分散固相萃取結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定柑橘中春雷霉素與噻霉酮?dú)埩?/h1>
2020-05-08 13:40康霞麗趙其陽張耀海王成秋焦必寧
分析測(cè)試學(xué)報(bào) 2020年3期
安 姣，康霞麗，楊 秦，趙其陽，張耀海，王成秋，焦必寧
(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院/西南大學(xué)柑桔研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶)， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，重慶 400712)
柑橘屬作為世界第一大水果，深受人們的喜愛，但其在種植中易受到黃龍病、瘡癡病、潰瘍病等病害的侵染，雖可使用殺菌劑進(jìn)行防治，但同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生農(nóng)藥殘留問題。春雷霉素(Kasugamycin，結(jié)構(gòu)式見圖1)屬于氨基糖苷類抗生素，易溶于水，是一種環(huán)境友好的內(nèi)吸性殺菌劑[1]。噻霉酮(Benziothiazolinone)屬有機(jī)雜環(huán)類殺菌劑(異噻唑啉酮類衍生物)，對(duì)細(xì)菌、真菌均有較強(qiáng)的抑制毒殺作用。這兩種農(nóng)藥均可有效防治柑橘潰瘍病、水稻稻瘟病、黃瓜細(xì)菌性角斑病、煙草野火病等，且田間藥效試驗(yàn)表明，二者混劑對(duì)番茄斑疹病的防治效果顯著高于單劑[2]。因連續(xù)使用抗生素易產(chǎn)生抗藥性[3]，春雷霉素宜與其它不同作用機(jī)制的殺菌劑交替或混合使用[1]。美國(guó)[4]、日本[5]和歐盟[6]規(guī)定春雷霉素的最大殘留限量(MRL)為0.01～0.6 mg/kg；我國(guó)GB 2763-2019[7]規(guī)定春雷霉素在柑、橘、橙上的 MRL為0.1 mg/kg，而噻霉酮在柑橘上暫無限量標(biāo)準(zhǔn)(其他作物上的MRL為0.05～1 mg/kg)。
目前，國(guó)內(nèi)外春雷霉素的殘留檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[8]、反向離子對(duì)液相色譜法(IP-HPLC)[9-11]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[12-18]和高效毛細(xì)管電泳法[19]、膠束液相色譜法[20]、生物測(cè)定法[21]等，樣品多為水、土壤、蔬菜、谷物等。春雷霉素極性大且無發(fā)色基團(tuán)，在反向色譜柱上難保留，分析檢測(cè)難度較大。雖然可通過衍生化操作引進(jìn)發(fā)色基團(tuán)進(jìn)行紫外檢測(cè)，但該過程操作繁瑣且易引入未知雜質(zhì)[22]。Sheu等[8]利用高效液相色譜(HPLC/UV)檢測(cè)了水中的春雷霉素含量，但靈敏度較低(定量下限為2.2 mg/L)。牛長(zhǎng)群、吳國(guó)旭等[11]建立了春雷霉素的反相離子對(duì)高效液相色譜檢測(cè)方法，通過加入離子對(duì)試劑改變保留時(shí)間；但該法對(duì)于試劑、濃度、室溫有較高要求，且保留時(shí)間過長(zhǎng)(14.5 min)，不適合大量樣品快速檢測(cè)。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法選擇性好，定性定量能力強(qiáng)，但凈化方式基本以固相萃取(SPE)為主，迄今尚未見分散固相萃取(DSPE)凈化春雷霉素的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。噻霉酮?dú)埩舻臋z測(cè)方法較少，且主要集中在材料、化妝品、涂料等工業(yè)領(lǐng)域，其在食品中的殘留檢測(cè)主要以液相色譜法[23-24]為主，粟有志等[25]采用QuEChERS前處理方法結(jié)合 HPLC-MS/MS測(cè)定了果蔬中的噻霉酮。由于上述兩種農(nóng)藥均無國(guó)家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法，也未見到柑橘中相關(guān)檢測(cè)方法報(bào)道，因此建立柑橘中春雷霉素和噻霉酮的檢測(cè)方法具有重要意義。
圖1 春雷霉素(A)和噻霉酮(B)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of kasugamycin (A) and benziothiazolinone (B)
本研究采用分散固相萃取法凈化樣品，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)，建立了同時(shí)測(cè)定柑橘中春雷霉素和噻霉酮?dú)埩舻姆治龇椒?，該方法靈敏度高，準(zhǔn)確度好，方便快捷，能夠滿足分析檢測(cè)要求，填補(bǔ)了柑橘中春雷霉素和噻霉酮同時(shí)檢測(cè)的空白，并為噻霉酮在柑橘上的限量標(biāo)準(zhǔn)制訂提供了數(shù)據(jù)支持，為食品中農(nóng)藥殘留安全性評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 儀器與試劑
