韓 雪,袁瑋瓊,武 藝,劉東偉,牟一晗,敖 璇,呂兆林

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083;2.北京林業(yè)大學(xué)公共分析測試中心,北京 100083;3.林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)

藍(lán)莓(Sementrigonellae)學(xué)名越桔,杜鵑花科越桔屬,是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的新興漿果[1-3],藍(lán)莓果營養(yǎng)豐富,富含花青甙、熊果甙、VE、VA等,故有“漿果之王”稱號[4-6]。有研究表明,藍(lán)莓具有多種保健功能,如改善視力、增強(qiáng)人體免疫力、預(yù)防心血管疾病、抗氧化、抗衰老、抑菌、抗癌等[7-8]。

藍(lán)莓出色的保健功能主要取決于其富含的花青素成分?；ㄇ嗨厥且环N次生代謝產(chǎn)物,是黃酮類化合物中最重要的種類[9-13]。它具有較強(qiáng)的抗氧化活性,可預(yù)防多種癌癥和動(dòng)脈內(nèi)斑塊的形成,也可降低心臟疾病的患病率,延緩器官老化。另外花青素可激活人體內(nèi)的免疫系統(tǒng),增強(qiáng)機(jī)體免疫力,防止免疫蛋白受自由基侵害,還具有減輕眼疲勞、提高夜間視力的功能[14-15]。因此,快速檢測藍(lán)莓果中復(fù)雜且未知花青素類化合物成為近年來的研究熱點(diǎn)。

有研究者利用紫外光譜(Ultraviolet visible spectrum,UV)測定藍(lán)莓中花青素的含量,這種方法只能測定花青素的總量,不能確定花青素結(jié)構(gòu)[16];也有學(xué)者將花青素提取物經(jīng)柱層析、制備色譜、大孔樹脂吸附等方法分離純化,再采用核磁共振法、紅外光譜法等之后利用儀器分析可以達(dá)到鑒定結(jié)構(gòu)的目的,此種研究手段的前處理過程復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、定量分析困難,且不容易得到微量及痕量級化合物的結(jié)構(gòu)信息[17-19]。目前,液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)被認(rèn)為是快速、準(zhǔn)確檢測花青素結(jié)構(gòu)及含量的優(yōu)良方法[20-24]。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)有兩大分類系統(tǒng),從質(zhì)譜的離子源類型劃分,可分為電噴霧離子源、大氣壓化學(xué)電離源、大氣壓光電離源和基質(zhì)輔助激光解吸電離源等;從質(zhì)譜的質(zhì)量分析器角度劃分,可分為四極桿、離子阱、飛行時(shí)間和傅立葉變換質(zhì)譜等[25]。其中飛行時(shí)間(Time-of-flight,TOF)與質(zhì)譜(Mass spectrometer,MS)聯(lián)用或與串聯(lián)質(zhì)譜儀聯(lián)用,可將TOF分離不同質(zhì)量分子的能力與MS的結(jié)構(gòu)表征能力有效地結(jié)合,是表征天然化合物結(jié)構(gòu)的有力工具[26]。近年來,液相色譜電噴霧離子源與混合離子阱和高分辨率飛行時(shí)間質(zhì)譜的聯(lián)用,已成功應(yīng)用于分離和表征多種化合物[27-28]。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn技術(shù),對埃利奧克(Elliott)、愛國者(Patriot)、北藍(lán)(Northblue)、北陸(Northland)、杜克(Duke)、藍(lán)豐(Bluecrop)6個(gè)品種藍(lán)莓中的花青素結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,利用紫外可見光譜及多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定6種藍(lán)莓花青素的結(jié)構(gòu),建立一種快速檢測花青素的方法,解決了花青素標(biāo)準(zhǔn)品難以獲得的問題,為鑒定不同品種藍(lán)莓中花青素的結(jié)構(gòu)差異,快速獲取藍(lán)莓中花青素的種類及結(jié)構(gòu)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)莓 丹東食品有限公司購入,品種分別為埃利奧克(Elliott)、愛國者(Patriot)、北藍(lán)(Northblue)、北陸(Northland)、杜克(Duke)、藍(lán)豐(Bluecrop);無水甲醇、鹽酸 分析純,北京化工廠;乙腈、甲酸 色譜純,美國賽默飛世爾科技有限公司。

HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn二極管陣列高效液相色譜-電噴霧離子阱-飛行時(shí)間串聯(lián)多級質(zhì)譜儀 日本島津公司;Zorbax SB C18柱、LXJ Ⅱ離心機(jī) 上海民用分析儀器廠;98-1-B型電子調(diào)溫電熱套 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)莓花青素的提取 采用劉亞等[15]的方法稍作改進(jìn)提取藍(lán)莓果中的花青素。準(zhǔn)確稱取2.0 g藍(lán)莓果泥置于圓底燒瓶中,按固液比1∶15 g/mL加入50%甲醇水溶液回流提取1 h,提取溫度為80 ℃,將提取液于8000 r/min下常溫離心10 min,收集上清液,用0.25 μm的微孔濾膜過濾,利用HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn對藍(lán)莓果實(shí)花青素的種類及結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.2.2 HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn分析

1.2.2.1 液相色譜條件 色譜柱:Zorbax SB C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm);流動(dòng)相組成:流動(dòng)相A為5%甲酸水溶液,流動(dòng)相B為乙腈;梯度洗脫程序:0 min,A:90%;0～10 min,A:80%;10～15 min,A:80%;15～25 min,A:50%;25～30 min,A:40%。檢測波長520 nm;流速1 mL/min;恒溫柱箱溫度30 ℃;進(jìn)樣體積5 μL;波長掃描210～700 nm。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件 采用正離子模式;電壓3.5 kV;CDL溫度200 ℃;加熱部件200 ℃;霧化氣(N2)1.5 L/min;干燥氣壓(N2)0.1 MPa。一級質(zhì)譜離子掃描范圍m/z 200～1500;二級質(zhì)譜離子掃描范圍m/z 100～1500;三級質(zhì)譜離子掃描范圍m/z 50～1500。使用自動(dòng)模式搜集數(shù)據(jù),氬氣作為碰撞氣體,二級和三級質(zhì)譜能量設(shè)置均為50%。

1.2.3 化合物鑒定 參考Lv等[26]的方法,通過HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn測試,獲取相關(guān)數(shù)據(jù),對6種藍(lán)莓提取液中的花青素結(jié)構(gòu)及種類進(jìn)行鑒定。

花青素組分在210～550 nm UV波長范圍內(nèi)存在兩種主要吸收,吸收帶Ⅰ為270～280 nm,吸收帶Ⅱ?yàn)?20～530 nm?；贒AD紫外光譜掃描,篩選出具有花青素特征吸收的化合物。

確定具有花青素UV特征光譜的組分對應(yīng)的母離子的準(zhǔn)確分子量。

通過Formula Predictor 4.2軟件檢索花青素化合物的分子式。為確保預(yù)測化合物的分子式準(zhǔn)確性,測量的分子離子與預(yù)測分子式之間的質(zhì)量差異應(yīng)低于5 ppm。

根據(jù)花青素化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律,確定組分的糖苷配基類型、糖基類型及糖基取代類型,從而推測出藍(lán)莓花青素結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定三次,采用Origin 8.5進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 六種藍(lán)莓花青素結(jié)構(gòu)分析

利用Formula Predictor 4.2軟件對6種不同品種的藍(lán)莓提取液中的花青素結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢索,得到5種不同的苷元結(jié)構(gòu),如下圖1所示。

圖1 五種游離花青素的分子結(jié)構(gòu)

2.1.1 以矢車菊素為苷元的花青素 矢車菊素(Cyanidin)在苷元上3、5、7、4′、5′位連接五個(gè)羥基而成,質(zhì)譜分析得到離子碎片基峰為m/z 287;6種藍(lán)莓中均鑒定出矢車菊素。

