董 雁，張夏紅，林水東，盧曉春，李錦輝

(1.龍巖學(xué)院 化學(xué)與材料學(xué)院，福建 龍巖 364012；2．固體廢棄物資源化利用福建省高校 工程研究中心，福建 龍巖 364012)

分子印跡技術(shù)(Molecular impinting technology)是一種使聚合物聚合后與模板分子的空間構(gòu)型相匹配的“空穴”結(jié)構(gòu)的技術(shù)。所形成的“空穴”對(duì)模板分子有高度識(shí)別性，不易受外界干擾，穩(wěn)定性與重現(xiàn)性好，可用于低濃度樣品的檢測(cè)[1]。分子印跡技術(shù)最早出現(xiàn)于生物化學(xué)，源于抗體對(duì)某種分子具有專一性識(shí)別功能的一種分析技術(shù)。之后，經(jīng)過(guò)科學(xué)家的不斷探索和完善，逐漸形成了一門新興技術(shù)，得到了人們的普遍認(rèn)可[2]。近年來(lái)，分子印跡技術(shù)在傳感器領(lǐng)域的發(fā)展更可謂是動(dòng)力十足，已成為該領(lǐng)域最具發(fā)展?jié)摿Φ南冗M(jìn)技術(shù)之一[3-5]。將電化學(xué)聚合法與分子印跡法相結(jié)合制備印跡聚合物具有使用儀器簡(jiǎn)單[6]、成本低、易操作等特點(diǎn)，且電化學(xué)聚合法制備的印跡膜厚度可控、成膜均勻、重復(fù)性較好，較化學(xué)聚合有更多優(yōu)勢(shì)。但該方法也存在一些不足，如未經(jīng)修飾的玻碳電極表面靈敏度不高等。通常通過(guò)引入功能性納米材料(如石墨烯等)以改善此類問題[7]。

水楊酸(SA)是一種脂溶性有機(jī)酸，為阿司匹林以及很多止痛藥的制備原料，并被廣泛用于化妝品中。但由于高濃度的SA會(huì)對(duì)皮膚造成損害，我國(guó)對(duì)化妝品中SA含量有明確規(guī)定，因此檢測(cè)其在化妝品中的含量就尤為重要。傳統(tǒng)檢測(cè)SA的方法有熒光分光光度法[8]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9]、高效液相色譜法[10-11]等。此外，也有基于印跡聚合技術(shù)檢測(cè)SA的研究，但采用電聚合法制備SA分子印跡膜，用于檢測(cè)SA含量卻鮮見報(bào)道[12-15]。本文以鄰苯二胺和吡咯為復(fù)合功能單體，SA作為模板分子，通過(guò)循環(huán)伏安法(CV)在石墨烯修飾的玻碳電極表面制備高選擇性及高靈敏度的SA分子印跡膜。優(yōu)化了分子印跡電化學(xué)傳感器的制備條件，對(duì)傳感器性能進(jìn)行了表征，并采用傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)SA的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

水楊酸(SA)、鄰苯二胺(o-PPD)、乙腈(MeCN)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、氯化鉀、乙酸、乙酰水楊酸、對(duì)羥基苯甲酸、苯甲酸、吡咯(Py)、苯甲醛(分析純，麥克林公司)；0.5 mg/mL氧化石墨烯分散液(GO，南京先豐納米材料科技有限公司)。

玻碳電極(GCE)、CHI660C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；KQ-100DE超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)；PH-3CB/3CU型PH計(jì)(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；S-3400N掃描電子顯微鏡(日本日立公司)。

1.2 石墨烯修飾玻碳電極的制備(GO/GCE)

先將玻碳電極分別用0.5 μm和0.05 μm的Al2O3粉末對(duì)電極表面拋光處理，然后用超純水清洗3次，采用循環(huán)伏安法使其在鐵氰化鉀探針溶液中出峰電位差為85 mV后，自然風(fēng)干。取5 μL氧化石墨烯分散液涂覆于預(yù)處理過(guò)的玻碳電極表面，自然晾干后再取3 μL滴涂至玻碳電極表面，自然晾干即制成石墨烯修飾玻碳電極(GO/GCE)[16]。

1.3 SA印跡電極的制備(MIP/GO/GCE)

在41 mL pH 6.6的磷酸緩沖溶液(PBS)中加入1 mL 0.1 mol/L SA溶液、4 mL 0.1 mol/Lo-PPD和4 mL 0.1 mol/L的Py溶液，充分混勻后待用。將“1.2”處理好的玻碳電極、參比電極及輔助電極所組成三電極體系浸入上述聚合液中，用循環(huán)伏安法(CV)掃描15圈，掃描范圍為-0.2～0.8 V，掃描速度為50 mV/s進(jìn)行制備。聚合結(jié)束后，先用超純水反復(fù)沖洗電極，再放入洗脫液中洗脫20 min除去模板分子，自然晾干，得到SA分子印跡傳感器(MIP/GO/GCE)。非印跡分子傳感器(NIP/GO/GCE)的制備除不加SA外，其它條件保持不變。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡聚合膜的電化學(xué)行為

