分鐘加入PI（100ng/100μL緩沖液）輕輕混勻，4℃避光孵育5分鐘，流式細胞儀檢測細胞的凋亡。（2）細胞經PBS重懸、70%預冷的無水乙醇5mL混勻并置4℃環(huán)境中固定24小時，離心取細胞，經PBS洗滌并打散細胞團后用20μg/mL RNase-A溶液在37℃避光溫浴30分鐘，去除RNA，加入10μg/mL PI在37℃下處理2小時。采用流式細胞儀分析細胞周期。

1.2.5 標記物γ-H2AX的檢測 接種細胞在聚-L-賴氨酸（13.3 mg/mL）包被的的載玻片上，并在37°C，5% CO2溫育24小時，4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）固定15分鐘。用PBS洗滌后將細胞用0.5% Triton X-100透化10分鐘。然后用含3%牛血清白蛋白（BSA）的PBS封閉30分鐘，加入一抗 γ-H2AX（1∶250）4℃過夜，用 PBS 洗滌后與Alexa Flour 488 偶聯(lián)的二抗（1:300，Molecular Probes）在室溫下孵育1小時。將細胞在PBS中洗滌，蓋玻片用 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。 使用熒光共聚焦顯微鏡捕獲熒光圖像。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 細胞毒性作用 1、5、10、50、100nM 不同濃度AUY922作用于HepG2細胞48小時后的細胞抑制率分別為（5.61±1.45）%、（17.60±2.31）%、（27.36±3.56）%、（52.68±4.33）%、（69.00±4.23）%，提示抑制率呈藥物濃度依賴性；IC50為 49.3nM，IC20為6.3nM，將6.3nM作為后續(xù)實驗的藥物濃度。

2.2 放射增敏作用 克隆存活曲線如圖1所示，照射組和 AUY922+照射組 D0、Dq分別為 2.18、1.42和1.96、1.19，由Dq所得的SER為1.65。

圖1 AUY922對肝癌細胞放射增敏結果

2.3 細胞凋亡和周期 與對照組相比，AUY922組和照射組細胞凋亡增加，而AUY922+照射組的凋亡細胞率較其他三組增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖 2、表 1。與對照組相比，AUY922+照射組HepG2細胞在G2/M期表現(xiàn)出相對阻滯，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖3、表1。

表1 各組肝癌細胞凋亡率和細胞周期比較（±s）

表1 各組肝癌細胞凋亡率和細胞周期比較（±s）

與對照組比較*P＜0.05；與AUY922+照射組比較#P＜0.05

細胞周期組別G 0/G 1 S G 2/M對照組 2.4 4±0.9 5 4 9.5 7±7.2 9 3 3.3 3±3.2 0 1 8.0 3±1.2 5 A U Y 9 2 2 組 1 5.4 1±2.2 1*#4 2.4 7±4.0 1 2 3.0 7±2.9 0 3 3.9 0±2.2 0*#照射組 1 1.9 2±2.3 6*#5 8.4 7±5.6 0 1 3.4 7±5.2 6 2 7.2 0±2.2 1*#A U Y 9 2 2+照射組 3 6.3 7±1.6 7*4 0.8 7±4.2 5 1 1.4 0±4.1 0 4 2.6 3±2.3 5*細胞凋亡率（%）

圖2 各組肝癌細胞凋亡情況

圖3 各組細胞周期

2.4 雙鏈斷裂修復DSB的標記物γ-H2AX 對照組和AUY922組的細胞顯示出較低的DSB水平，與其他三組相比，AUY922+照射組細胞系在30分鐘和24小時都顯示出更高比例的γ-H2AX灶的細胞。詳見圖4。

圖4 各組不同時間免疫熒光下觀察γ-H2AX的形成

3 討論

肝癌組織中HSP90的表達明顯高于周圍組織，表明HSP90的高表達可能參與了肝癌的發(fā)生過程，抑制HSP90可能是治療肝細胞癌的一種有效策略[9]。多項研究表明，AUY922是有效的第三代HSP90抑制劑，在多種人類癌細胞中具有抗腫瘤活性。根據(jù)先前的報道，AUY922可以抑制各種類型腫瘤細胞的增殖，對腫瘤細胞具有毒性[4-5，10]，本研究顯示，AUY922以濃度依賴的方式抑制HepG2細胞增殖。最近還證實了HSP90抑制劑對肺癌、胃癌和口咽鱗狀細胞癌的放射增敏潛力[7，11]。本研究提示，使用HSP90抑制劑會降低HCC細胞系的克隆形成存活率，且對HCC細胞具有放射增敏作用。肝癌的一個重要特征是腫瘤可局部控制，如肝癌的放射治療[12]。然而HCC對常規(guī)分次放射具有相對的抵抗性，且受到正常肝組織毒性的限制[13]。因此，選擇性地增加肝癌細胞放射劑量是重要的研究領域。新一代HSP90抑制劑AUY922顯示出較強的放射增敏活性。

細胞凋亡與消除潛在的惡性細胞、增生和腫瘤進展有密切聯(lián)系。因此，促進細胞凋亡在抗癌作用中起著至關重要的作用。據(jù)報道，AUY922可誘導癌細胞凋亡[4]，本研究中HSP90抑制劑的治療使細胞凋亡增加。為了進一步探討AUY922誘導的放射致敏作用機制，本文觀察其對細胞周期的治療作用，結果表明，G2/M期細胞比例增加，與其他類型的癌癥研究一致[11]，這些研究表明，僅用AUY922治療即可導致癌細胞停滯在G2/M期，可能解釋了本研究出現(xiàn)放射增敏作用的原因與AUY922誘導肝癌細胞進入放射更敏感的G2/M期階段有關[11]，推測這些細胞可以表現(xiàn)出更高水平的輻射，誘發(fā)DNA損傷。DNA是放射治療殺傷腫瘤細胞的主要靶標，放射治療通過斷裂DNA雙鏈（DSB）發(fā)揮其抗癌作用，是最具毒性的DNA損傷之一，γ-H2AX是其主要的生物學標志物。本文采用免疫熒光觀察γ-H2AX灶形成指示DSB，結果提示，HSP90抑制劑誘導的放射增敏作用機制可能包括抑制DSB。同樣，Zaidi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HSP90抑制劑通過抑制DNA修復發(fā)揮放射增敏作用。

本研究證實HSP90抑制劑使肝癌細胞進入放射敏感性周期G/2M期并抑制其DNA修復，從而導致肝癌細胞系的強放射增敏作用，提示當HSP90抑制劑與放射治療策略性結合時，可以為肝癌的治療提供新的思路。