劉琴，張泉鵬，周亞平，孟興祥，成玉梅，施開(kāi)平，李國(guó)平，彭雅婷

（1.昆明市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，昆明 650401；2.云南省嵩明縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，嵩明 651700）

支原體舊稱霉形體，是一類沒(méi)有細(xì)胞壁、高度多形性、能通過(guò)濾菌器、可用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖的最小原核細(xì)胞型微生物，大小為0.1～0.3μm。支原體廣泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi)，能夠引起奶牛肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、生殖器官炎癥等，1961年首次在美國(guó)奶牛乳房炎中分離到支原體，在我國(guó)1983年首次報(bào)道了奶牛乳房炎乳中分離到支原體。支原體感染的乳房炎病程長(zhǎng)，治療費(fèi)用高。大腸桿菌乳房炎在臨床上很常見(jiàn)，主要是由于環(huán)境衛(wèi)生差、消毒不徹底以及擠奶操作不當(dāng)所造成。2019年5月，昆明市某奶牛場(chǎng)發(fā)生了一起乳房炎病例，共3頭發(fā)病，臨床表現(xiàn)為乳房腫硬、乳區(qū)發(fā)熱，乳汁黃色呈豆腐渣或絮狀。經(jīng)細(xì)菌分離鑒定和奶牛乳房炎四重PCR診斷為大腸桿菌和支原體混合感染?，F(xiàn)將其報(bào)告如下。

1 材料

1.1 病料

用無(wú)菌注射器抽取病牛乳房中乳汁，共3頭牛的3份患乳區(qū)混合樣品。

1.2 儀器

全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀（VITEK 2 COMPACT，法國(guó)梅里埃）、冷凍離心機(jī)（貝克曼）、熒光定量PCR儀（STEP ONE PLUS美國(guó)ABI，無(wú)Cy5熒光通道），生化培養(yǎng)箱（上海一恒）。

1.3 試劑

普通瓊脂培養(yǎng)基、血平皿、革蘭氏陰性生化鑒定卡（法國(guó)梅里埃）、革蘭氏陰性細(xì)菌藥敏卡片（法國(guó)梅里埃），4聯(lián)牛乳房炎病原菌核酸檢測(cè)試劑盒（含DNA提取試劑，深圳易瑞），革蘭氏染色液（環(huán)凱生物）。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離和革蘭氏染色鑒定

2.1.1 細(xì)菌培養(yǎng)

滅菌劃線法將乳汁分別接種于普通瓊脂平皿和血平皿上，37℃培養(yǎng)24～48h。

2.1.2 革蘭氏染色及鑒定

挑取典型菌落按照革蘭氏染色法進(jìn)行染色，鏡檢初步確定細(xì)菌的形態(tài)和革蘭氏陰性或陽(yáng)性。

2.2 細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)

將經(jīng)分離鑒定的可疑菌株用普通瓊脂平板純培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24h。無(wú)菌挑取純培養(yǎng)物混懸于3mL無(wú)菌生理鹽水（0.45%NaCl溶液）中，用比濁管配置相當(dāng)于與0.50～063麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?。按照全自?dòng)細(xì)菌鑒定儀操作說(shuō)明書(shū)對(duì)可疑菌落進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)。革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡為47種生化反應(yīng)，藥敏試驗(yàn)為18種常用抗生素和ESBL（產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶）。

2.3 乳汁核酸提取和PCR檢測(cè)

按照PCR檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取和熒光PCR檢測(cè)。4聯(lián)乳房炎試劑盒采用4重Q-PCR技術(shù)，通過(guò)PCR MIX金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、牛支原體、牛棒狀桿菌等4種病原菌檢測(cè)。金黃色葡萄球菌（Sau）報(bào)告熒光為FAM；無(wú)乳鏈球菌（Sag）報(bào)告熒光為JOE；牛支原體（Myb）報(bào)告熒光為ROX；牛棒狀桿菌（Cb）報(bào)告熒光為Cy5。由于熒光定量PCR儀（STEP ONE PLUS）無(wú)Cy5通道，用VIC通道替代。