Nexera X2 超高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)，QTRAP?6500三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜(美國(guó)AB公司)，IonDriveTMTurbo V 離子源，Analyst?1.6.3工作站；CL31/CL31R 多用途離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司)；Milli-Q A10超純水儀(美國(guó)Millipore公司)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CK2000型高通量組織研磨儀(北京Thmorgan生物科技有限公司)。
春雷霉素(89.0%)、噻霉酮(99.6%)(德國(guó) Dr.Ehrenstorfer公司)；乙腈、甲醇(色譜純，德國(guó) CNW公司)；N-丙基乙二胺(PSA)、超純反相C18填料(加拿大 SiliCycle公司)；石墨化炭黑(GCB，德國(guó) CNW公司)。
1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
用甲醇分別配制質(zhì)量濃度1 000 mg/L的春雷霉素和噻霉酮單標(biāo)儲(chǔ)備液，分別移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合液，-50 ℃保存。
分別用溶劑和空白基質(zhì)提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成質(zhì)量濃度為0.5、1、2、5、10、50、100、200 μg/L的溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照“1.4”儀器條件進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(μg/L)為橫坐標(biāo)(x)，對(duì)應(yīng)峰面積值為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3 前處理方法
準(zhǔn)確稱取勻漿后的柑橘樣品2.00 g(精確至0.01 g)于50 mL聚四氟乙烯離心管中，全果樣品中加入含0.5%甲酸的乙腈-水(7∶3，體積比，下同)溶液，果肉樣品中加入含0.5%氨水的乙腈-水(7∶3)溶液，定容至20 mL，渦旋混勻，垂直振蕩30 min后，10 000 r/min 離心5 min。移取2 mL上清液置于裝有50 mg C18的離心管中，渦旋1 min，3 000 r/min 離心5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾，待測(cè)。
1.4 儀器條件
1.4.1 色譜條件Waters ACQUITY UPLC?HSS T3 色譜柱(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：A為0.2%甲酸水溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序:0～2 min，2% B，2～4 min，2%～98% B，4～8 min，98% B，8～8.1 min，98%～2% B，8.1～9 min，2% B。柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流速0.2 mL/min。
1.4.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)；氣簾氣(CUR):20 psi；離子化電壓(IS):4 500 V；電噴霧離子源溫度(TEM):500 ℃；噴霧氣:50 psi；輔助加熱氣:50 psi；碰撞室入口電壓(EP):10 V；碰撞室出口電壓(CXP):10.5 V。其余質(zhì)譜參數(shù)見表1。
表1 春雷霉素和噻霉酮的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters for kasugamycin and benziothiazolinone
*quantification ion
2 結(jié)果與討論
2.1 儀器條件的優(yōu)化
配制0.5 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以針泵恒流進(jìn)樣分別在ESI+模式和ESI-模式下進(jìn)行掃描，選擇效果較好的正離子模式，得到母離子為[M+H]+，進(jìn)行子離子掃描，找到合適的子離子后建立MRM離子對(duì)通道，進(jìn)一步優(yōu)化獲得最佳去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)。
針對(duì)高極性農(nóng)藥，有文獻(xiàn)使用不同色譜柱包括反向柱[26]、陰離子交換柱[27]、反相和弱陰離子交換混合模式柱[28]、親水相互作用柱等進(jìn)行分析。春雷霉素是高親水化合物，其結(jié)構(gòu)中含有氨基，在反向柱(如C18柱)上難保留[15]，常選擇反相離子對(duì)液相色譜法(IP-HPLC)或親水相互作用(HILIC)柱進(jìn)行分析，但離子對(duì)試劑會(huì)影響質(zhì)譜的靈敏度，而HILIC柱更宜與ESI-MS結(jié)合使用[22]。T3色譜柱以C18鍵合相為固定相，可用純水作流動(dòng)相，對(duì)極性化合物保留效果較好。本文比較了ACQUITY UPLC?HSS T3 色譜柱(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)，ACQUITY UPLC?HSS T3 色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)和ACQUITY UPLC?BEH HILIC色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)的分析效果,，發(fā)現(xiàn)HILIC柱上春雷霉素和噻霉酮出峰時(shí)間較為接近，兩峰有重疊；50 mm的T3柱上春雷霉素保留時(shí)間較短，無法與雜質(zhì)較好分離，150 mm的T3柱上可獲得良好的峰形和分離度。故選擇150 mm 的ACQUITY UPLC?HSS T3柱。