2.1.2 以花翠素為苷元的花青素 花翠素(Delphinidin)在矢車菊素的基礎(chǔ)上3′位多鏈接一個(gè)羥基,質(zhì)譜分析得到離子碎片基峰為m/z 303,特征離子包括m/z 262、m/z 172;6種藍(lán)莓中均鑒定出花翠素。在藍(lán)莓提取液中還測得兩種具有典型的花青素類化合物UV光譜圖的物質(zhì),分析這兩類化合物的MS及MS/MS數(shù)據(jù)。其中一種化合物與花翠素苷元的分子離子相比,其分子量相差大約為162,由Formula Predictor 4.2軟件推測該化合物與花翠素相差1個(gè)[C6H10O5]單糖單元,經(jīng)查閱文獻(xiàn)鑒定該花青素為花翠素-3-O-半乳糖配基[29],測得埃利奧特藍(lán)莓、北陸藍(lán)莓、杜克藍(lán)莓含有該類化合物。另一種化合物與花翠素的分子離子相比,其分子量相差大約為132,由軟件推測該化合物與花翠素相差1個(gè)脫水的[C5H8O4]單糖單元,經(jīng)查閱文獻(xiàn)得該花青素為花翠素-3-O-阿拉伯糖配基[29],測得含有該花青素的藍(lán)莓品種是埃利奧特、愛國者、北陸、藍(lán)豐。

2.1.3 以牽?；ㄉ貫檐赵幕ㄇ嗨?牽?；ㄉ?Petunidin)在苷元上3、5、7、3′、4′位連接五個(gè)羥基,4′位連接一個(gè)甲氧基而成,質(zhì)譜分析得到離子碎片基峰為m/z 317,特征離子包括m/z 302、m/z 274;6種藍(lán)莓中檢測到牽?；ㄉ氐挠邪＠麏W特藍(lán)莓、愛國者藍(lán)莓、北藍(lán)藍(lán)莓、北陸藍(lán)莓、杜克藍(lán)莓。

在藍(lán)莓提取液中還檢測到兩種具有典型的花青素類化合物UV光譜圖的物質(zhì),分析這兩類化合物的MS及MS/MS 數(shù)據(jù)。第一種物質(zhì)與牽?；ㄉ氐姆肿与x子相比,其分子量相差大約162,由軟件推測該化合物與牽牛花色素相差1個(gè)[C6H10O5]單糖單元,查閱文獻(xiàn)鑒定該花青素為牽?；ㄉ?3-O-半乳糖配基或牽?；ㄉ?3-O-葡萄糖配基[29],但由于兩種物質(zhì)出峰時(shí)間不同,牽?；ㄉ?3-O-半乳糖配基色譜峰的保留時(shí)間早于牽牛花色素-3-O-葡萄糖配基色譜峰,因此,此化合物為牽?；ㄉ?3-O-半乳糖配基,測得含有此化合物的藍(lán)莓品種有:北藍(lán)藍(lán)莓、北陸藍(lán)莓、豐藍(lán)藍(lán)莓。另一種化合物與牽?；ㄉ氐姆肿与x子相比,其分子量相差大約為132,由軟件推測出的化合物分子式與牽?；ㄉ叵嗖?個(gè)脫水的[C5H8O4]單糖單元,查閱文獻(xiàn)得該物質(zhì)為牽牛花色素-3-O-阿拉伯糖配基[29],該花青素在埃利奧特、愛國者、北陸、杜克藍(lán)莓中可檢測到。

2.1.4 以芍藥素為苷元的花青素 芍藥素(Peonidin)則在苷元上3、5、7、4′位連接四個(gè)羥基,5′位連接一個(gè)甲氧基而成,質(zhì)譜分析得到離子碎片基峰為m/z 301,特征離子包括m/z 286、m/z 258;6種藍(lán)莓中檢測出芍藥素的品種是埃利奧特藍(lán)莓、愛國者藍(lán)莓。