反應(yīng)體系設(shè)為2 5 u L，反應(yīng)程序?yàn)椋喝ノ廴荆?0℃，3min）、預(yù)變性（95℃，3min）、擴(kuò)增（95℃，15s；60℃，40s），40個(gè)循環(huán)。

質(zhì)量控制：

陰性對(duì)照：PCR反應(yīng)液1的FAM通道、JOE通道、ROX通道、Cy5通道均無(wú)擴(kuò)增曲線，個(gè)別通道的陰性對(duì)照出現(xiàn)翹尾信號(hào)，Ct值≥35時(shí)，不影響結(jié)果判讀。

陽(yáng)性對(duì)照：PCR反應(yīng)液1的FAM通道、JOE通道、ROX通道、VIC通道均有擴(kuò)增曲線，Ct值均≤30。

結(jié)果判斷：Ct小于或等于36（無(wú)乳鏈球菌Ct小于或等于34）判為陽(yáng)性，Ct在36～38之間（無(wú)乳鏈球菌Ct在34～38）判斷為可疑，Ct大于38判為陰性。結(jié)果保留整數(shù)部分。

3 結(jié)果與討論

3.1 細(xì)菌分離及鑒定結(jié)果

經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)，普通瓊脂平板和血平皿上均長(zhǎng)出邊緣整齊，圓形，濕潤(rùn)、光滑、呈灰白色的菌落，血平皿無(wú)典型溶血。對(duì)分離到的9個(gè)菌株經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢發(fā)現(xiàn)均為短粗、兩端鈍圓的陰性桿菌。經(jīng)對(duì)該細(xì)菌采用革蘭氏陰性鑒定卡進(jìn)行自動(dòng)細(xì)菌鑒定，系統(tǒng)顯示該菌株為大腸桿菌（符合率達(dá)到99%）。大腸桿菌是奶牛乳房炎的主要病原菌之一，臨床上感染病例較普遍。葛影影等調(diào)查河南地區(qū)奶牛乳房炎的主要致病菌，分離到11種287株致病菌，其中大腸桿菌是主要致病菌之一，占總檢出數(shù)的5.57%[1]。廖智慧等從衡水地區(qū)不同的奶牛場(chǎng)采集60份患乳房炎奶牛奶樣，分離鑒定出20株大腸桿菌[2]。

3.2 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)鑒定結(jié)果

梅里埃全自動(dòng)藥敏試驗(yàn)鑒定結(jié)果顯示，ESBL陰性，對(duì)常用的頭孢類、氟喹諾酮、磺胺類、氨基糖苷類抗生素都較敏感，說(shuō)明該大腸桿菌菌株不產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶。這與其他報(bào)道的結(jié)果有差異，許有盼對(duì)乳房炎中得到的大腸桿菌藥敏結(jié)果顯示，對(duì)氟苯尼考、頭孢曲松、頭孢他啶、恩諾沙星4種藥物高度敏感；對(duì)新霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、阿莫西林、阿米卡星、青霉素、卡那霉素7種藥物耐藥[3]。武軍元等在新疆阿克蘇地區(qū)從患有乳房炎的奶牛病例中分離到的大腸桿菌，經(jīng)耐藥性檢測(cè)表明，對(duì)氨芐西林的耐藥性最高，達(dá)到了50%；對(duì)多西環(huán)素、四環(huán)素和鏈霉素的耐藥性次之，為40%；而對(duì)環(huán)丙沙星、阿米卡星、諾氟沙星則比較敏感[4]。廖智慧等的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，大腸桿菌對(duì)頭孢克肟、恩諾沙星、丁胺卡那、強(qiáng)力霉素4種藥物敏感，對(duì)其他藥物存在不同程度的耐藥性[2]。細(xì)菌的耐藥性與濫用抗生素有關(guān)，該大腸桿菌耐藥性不強(qiáng)的原因可能與該場(chǎng)建廠年限短、用藥比較規(guī)范有關(guān)。