圖2 0.2 mg/L春雷霉素和噻霉酮標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 0.2 mg/L kasugamycin and benziothiazolinone standard solution chromatogram
此外，分別比較了有機(jī)相為甲醇或乙腈，水相中加入不同含量甲酸(0.1%、0.2%)及乙酸銨時(shí)對(duì)峰形和響應(yīng)值的影響。當(dāng)有機(jī)相為乙腈時(shí)，噻霉酮有拖尾小峰出現(xiàn)。水相中加入甲酸可提高離子化效率，使響應(yīng)值增加，峰形對(duì)稱，0.2%甲酸較0.1%甲酸效果好；乙酸銨可促進(jìn)離子化，調(diào)節(jié)pH值，改善峰形，但加入乙酸銨會(huì)使噪音值變大。綜上所述，選擇0.2%甲酸水-甲醇體系作為流動(dòng)相。在該儀器條件下的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖2所示。
2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化
2.2.1 提取劑以柑橘樣品為研究對(duì)象，考察了不同提取劑對(duì)兩種農(nóng)藥的提取效果。春雷霉素和噻霉酮的提取劑多為甲醇或乙腈等極性溶劑，但試驗(yàn)過程中，當(dāng)提取劑為甲醇或乙腈時(shí)，春雷霉素的回收率均無法滿足要求(低于50%)，而以乙腈提取噻霉酮時(shí)回收率較甲醇高，使用相同比例的甲醇-水和乙腈-水時(shí)，乙腈-水的回收率較好，故比較了不同比例的乙腈-水對(duì)全果基質(zhì)的提取效果(加標(biāo)水平0.1 mg/kg)。結(jié)果表明，隨著乙腈含量的增加，噻霉酮的回收率增加，但春雷霉素在乙腈體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)回收率驟降，當(dāng)乙腈-水的體積比為7∶3時(shí)，兩種目標(biāo)物的回收率最好。
由于pH值對(duì)目標(biāo)物的提取效率影響很大，故考察了酸堿度對(duì)回收率的影響(圖3):對(duì)于全果基質(zhì)，加入0.5%甲酸時(shí)，提取效果較好；而對(duì)于果肉基質(zhì)，選擇加入0.5%氨水時(shí)，目標(biāo)物均滿足回收率要求。最終選擇含0.5%甲酸的乙腈-水溶液(7∶3)為柑橘全果提取劑，含0.5%氨水的乙腈-水溶液(7∶3)為柑橘果肉提取劑。
2.2.2 提取劑體積以柑橘全果為研究對(duì)象，比較了不同體積(10、20、30、40 mL)的提取劑對(duì)兩種目標(biāo)物的提取效果。結(jié)果顯示，提取劑為20 mL和30 mL時(shí)，均能滿足回收率要求，考慮到檢測(cè)靈敏度和溶劑消耗，選擇20 mL作為提取劑體積。
2.2.3 提取方式以全果基質(zhì)為研究對(duì)象，比較了超聲提取和振蕩提取對(duì)提取率的影響。當(dāng)提取時(shí)間為30 min時(shí)，振蕩提取的提取效果較好，噻霉酮回收率較高，春雷霉素?zé)o太大變化。這可能是由于噻霉酮在水中的溶解度隨溫度上升而增大，而超聲過程產(chǎn)熱，噻霉酮進(jìn)入乙腈層的比例減小，導(dǎo)致回收率較低。因此選用振蕩提取方式。
2.2.4 凈化劑在分散固相萃取(DSPE)中，目前使用最多的凈化材料是N-丙基乙二胺(PSA)、超純反相C18填料和石墨化炭黑(GCB)。PSA是一種弱陰離子交換劑，可有效去除有機(jī)酸、色素及一些糖類物質(zhì)；C18可去除基質(zhì)中的脂肪和脂類等非極性有機(jī)物；GCB能很好地去除色素和固醇類化合物[29]。
因此，比較了50 mg C18、PSA、GCB對(duì)于柑橘全果基質(zhì)的凈化效果，凈化后，提取液顏色由淺到深依次為GCB>C18>PSA，證明GCB對(duì)色素具有良好吸附作用。當(dāng)凈化劑為GCB時(shí)，噻霉酮的回收率偏低，可能由于GCB對(duì)極性分子具有強(qiáng)親和力，可與具有苯環(huán)等平面結(jié)構(gòu)的噻霉酮發(fā)生疏水相互作用，導(dǎo)致凈化過程中分析物損失[30]，回收率下降。當(dāng)凈化劑為C18和PSA時(shí)，兩種目標(biāo)物回收率均可滿足要求，其中C18略優(yōu)，因此選用C18作為凈化劑。進(jìn)一步考察了25、50、75、100 mg C18對(duì)回收率的影響，結(jié)果表明:C18用量為25～75 mg時(shí)，春雷霉素回收率逐步上升，噻霉酮?jiǎng)t在用量為50 mg時(shí)回收率較好，故最終選擇50 mg C18作為凈化劑。
2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限
