謝 斌，李萬萬

(上海交通大學 材料科學與工程學院，上海 200240)

基質輔助激光解吸電離質譜(MALDI-MS)作為一種有力的分析手段，在許多生物分子分析中廣泛應用，如多肽分析、蛋白質分析、核酸分析等[1]。作為一種軟電離質譜技術，MALDI-MS通過基質吸收激光的能量并將其傳遞給待測分子從而使其離子化，這種技術有諸多優(yōu)點，如樣品制備簡單，靈敏度高，可檢測分子范圍廣(最高可達300 kDa)等[2]。然而，由于作為基質的有機分子在激光的作用下會產生大量的無規(guī)律碎片，MALDI-MS很難應用于分子量小于500的待測物的分析[3-4]。為了解決這個問題，很多無機粒子(如硅[5-6]、碳[7]、金屬[8-9]、金屬氧化物[10]等)被作為基質用于MALDI-MS的小分子分析。這些粒子在小分子分析的過程中產生的背景信號很小，有效地拓寬了MALDI-MS的應用范圍。

在MALDI-MS的小分子分析中，作為基質的材料必須滿足：(1)在特定激光(通常為355 nm)作用下穩(wěn)定；(2)能夠將激光的能量傳遞給目標分子。貴金屬粒子(如金、銀、鉑等)在激光作用下能產生獨特的表面等離子共振和熱載流子[11-12]，是基質的理想材料。盡管目前已有很多研究報道了貴金屬粒子作為基質在MALDI-MS中的應用[13-15]，但主要是針對粒子自身的不同形貌進行研究。有研究表明，貴金屬納米殼層相比于單純的貴金屬納米粒子，具備一定的表面粗糙度，有利于捕獲待測分子，更適合用于MALDI-MS的小分子檢測[16-17]。如Gan等設計了一種二氧化硅/金(SiO2@Au)復合的納米核殼結構材料應用于MALDI-MS，實現了復雜溶液中多種小分子的檢測[16]；Huang等將二氧化硅/銀(SiO2@Ag)復合納米小球作為基質，成功檢測出了血清中的微量葡萄糖[17]。

本研究采用聚多巴胺修飾還原法制備了一種核殼結構的聚苯乙烯-馬來酸酐共聚物/銀(PSMA@Ag)復合材料，由銀納米粒子包覆在微米尺寸的聚苯乙烯-馬來酸酐共聚物微球表面，形成復合微球，并探究了其作為基質在MALDI-MS中的應用。著重考察了PSMA@Ag微球在MALDI-MS中對小分子待測物的分析效果，并以脯氨酸和絲氨酸為目標物，證實了該材料對于使用MALDI分析小分子的可行性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

聚苯乙烯-馬來酸酐共聚物(PSMA，MW=17 000)、絲氨酸、脯氨酸、α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、葡萄糖、鹽酸多巴胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)(美國Aldrich公司)；硝酸銀、三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液(pH 8.5)、三氟乙酸(TFA)、乙腈(ACN)(上海麥克林生化科技有限公司)；氫氧化鈉、氨水(上海國藥集團化學試劑有限公司)。

SPG膜乳化裝置(日本SPG membrane / SPG Technology有限公司)；冷凍干燥機；Nicolet 6700紅外光譜儀、JEOL JSM-7800F Prime掃描電子顯微鏡(美國Thermo Scientific公司)；UV-2550紫外-可見光譜儀(日本Shimadzu公司)；Autoflex speed質譜儀(德國Bruker公司)采用Nd:YAG激光，波長為355 nm。

1.2 材料制備與表征

聚苯乙烯-馬來酸酐共聚物微球由膜乳化-乳液溶劑揮發(fā)法(MESE法)制備得到[18]。將200 mL 0.5%(質量分數)的 SDS水溶液作為連續(xù)相，8 mL含7%聚苯乙烯-馬來酸酐共聚物的甲苯溶液作為分散相，分別加入膜乳化裝置中。膜乳化裝置采用孔徑大小為4.9 μm的多孔玻璃膜(SPG膜)。對分散相施加5 kPa的氮氣壓力使其通過SPG膜進入連續(xù)相，待分散相中的液體耗盡時停止反應。為使甲苯揮發(fā)，在室溫下對所得的乳液持續(xù)勻速攪拌24 h，隨后分別用去離子水和無水乙醇對乳液各進行3次離心洗滌，將得到的聚苯乙烯-馬來酸酐共聚物微球冷凍干燥備用。