3.3 熒光定量PCR診斷結(jié)果

經(jīng)對(duì)3份乳樣進(jìn)行DNA提取和PCR擴(kuò)增熒光檢測(cè)，四種細(xì)菌Ct結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 乳樣中四種細(xì)菌熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

從表1可見(jiàn)，1、2號(hào)樣品支原體Ct分別為27、24，3號(hào)樣品無(wú)支原體擴(kuò)增曲線，其他三種細(xì)菌未見(jiàn)擴(kuò)增曲線，判定為支原體感染。3號(hào)樣品未檢測(cè)到支原體原因可能是該牛發(fā)病較早，一直采用中藥制劑治療，奶牛已處于康復(fù)期。由于熒光定量PCR儀（STEP ONE PLUS）無(wú)Cy5通道，用VIC通道替代，陽(yáng)性對(duì)照Ct顯示為27，說(shuō)明有一定參考意義。支原體在環(huán)境中較普遍，是奶牛乳房炎常見(jiàn)的致病性微生物[5～8]。夏文華對(duì)甘肅省張掖市臨澤縣奶牛支原體感染情況調(diào)查顯示，奶牛血清樣品支原體平均陽(yáng)性率50.71%[9]。曾偉權(quán)在乳房炎臨床癥狀的奶牛中采集牛奶樣本，經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)和支原體培養(yǎng)、菌落形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)、特異性PCR鑒定和16SrRNA測(cè)序?qū)Ψ蛛x株進(jìn)行鑒定，證實(shí)為支原體乳房炎[10]。

3.4 用藥建議

細(xì)菌分離鑒定和熒光PCR診斷結(jié)果說(shuō)明，該乳房炎為支原體和大腸桿菌混合感染。結(jié)合藥敏試驗(yàn)的結(jié)果和支原體敏感的抗生素種類，推薦該場(chǎng)采用氟喹諾酮類抗生素等治療該乳房炎。由于牛支原體對(duì)大部分抗生素不敏感，大部分在體外藥敏結(jié)果中表現(xiàn)敏感的抗生素，在治療時(shí)效果均不理想，這也可能與奶牛血乳屏障阻礙了藥物進(jìn)入乳腺有關(guān)。彭清潔等認(rèn)為，支原體治療要對(duì)癥治療，如發(fā)熱可用安乃近、復(fù)方氨基比林等解熱藥；體質(zhì)弱的牛要補(bǔ)充能量和VC及復(fù)合VB、ATP等[6]。

4 結(jié)論

4.1 本例奶牛支原體乳房炎在云南系初次報(bào)道，原因可能是支原體細(xì)菌培養(yǎng)要求較高，采用常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)效果不理想，本試驗(yàn)采用了核酸診斷方法，大大提高了檢測(cè)靈敏度和特異性。

4.2 本病例奶樣中分離出大腸桿菌，且耐藥性不強(qiáng)，說(shuō)明系支原體乳房炎的繼發(fā)感染。大腸桿菌在牛體上及環(huán)境中廣泛存在，是條件性致病菌，當(dāng)奶牛抵抗力下降時(shí)容易引起疾病，因此要加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生的管理和乳房擠奶前后的藥浴。

4.3 由于本例乳房炎檢測(cè)時(shí)未準(zhǔn)備支原體的藥敏試驗(yàn)檢測(cè)卡，所以未進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，僅根據(jù)藥理學(xué)的特點(diǎn)推薦了用氟喹諾酮類抗生素治療該病。

4.4 今后要提高對(duì)該病的重視，開(kāi)展預(yù)防、診斷和治療方面的研究，以便更好地為奶業(yè)服務(wù)。