樣品本身的內(nèi)源性組分和前處理引入的外源性組分產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)影響方法的線性、靈敏度、精密度等[32]，本法采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線校正基質(zhì)效應(yīng)(ME=基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率)。結(jié)果如表2所示，基質(zhì)對(duì)兩種目標(biāo)物均存在抑制作用，且對(duì)春雷霉素抑制作用強(qiáng)烈。以3倍信噪比(S/N)對(duì)應(yīng)的檢測(cè)濃度確定檢出限(LOD)，以最小加標(biāo)濃度確定定量下限(LOQ)。在0.5～200 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，春雷霉素和噻霉酮線性良好(r2>0.999)，檢出限(LODs)為0.006～0.04 μg/kg，定量下限(LOQs)為5～10 μg/kg。
表2 春雷霉素和噻霉酮的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、方法檢出限和定量下限Table 2 Linear ranges，regression equations,correlation coefficients(r2)，matrix effects，limits of detection(LODs) and limits of quantification(LOQs) for kasugamycin and benziothiazolinone
2.4 準(zhǔn)確度與精密度
在柑橘全果和果肉空白基質(zhì)中添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.3”方法處理，每個(gè)加標(biāo)水平做6個(gè)平行。由表3可知，在5～1 000 μg/kg加標(biāo)水平下，春雷霉素的回收率為79.7%～104%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.6%～9.6%；噻霉酮的回收率為73.4%～88.5%,RSD為1.6%～8.0%。結(jié)果表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，可滿足農(nóng)殘檢測(cè)分析要求。
表3 不同基質(zhì)中春雷霉素和噻霉酮的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of kasugamycin and benziothiazolinone in different matrixes(n=6)
2.5 方法對(duì)比
本方法使用C18進(jìn)行分散固相萃取凈化，與固相萃取小柱相比，成本低，耗時(shí)少，摒棄了丙酮等不適合液質(zhì)的提取劑，簡(jiǎn)化了前處理步驟，且回收率較好，適合大量樣品的快速檢測(cè)(表4)。
表4 春雷霉素和噻霉酮在食品中的檢測(cè)方法對(duì)比Table 4 Comparison of detection methods of kasugamycin and benziothiazolinon in food
2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)
于2018～2019年在重慶市北碚區(qū)開展田間試驗(yàn)，供試藥劑為8%春雷霉素·噻霉酮水分散粒劑，供試作物為溫州蜜柑，分別按照400 mg a.i./kg(5倍推薦劑量)的有效劑量施藥1次(末次施藥后0、1、2、3、4、5、7、14、21、28 d采集田間樣品)，80 mg a.i./kg有效劑量施藥2次，施藥間隔期7 d(末次施藥后21、28 d采集田間樣品)，使用本方法進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)測(cè)定結(jié)果得到:春雷霉素在溫州蜜柑中的消解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，殘留量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減小，降解方程為y=0.601 7e-0.052x(r2=0.748 1)，y=0.401 7e-0.055x(r2=0.733 3)，y=0.365 6e-0.049x(r2=0.634 0)，半衰期T1/2=12.60～14.15 d；噻霉酮的消解不遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，呈上升下降連續(xù)波動(dòng)趨勢(shì)。由于只在單一品種和地區(qū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)僅供參考，后期仍需佐證。結(jié)果顯示，全果中春雷霉素的消解殘留量為0.096 1～0.752 8 mg/kg(圖4A)，噻霉酮為0.005 4～0.016 9 mg/kg(圖4B)。全果和果肉中的最終殘留量均為未檢出。
3 結(jié) 論
本文建立了DSPE/UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定柑橘中水溶性春雷霉素和脂溶性噻霉酮的分析方法。使用T3色譜柱得到了良好的峰形及分離度，通過分散固相萃取法凈化，簡(jiǎn)化了步驟并保證了良好的回收率。該方法靈敏度高，方便快捷，精密度好，能滿足柑橘水果中春雷霉素和噻霉酮?dú)埩舻臋z測(cè)要求，可為制定春雷霉素和噻霉酮復(fù)配農(nóng)藥的安全使用規(guī)則和在柑橘上的產(chǎn)品登記提供技術(shù)支撐。