為了在微球表面修飾銀納米粒子，需先在其表面包覆一層聚多巴胺薄膜[19]。將100 mg聚苯乙烯-馬來酸酐共聚物微球分散在pH 8.5的Tris緩沖液中，加入100 mg鹽酸多巴胺，室溫攪拌3 h，用去離子水離心洗滌3次后使其分散在25 mL水中。向其中加入20 mL質量濃度為10 mg/mL的葡萄糖溶液和0.8 mL濃度為2 mol/L的氫氧化鈉溶液。最后，向混合物中加入25 mL新鮮配制的質量濃度為20 mg/mL的銀氨溶液，劇烈攪拌30 min，得到的PSMA@Ag復合微球用去離子水充分清洗3次后冷凍干燥備用。

1.3 MALDI-MS分析

取制備的微球5 mg，分散于10 mL去離子水中，形成0.5 mg/mL 的基質懸濁液。使用傳統基質CHCA作為對照，并將其用乙腈-水-三氟乙酸(50∶50∶0.001，體積比)溶解，質量濃度為4 mg/mL。將待測物配制成0.4～400 pmol/μL的標準溶液。

MALDI-MS分析時，取0.5 μL待測物溶液和0.5 μL基質懸濁液充分混合，將混合物滴在樣品板上，待溶劑在室溫下揮發(fā)后上機分析。數據分析中，僅將信噪比(SNR)大于10的峰視為有效峰，其對應的待測物濃度視為本次實驗的檢出限(LOD)。

1.4 穩(wěn)定性測試

將5組0.5 mg/mL 的PSMA@Ag復合微球基質懸濁液分別在4、25、37、60、80 ℃下放置24 h，記錄其用于分析400 pmol/μL脯氨酸的峰強度(m/z=222)，每組實驗重復3次。

圖1 未經修飾的PSMA微球和經過PDA包覆后 的PSMA微球的FT-IR譜圖Fig.1 FT-IR spectra of bare and PDA coated PSMA microbeads

將0.5 mg/mL 的PSMA@Ag復合微球基質懸濁液室溫保存，在第0、7、30、60、82 d時分別用其分析400 pmol/μL脯氨酸，并記錄峰強度用其分析400 pmol/μL脯氨酸，并記錄峰強度(m/z=222)，每組實驗重復3次。

圖2 PSMA 微球和PSMA@Ag 復合微球的SEM照片Fig.2 SEM images of PSMA and PSMA@Ag microbeads A.PSMA microbeads;B.PSMA@Ag microbeads; C.localized surface of PSMA@Ag microbead

圖3 PSMA 微球和PSMA@Ag 復合微球的 紫外-可見光吸收光譜Fig.3 UV-Vis spectra of PSMA and PSMA@Ag microbeads

2 結果與討論

2.1 材料的表征

在修飾銀納米殼層之前，首先要在材料的表面包覆上一層聚多巴胺(PDA)薄膜。這是因為銀粒子對氨基有著很強的親和力[20]，而PDA薄膜能夠為材料的表面提供大量的氨基[19,21]。圖1為PSMA微球在包覆PDA前后的FT-IR圖譜，其中1 743 cm-1為來自酸酐的振動，2 923 cm-1和2 850 cm-1處歸屬于亞甲基和甲基，而3 027、1 601、 1 493、1 453、 757、698 cm-1為來自苯環(huán)的振動。經PDA包覆之后，PSMA@Ag的圖譜在PSMA的基礎上增加了1 293 cm-1處的峰，為來自苯環(huán)上C—OH的伸縮振動，證明PDA成功包覆。

圖2是所得材料的掃描電鏡圖。由圖2A可知，所制備的PSMA為規(guī)則的球體，且粒徑均一，平均直徑在5.7 μm 左右。經過聚多巴胺的包覆和銀氨離子在微球表面的還原反應后，得到了如圖2B所示的PSMA@Ag復合微球：銀納米粒子均勻地分布在微球的表面，無局部團聚情況出現。圖2C展示了PSMA@Ag復合微球的部分表面，銀納米粒子的粒徑處于50 ～ 80 nm 之間。對比兩種微球的紫外可見光譜(圖3)發(fā)現，PSMA@Ag 復合微球在442 nm 處出現了明顯的吸收峰，證明了銀的存在。