2.1.5 以錦葵色素為苷元的花青素 錦葵色素(Malvidin)在苷元上3、5、7、4′位連接四個(gè)羥基,3′、5′位連接兩個(gè)甲氧基而成,質(zhì)譜分析得到離子碎片基峰為m/z 331,特征離子包括m/z 299、m/z 287。6種藍(lán)莓中檢測出錦葵色素的品種是:埃利奧特、愛國者、北陸、杜克、北藍(lán)。

在藍(lán)莓提取液中還測得一些具有典型的花青素類化合物UV光譜圖的物質(zhì),對這些化合物的MS及MS/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。第一種化合物與錦葵色素的分子離子相比,其分子量相差大約162,由軟件推測該化合物與錦葵色素相差1個(gè)[C6H10O5]單糖單元,查閱文獻(xiàn)得該花青素為錦葵色素-3-O-半乳糖配基或錦葵色素-3-O-葡萄糖配基[29],但由于兩個(gè)物質(zhì)出峰時(shí)間不同,錦葵色素-3-O-半乳糖配基先于錦葵色素-3-O-葡萄糖配基出峰,故鑒定出峰早的化合物為錦葵色素-3-O-半乳糖配基,出峰晚的化合物錦葵色素-3-O-葡萄糖配基,檢測出含有錦葵色素-3-O-半乳糖配基的藍(lán)莓品種是埃利奧特、愛國者、北陸、杜克、北藍(lán);含有錦葵色素-3-O-葡萄糖配基的品種是北陸、杜克、豐藍(lán)。另一種物質(zhì)與錦葵色素的分子離子相比,其分子量相差大約132,由軟件推測該化合物與錦葵色素相差1個(gè)脫水的[C5H8O4]單糖單元,查閱文獻(xiàn)得該花青素為錦葵色素-3-O-阿拉伯糖配基[29],鑒定出含有該花青素的種類為埃利奧特、愛國者、杜克、北藍(lán)、豐藍(lán)。

2.2 六種藍(lán)莓花青素結(jié)構(gòu)鑒定

6種不同品種藍(lán)莓中的花青素通過HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn被分析鑒定出來,根據(jù)上述分析,將不同品種藍(lán)莓提取液的液相總離子流圖,以及鑒定出的花青素種類和它們對應(yīng)的化合物UV 光譜數(shù)據(jù)、一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)匯總,如表1～表6所示,不同藍(lán)莓品種的色譜圖如圖2～7所示。

圖2 埃利奧特藍(lán)莓花青素提取物的色譜圖

圖3 愛國者藍(lán)莓花青素提取物的色譜圖

圖4 北藍(lán)藍(lán)莓花青素提取物的色譜圖

圖5 北陸藍(lán)莓花青素提取物的色譜圖

圖6 杜克藍(lán)莓花青素提取物的色譜圖

圖7 藍(lán)豐藍(lán)莓花青素提取物的色譜圖

表1 埃利奧特藍(lán)莓花青素提取物HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn數(shù)據(jù)及化合物鑒定結(jié)果

表2 愛國者藍(lán)莓花青素提取物成分特性

表3 北藍(lán)藍(lán)莓花青素提取物成分特性

表4 北陸藍(lán)莓花青素提取物成分特性

表5 杜克藍(lán)莓花青素提取物成分特性

表6 藍(lán)豐藍(lán)莓花青素提取物 成分特性

2.3 不同品種藍(lán)莓花青素組成

將6個(gè)品種的藍(lán)莓檢測到的花青素種類歸納,埃利奧特藍(lán)莓共測得11種花青素,愛國者藍(lán)莓10種,北藍(lán)藍(lán)莓7種,北陸藍(lán)莓12種,杜克藍(lán)莓9種,藍(lán)豐藍(lán)莓6種。由圖8可知,北陸藍(lán)莓檢測到的花青素種類最多,達(dá)12種;埃利奧特和愛國者藍(lán)莓中檢測到的花青素種類也很豐富,分別達(dá)到11和10種;藍(lán)豐藍(lán)莓中檢測到6種。