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(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院/西南大學(xué)柑桔研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶)， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，重慶 400712)
柑橘屬作為世界第一大水果，深受人們的喜愛，但其在種植中易受到黃龍病、瘡癡病、潰瘍病等病害的侵染，雖可使用殺菌劑進(jìn)行防治，但同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生農(nóng)藥殘留問題。春雷霉素(Kasugamycin，結(jié)構(gòu)式見圖1)屬于氨基糖苷類抗生素，易溶于水，是一種環(huán)境友好的內(nèi)吸性殺菌劑[1]。噻霉酮(Benziothiazolinone)屬有機(jī)雜環(huán)類殺菌劑(異噻唑啉酮類衍生物)，對(duì)細(xì)菌、真菌均有較強(qiáng)的抑制毒殺作用。這兩種農(nóng)藥均可有效防治柑橘潰瘍病、水稻稻瘟病、黃瓜細(xì)菌性角斑病、煙草野火病等，且田間藥效試驗(yàn)表明，二者混劑對(duì)番茄斑疹病的防治效果顯著高于單劑[2]。因連續(xù)使用抗生素易產(chǎn)生抗藥性[3]，春雷霉素宜與其它不同作用機(jī)制的殺菌劑交替或混合使用[1]。美國(guó)[4]、日本[5]和歐盟[6]規(guī)定春雷霉素的最大殘留限量(MRL)為0.01～0.6 mg/kg；我國(guó)GB 2763-2019[7]規(guī)定春雷霉素在柑、橘、橙上的 MRL為0.1 mg/kg，而噻霉酮在柑橘上暫無限量標(biāo)準(zhǔn)(其他作物上的MRL為0.05～1 mg/kg)。
目前，國(guó)內(nèi)外春雷霉素的殘留檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[8]、反向離子對(duì)液相色譜法(IP-HPLC)[9-11]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[12-18]和高效毛細(xì)管電泳法[19]、膠束液相色譜法[20]、生物測(cè)定法[21]等，樣品多為水、土壤、蔬菜、谷物等。春雷霉素極性大且無發(fā)色基團(tuán)，在反向色譜柱上難保留，分析檢測(cè)難度較大。雖然可通過衍生化操作引進(jìn)發(fā)色基團(tuán)進(jìn)行紫外檢測(cè)，但該過程操作繁瑣且易引入未知雜質(zhì)[22]。Sheu等[8]利用高效液相色譜(HPLC/UV)檢測(cè)了水中的春雷霉素含量，但靈敏度較低(定量下限為2.2 mg/L)。牛長(zhǎng)群、吳國(guó)旭等[11]建立了春雷霉素的反相離子對(duì)高效液相色譜檢測(cè)方法，通過加入離子對(duì)試劑改變保留時(shí)間；但該法對(duì)于試劑、濃度、室溫有較高要求，且保留時(shí)間過長(zhǎng)(14.5 min)，不適合大量樣品快速檢測(cè)。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法選擇性好，定性定量能力強(qiáng)，但凈化方式基本以固相萃取(SPE)為主，迄今尚未見分散固相萃取(DSPE)凈化春雷霉素的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。噻霉酮?dú)埩舻臋z測(cè)方法較少，且主要集中在材料、化妝品、涂料等工業(yè)領(lǐng)域，其在食品中的殘留檢測(cè)主要以液相色譜法[23-24]為主，粟有志等[25]采用QuEChERS前處理方法結(jié)合 HPLC-MS/MS測(cè)定了果蔬中的噻霉酮。由于上述兩種農(nóng)藥均無國(guó)家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法，也未見到柑橘中相關(guān)檢測(cè)方法報(bào)道，因此建立柑橘中春雷霉素和噻霉酮的檢測(cè)方法具有重要意義。
圖1 春雷霉素(A)和噻霉酮(B)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of kasugamycin (A) and benziothiazolinone (B)
本研究采用分散固相萃取法凈化樣品，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)，建立了同時(shí)測(cè)定柑橘中春雷霉素和噻霉酮?dú)埩舻姆治龇椒?，該方法靈敏度高，準(zhǔn)確度好，方便快捷，能夠滿足分析檢測(cè)要求，填補(bǔ)了柑橘中春雷霉素和噻霉酮同時(shí)檢測(cè)的空白，并為噻霉酮在柑橘上的限量標(biāo)準(zhǔn)制訂提供了數(shù)據(jù)支持，為食品中農(nóng)藥殘留安全性評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 儀器與試劑