2.2 MALDI-MS分析氨基酸

分別選擇脯氨酸(非極性，Mw=115)和絲氨酸(極性，Mw=105)作為待分析分子，研究了PSMA@Ag復合微球作為基質用于MALDI-MS小分子分析的可行性。對于非極性的氨基酸脯氨酸(200 pmol)，使用傳統基質CHCA進行檢測時，產生了非常大的背景信號(圖4A)，導致結果無法分析。相比之下，使用PSMA@Ag復合微球對相同物質的量的脯氨酸進行分析，能夠得到清晰完整的質譜圖(圖4B)，其中[M+107Ag]+和 [M+109Ag]+的信號SNR均達到了1 000以上，二者強度相似是因為銀元素的兩種同位素在自然界中的豐度相近。在待測物離子化的過程中，復合微球表面的銀納米粒子吸收激光能量并將其轉移給待測分子，而基底高分子可使銀納米粒子形成殼狀的結構，進而使得納米粒子間因此而產生縫隙，有利于待測分子直接吸附在微球表面[17]，從一定程度上起到了富集的作用。為了進一步研究PSMA@Ag復合微球對脯氨酸的檢出限，逐級降低待測物含量，在脯氨酸含量僅為2 pmol 時，使用PSMA@Ag復合微球作為基質仍能清晰地觀察到待測物的信號峰(SNR=17,圖4C)。類似地，對于極性氨基酸絲氨酸，使用傳統基質CHCA檢測仍然會在分析過程中產生大量背景噪聲(圖4D)，而采用PSMA@Ag復合微球基質能夠得到清晰完整的質譜圖(圖4E)。值得注意的是，在絲氨酸電離過程中產生的[M+109Ag]+和[107Ag2]+兩種粒子的質荷比都在214左右，體現在質譜圖上即出現了兩個相近的尖峰，這從另一個角度反映了該方法的精確性。實驗發(fā)現，絲氨酸的含量僅為1 pmol時，仍能觀察到明顯的待測物信號(SNR=41)(圖4F)。說明PSMA@Ag復合微球在MALDI小分子分析中有望發(fā)揮巨大的作用。

表1列舉了其他納米材料作為MALDI基質用于分子量小于500的待測物分析的一些成果?？梢钥闯觯壳按蟛糠盅芯繄蟮赖募{米材料作為基質分析小分子的工作中，檢出限多停留在10 pmol左右，PSMA@Ag復合微球所實現的檢測靈敏度相比之下略有提高。值得關注的是，考慮到本文在數據分析過程中，只將SNR大于10的峰視為有效峰，其對應的待測物濃度視為本次實驗的檢出限，而同類文獻設置的有效峰SNR水平為3或沒有相關描述，因此，PSMA@Ag復合微球相比于其他材料作為基質，具備其自身的優(yōu)越性。

表1 其他納米材料作為MALDI基質用于小分子檢測的一些成果Table 1 Recent publications about nanomaterials serving as MALDI matrix for small molecular detection

2.3 PSMA@Ag復合微球基質分析小分子的穩(wěn)定性

在實際應用過程中，PSMA@Ag復合微球需要有足夠的穩(wěn)定性。為了考察不同條件下PSMA@Ag復合微球的檢測性能，將其在不同溫度下保存24 h后，對脯氨酸進行檢測。從圖5A中可以看出，在4～60 ℃下，PSMA@Ag復合微球的檢測性能幾乎不受影響，而當微球在80 ℃處理24 h后，目標物的峰強度明顯下降，這可能是高溫導致材料的結構發(fā)生改變所致。為了探究PSMA@Ag復合微球的長期穩(wěn)定性，在制備完成后經過不同時間分別對同一濃度的脯氨酸進行了分析,結果如圖5B所示，PSMA@Ag復合微球能夠在室溫保存的條件下于82 d 內保持對脯氨酸的測試穩(wěn)定性。

3 結 論

采用簡單的聚多巴胺包覆還原法制備了均一、穩(wěn)定的PSMA@Ag復合微球，該微球可在MALDI-MS分析中作為無機基質，用于分子量較小(低于500)的目標物分析，且所得譜圖簡單，無碎片基質分子，譜峰強度高，檢測靈敏度好，相比于傳統有機基質具有優(yōu)越性，在MALDI-MS小分子分析中有著廣闊的應用前景。