圖8 不同品種藍(lán)莓花青素個(gè)數(shù)對比

從花青素的組成上看,由表7可知,花翠素和矢車菊素這兩種花青素在6種藍(lán)莓中均被檢出;帶糖配基的錦葵色素-3-O-半乳糖配基、錦葵色素-3-O-阿拉伯糖配基、牽?；ㄉ匾约板\葵色素在埃利奧特、愛國者、北藍(lán)、北陸、杜克5種藍(lán)莓中均檢測到;藍(lán)豐藍(lán)莓中未檢測到錦葵色素-3-O-半乳糖配基,牽?；ㄉ睾湾\葵色素;錦葵色素-3-O-阿拉伯糖配基在北藍(lán)藍(lán)莓中沒有檢測到;芍藥素只在埃利奧特和愛國者藍(lán)莓中被檢測出來。

表7 不同品種藍(lán)莓花青素組成

3 結(jié)論

本文利用HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn對埃利奧克、愛國者、北藍(lán)、北陸、杜克、藍(lán)豐6種不同品種的藍(lán)莓花青素進(jìn)行對比分析,結(jié)合紫外可見光譜及多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)對花青素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,建立了一種實(shí)用、快速且準(zhǔn)確鑒定藍(lán)莓花青素種類的多級質(zhì)譜液質(zhì)聯(lián)用方法。

藍(lán)莓的品種不同,含有的花青素種類、結(jié)構(gòu)均存在顯著差異。從花青素種類分析,6種藍(lán)莓中共測得花青素13種,其中北陸中檢測到的花青素種類最多,共12種,包括花翠素、矢車菊素、牽?；ㄉ亍㈠\葵色素4種花青素苷元以及花翠素、牽?；ㄉ?、錦葵色素與糖基的衍生物8種;埃利奧特和愛國者的花青素種類也較為豐富,分別測得11種和10種,包括花翠素、矢車菊素、牽?；ㄉ?、錦葵色素、芍藥素5種花青素苷元以及花翠素、牽?；ㄉ亍㈠\葵色素與糖基的衍生物;北藍(lán)藍(lán)莓測得7種,杜克藍(lán)莓鑒定出9種,藍(lán)豐藍(lán)莓中檢測到的種類較少,只有6種。從花青素的組成分析,以不聯(lián)接糖苷的花翠素和矢車菊素在藍(lán)莓中分布最廣泛,所有品種中均可檢測到。除花翠素、矢車菊素外,不聯(lián)接糖苷的錦葵色素和牽牛花色素以及帶有糖配基的錦葵色素-3-O-阿拉伯糖配基和錦葵色素-3-O-半乳糖配基也分布較廣。其中不聯(lián)接糖苷的錦葵色素和牽?；ㄉ匾约板\葵色素-3-O-半乳糖配基在除藍(lán)豐品種外的其它5個(gè)品種中均檢測到,帶有糖配基的錦葵色素-3-O-阿拉伯糖配基可在埃利奧克、愛國者、北陸、杜克、藍(lán)豐5個(gè)藍(lán)莓品種中檢測到。含有芍藥素的藍(lán)莓品種較少,只在埃利奧克、愛國者品種中檢測到。

藍(lán)莓花青素與其他植物的花青素相比,具有小分子、更易吸收的優(yōu)點(diǎn),同時(shí)因其出色的保健功能,成為近年來研究者和藍(lán)莓產(chǎn)品市場的關(guān)注熱點(diǎn)。目前針對多品種藍(lán)莓花青素結(jié)構(gòu)及種類的研究較少,本文章利用HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn技術(shù)建立的分析測試方法可以快速、準(zhǔn)確地鑒定出藍(lán)莓花青素種類,亦可為選育花青素種類豐富的藍(lán)莓品種及后續(xù)藍(lán)莓花青素產(chǎn)品的開發(fā)與深加工提供數(shù)據(jù)參考。