Nexera X2 超高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)，QTRAP?6500三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜(美國(guó)AB公司)，IonDriveTMTurbo V 離子源，Analyst?1.6.3工作站；CL31/CL31R 多用途離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司)；Milli-Q A10超純水儀(美國(guó)Millipore公司)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CK2000型高通量組織研磨儀(北京Thmorgan生物科技有限公司)。
春雷霉素(89.0%)、噻霉酮(99.6%)(德國(guó) Dr.Ehrenstorfer公司)；乙腈、甲醇(色譜純，德國(guó) CNW公司)；N-丙基乙二胺(PSA)、超純反相C18填料(加拿大 SiliCycle公司)；石墨化炭黑(GCB，德國(guó) CNW公司)。
1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
用甲醇分別配制質(zhì)量濃度1 000 mg/L的春雷霉素和噻霉酮單標(biāo)儲(chǔ)備液，分別移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合液，-50 ℃保存。
分別用溶劑和空白基質(zhì)提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成質(zhì)量濃度為0.5、1、2、5、10、50、100、200 μg/L的溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照“1.4”儀器條件進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(μg/L)為橫坐標(biāo)(x)，對(duì)應(yīng)峰面積值為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3 前處理方法
準(zhǔn)確稱取勻漿后的柑橘樣品2.00 g(精確至0.01 g)于50 mL聚四氟乙烯離心管中，全果樣品中加入含0.5%甲酸的乙腈-水(7∶3，體積比，下同)溶液，果肉樣品中加入含0.5%氨水的乙腈-水(7∶3)溶液，定容至20 mL，渦旋混勻，垂直振蕩30 min后，10 000 r/min 離心5 min。移取2 mL上清液置于裝有50 mg C18的離心管中，渦旋1 min，3 000 r/min 離心5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾，待測(cè)。
1.4 儀器條件
1.4.1 色譜條件Waters ACQUITY UPLC?HSS T3 色譜柱(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：A為0.2%甲酸水溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序:0～2 min，2% B，2～4 min，2%～98% B，4～8 min，98% B，8～8.1 min，98%～2% B，8.1～9 min，2% B。柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流速0.2 mL/min。
1.4.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)；氣簾氣(CUR):20 psi；離子化電壓(IS):4 500 V；電噴霧離子源溫度(TEM):500 ℃；噴霧氣:50 psi；輔助加熱氣:50 psi；碰撞室入口電壓(EP):10 V；碰撞室出口電壓(CXP):10.5 V。其余質(zhì)譜參數(shù)見表1。
表1 春雷霉素和噻霉酮的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters for kasugamycin and benziothiazolinone
*quantification ion
2 結(jié)果與討論
2.1 儀器條件的優(yōu)化
配制0.5 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以針泵恒流進(jìn)樣分別在ESI+模式和ESI-模式下進(jìn)行掃描，選擇效果較好的正離子模式，得到母離子為[M+H]+，進(jìn)行子離子掃描，找到合適的子離子后建立MRM離子對(duì)通道，進(jìn)一步優(yōu)化獲得最佳去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)。
針對(duì)高極性農(nóng)藥，有文獻(xiàn)使用不同色譜柱包括反向柱[26]、陰離子交換柱[27]、反相和弱陰離子交換混合模式柱[28]、親水相互作用柱等進(jìn)行分析。春雷霉素是高親水化合物，其結(jié)構(gòu)中含有氨基，在反向柱(如C18柱)上難保留[15]，常選擇反相離子對(duì)液相色譜法(IP-HPLC)或親水相互作用(HILIC)柱進(jìn)行分析，但離子對(duì)試劑會(huì)影響質(zhì)譜的靈敏度，而HILIC柱更宜與ESI-MS結(jié)合使用[22]。T3色譜柱以C18鍵合相為固定相，可用純水作流動(dòng)相，對(duì)極性化合物保留效果較好。本文比較了ACQUITY UPLC?HSS T3 色譜柱(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)，ACQUITY UPLC?HSS T3 色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)和ACQUITY UPLC?BEH HILIC色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)的分析效果,，發(fā)現(xiàn)HILIC柱上春雷霉素和噻霉酮出峰時(shí)間較為接近，兩峰有重疊；50 mm的T3柱上春雷霉素保留時(shí)間較短，無法與雜質(zhì)較好分離，150 mm的T3柱上可獲得良好的峰形和分離度。故選擇150 mm 的ACQUITY UPLC?HSS T3柱。
圖2 0.2 mg/L春雷霉素和噻霉酮標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 0.2 mg/L kasugamycin and benziothiazolinone standard solution chromatogram
此外，分別比較了有機(jī)相為甲醇或乙腈，水相中加入不同含量甲酸(0.1%、0.2%)及乙酸銨時(shí)對(duì)峰形和響應(yīng)值的影響。當(dāng)有機(jī)相為乙腈時(shí)，噻霉酮有拖尾小峰出現(xiàn)。水相中加入甲酸可提高離子化效率，使響應(yīng)值增加，峰形對(duì)稱，0.2%甲酸較0.1%甲酸效果好；乙酸銨可促進(jìn)離子化，調(diào)節(jié)pH值，改善峰形，但加入乙酸銨會(huì)使噪音值變大。綜上所述，選擇0.2%甲酸水-甲醇體系作為流動(dòng)相。在該儀器條件下的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖2所示。
2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化
2.2.1 提取劑以柑橘樣品為研究對(duì)象，考察了不同提取劑對(duì)兩種農(nóng)藥的提取效果。春雷霉素和噻霉酮的提取劑多為甲醇或乙腈等極性溶劑，但試驗(yàn)過程中，當(dāng)提取劑為甲醇或乙腈時(shí)，春雷霉素的回收率均無法滿足要求(低于50%)，而以乙腈提取噻霉酮時(shí)回收率較甲醇高，使用相同比例的甲醇-水和乙腈-水時(shí)，乙腈-水的回收率較好，故比較了不同比例的乙腈-水對(duì)全果基質(zhì)的提取效果(加標(biāo)水平0.1 mg/kg)。結(jié)果表明，隨著乙腈含量的增加，噻霉酮的回收率增加，但春雷霉素在乙腈體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)回收率驟降，當(dāng)乙腈-水的體積比為7∶3時(shí)，兩種目標(biāo)物的回收率最好。
由于pH值對(duì)目標(biāo)物的提取效率影響很大，故考察了酸堿度對(duì)回收率的影響(圖3):對(duì)于全果基質(zhì)，加入0.5%甲酸時(shí)，提取效果較好；而對(duì)于果肉基質(zhì)，選擇加入0.5%氨水時(shí)，目標(biāo)物均滿足回收率要求。最終選擇含0.5%甲酸的乙腈-水溶液(7∶3)為柑橘全果提取劑，含0.5%氨水的乙腈-水溶液(7∶3)為柑橘果肉提取劑。
2.2.2 提取劑體積以柑橘全果為研究對(duì)象，比較了不同體積(10、20、30、40 mL)的提取劑對(duì)兩種目標(biāo)物的提取效果。結(jié)果顯示，提取劑為20 mL和30 mL時(shí)，均能滿足回收率要求，考慮到檢測(cè)靈敏度和溶劑消耗，選擇20 mL作為提取劑體積。
2.2.3 提取方式以全果基質(zhì)為研究對(duì)象，比較了超聲提取和振蕩提取對(duì)提取率的影響。當(dāng)提取時(shí)間為30 min時(shí)，振蕩提取的提取效果較好，噻霉酮回收率較高，春雷霉素?zé)o太大變化。這可能是由于噻霉酮在水中的溶解度隨溫度上升而增大，而超聲過程產(chǎn)熱，噻霉酮進(jìn)入乙腈層的比例減小，導(dǎo)致回收率較低。因此選用振蕩提取方式。
2.2.4 凈化劑在分散固相萃取(DSPE)中，目前使用最多的凈化材料是N-丙基乙二胺(PSA)、超純反相C18填料和石墨化炭黑(GCB)。PSA是一種弱陰離子交換劑，可有效去除有機(jī)酸、色素及一些糖類物質(zhì)；C18可去除基質(zhì)中的脂肪和脂類等非極性有機(jī)物；GCB能很好地去除色素和固醇類化合物[29]。
因此，比較了50 mg C18、PSA、GCB對(duì)于柑橘全果基質(zhì)的凈化效果，凈化后，提取液顏色由淺到深依次為GCB>C18>PSA，證明GCB對(duì)色素具有良好吸附作用。當(dāng)凈化劑為GCB時(shí)，噻霉酮的回收率偏低，可能由于GCB對(duì)極性分子具有強(qiáng)親和力，可與具有苯環(huán)等平面結(jié)構(gòu)的噻霉酮發(fā)生疏水相互作用，導(dǎo)致凈化過程中分析物損失[30]，回收率下降。當(dāng)凈化劑為C18和PSA時(shí)，兩種目標(biāo)物回收率均可滿足要求，其中C18略優(yōu)，因此選用C18作為凈化劑。進(jìn)一步考察了25、50、75、100 mg C18對(duì)回收率的影響，結(jié)果表明:C18用量為25～75 mg時(shí)，春雷霉素回收率逐步上升，噻霉酮?jiǎng)t在用量為50 mg時(shí)回收率較好，故最終選擇50 mg C18作為凈化劑。
2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限
樣品本身的內(nèi)源性組分和前處理引入的外源性組分產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)影響方法的線性、靈敏度、精密度等[32]，本法采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線校正基質(zhì)效應(yīng)(ME=基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率)。結(jié)果如表2所示，基質(zhì)對(duì)兩種目標(biāo)物均存在抑制作用，且對(duì)春雷霉素抑制作用強(qiáng)烈。以3倍信噪比(S/N)對(duì)應(yīng)的檢測(cè)濃度確定檢出限(LOD)，以最小加標(biāo)濃度確定定量下限(LOQ)。在0.5～200 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，春雷霉素和噻霉酮線性良好(r2>0.999)，檢出限(LODs)為0.006～0.04 μg/kg，定量下限(LOQs)為5～10 μg/kg。
表2 春雷霉素和噻霉酮的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、方法檢出限和定量下限Table 2 Linear ranges，regression equations,correlation coefficients(r2)，matrix effects，limits of detection(LODs) and limits of quantification(LOQs) for kasugamycin and benziothiazolinone
2.4 準(zhǔn)確度與精密度
在柑橘全果和果肉空白基質(zhì)中添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.3”方法處理，每個(gè)加標(biāo)水平做6個(gè)平行。由表3可知，在5～1 000 μg/kg加標(biāo)水平下，春雷霉素的回收率為79.7%～104%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.6%～9.6%；噻霉酮的回收率為73.4%～88.5%,RSD為1.6%～8.0%。結(jié)果表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，可滿足農(nóng)殘檢測(cè)分析要求。
表3 不同基質(zhì)中春雷霉素和噻霉酮的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of kasugamycin and benziothiazolinone in different matrixes(n=6)
2.5 方法對(duì)比
本方法使用C18進(jìn)行分散固相萃取凈化，與固相萃取小柱相比，成本低，耗時(shí)少，摒棄了丙酮等不適合液質(zhì)的提取劑，簡(jiǎn)化了前處理步驟，且回收率較好，適合大量樣品的快速檢測(cè)(表4)。
表4 春雷霉素和噻霉酮在食品中的檢測(cè)方法對(duì)比Table 4 Comparison of detection methods of kasugamycin and benziothiazolinon in food
2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)
于2018～2019年在重慶市北碚區(qū)開展田間試驗(yàn)，供試藥劑為8%春雷霉素·噻霉酮水分散粒劑，供試作物為溫州蜜柑，分別按照400 mg a.i./kg(5倍推薦劑量)的有效劑量施藥1次(末次施藥后0、1、2、3、4、5、7、14、21、28 d采集田間樣品)，80 mg a.i./kg有效劑量施藥2次，施藥間隔期7 d(末次施藥后21、28 d采集田間樣品)，使用本方法進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)測(cè)定結(jié)果得到:春雷霉素在溫州蜜柑中的消解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，殘留量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減小，降解方程為y=0.601 7e-0.052x(r2=0.748 1)，y=0.401 7e-0.055x(r2=0.733 3)，y=0.365 6e-0.049x(r2=0.634 0)，半衰期T1/2=12.60～14.15 d；噻霉酮的消解不遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，呈上升下降連續(xù)波動(dòng)趨勢(shì)。由于只在單一品種和地區(qū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)僅供參考，后期仍需佐證。結(jié)果顯示，全果中春雷霉素的消解殘留量為0.096 1～0.752 8 mg/kg(圖4A)，噻霉酮為0.005 4～0.016 9 mg/kg(圖4B)。全果和果肉中的最終殘留量均為未檢出。
3 結(jié) 論
本文建立了DSPE/UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定柑橘中水溶性春雷霉素和脂溶性噻霉酮的分析方法。使用T3色譜柱得到了良好的峰形及分離度，通過分散固相萃取法凈化，簡(jiǎn)化了步驟并保證了良好的回收率。該方法靈敏度高，方便快捷，精密度好，能滿足柑橘水果中春雷霉素和噻霉酮?dú)埩舻臋z測(cè)要求，可為制定春雷霉素和噻霉酮復(fù)配農(nóng)藥的安全使用規(guī)則和在柑橘上的產(chǎn)品登記提供技術(shù)支撐。
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