采用CV法分別對(duì)NIP/GO/GCE、MIP/GCE及MIP/GO/GCE的電化學(xué)行為進(jìn)行考察(圖1)。結(jié)果顯示，對(duì)NIP/GO/GCE進(jìn)行第1次掃描時(shí)，在0.065 V處出現(xiàn)氧化峰，第2圈掃描后，電流強(qiáng)度明顯降低，并隨著掃描圈數(shù)的增多，電流恢復(fù)到背景值(圖1A)，表明o-PPD和Py可在此電流范圍內(nèi)發(fā)生聚合反應(yīng)，在玻碳電極表面形成不導(dǎo)電的致密聚合膜，致使o-PPD和Py未進(jìn)一步氧化，抑制了伏安電流響應(yīng)。圖1B 為MIP/GCE的印跡聚合行為，可觀察到未加石墨烯時(shí)，修飾電極聚合的氧化還原峰不明顯。而圖1C為MIP/GO/GCE電聚合過(guò)程的CV圖，可觀察到強(qiáng)氧化還原峰，表明石墨烯具有良好的導(dǎo)電性，修飾電極后能提供給反應(yīng)分子較大的比表面積，使反應(yīng)更容易進(jìn)行。

圖1 NIP/GO/GCE(A)、MIP/GCE(B)及MIP/GO/GCE(C)的CV圖Fig.1 CV curves of NIP/GO/GCE(A)，MIP/GCE(B) and MIP/GO/GCE(C)

2.2 裸電極及石墨烯修飾電極的電化學(xué)表征

圖2 不同類型電極在鐵氰化鉀探針溶液中的CV圖Fig.2 CV curves of different electrodes in potassium ferrohydride probe solution a.GO/GCE;b,c.MIP/GO/GCE and NIP/GO/GCE after template removal，respectively;d,e.MIP/GO/GCE and NIP/GO/GCE before template removal，respectively

為了研究SA是否洗脫完全，考察了石墨烯修飾玻碳電極(GO/GCE)、洗脫前后的MIP/GO/GCE和洗脫前后的NIP/GO/GCE在K3[Fe(CN)6]探針溶液中的循環(huán)伏安圖(如圖2)。結(jié)果顯示，GO/GCE的峰電流響應(yīng)值最大(曲線a)，未洗脫的電極MIP/GO/GCE(曲線d)和NIP/GO/GCE(曲線e)幾乎無(wú)氧化還原峰，說(shuō)明此電極基本絕緣，這是因?yàn)槲聪疵摰碾姌O不會(huì)留下“空穴”，無(wú)法發(fā)生電子傳遞。洗脫后的電極MIP/GO/GCE，其峰電流響應(yīng)顯著增大(曲線b)，這是因?yàn)橛≯E分子經(jīng)洗脫劑洗脫后，在印跡膜上形成與模板分子匹配的“空穴”，形成電子傳遞的通道，因而導(dǎo)致峰電流信號(hào)明顯加強(qiáng)。而洗脫后的MIP/GO/GCE表面覆蓋膜雖具有“空穴”，但較GO/GCE的傳遞性能差，所以其電流響應(yīng)的強(qiáng)度小于GO/GCE，但大于洗脫后的NIP/GO/GCE(曲線c)[17]。

2.3 不同類型印跡電極的掃描電鏡圖

采用掃描電鏡分別對(duì)GO/GCE(A)、未洗脫的MIP/GO/GCE(B)、洗脫后的MIP/GO/GCE(C)和吸附SA平衡的MIP/GO/GCE(D)進(jìn)行表征，結(jié)果如圖3所示。從圖A可以看出石墨烯的鱗片狀結(jié)構(gòu)；由圖B可觀察到聚合膜已將石墨烯的鱗片狀結(jié)構(gòu)覆蓋，其表面比未聚合前平整；洗脫后的電極表面可觀察到大量“空穴”(圖C)；吸附SA達(dá)到平衡后的MIP/GO/GCE電極，可觀察到“空穴”數(shù)量變少，表面平整(圖D)，這是因?yàn)镾A在靜電力作用下與活性“空穴”結(jié)合[18]。此結(jié)論與“2.2”相互印證，說(shuō)明石墨烯修飾后的玻碳電極的電流響應(yīng)大于其他電極，未洗脫的電極表面則覆蓋了一層不能導(dǎo)電的聚合物薄膜。

2.4 電化學(xué)聚合條件的選擇

2.4.1 聚合液pH值的優(yōu)化在濃度為0.2 mol/L的PBS緩沖溶液中，固定SA∶o-PPD∶Py的摩爾比為1∶4∶4，用方波伏安法研究了不同pH值(6.2、6.4、6.6、6.8、7.0)對(duì)聚合的影響。結(jié)果顯示，在考察的pH值范圍內(nèi)，峰電流表現(xiàn)為先增大后減小的趨勢(shì)，且在pH 6.6時(shí)峰電流響應(yīng)值最大。說(shuō)明在此pH值下，功能單體o-PPD和Py能較好的在修飾電極表面發(fā)生氧化聚合反應(yīng)，其原因可能是o-PPD和Py更適宜在弱酸性環(huán)境下發(fā)生電化學(xué)聚合。 因此實(shí)驗(yàn)選擇聚合液的pH值為6.6。

2.4.2 掃描圈數(shù)的優(yōu)化掃描圈數(shù)直接關(guān)系修飾電極的聚合情況，通過(guò)改變掃描圈數(shù)可制備膜厚度不同的MIP/GO/GCE。在探針溶液中進(jìn)行方波伏安法掃描，掃描圈數(shù)5～25，從峰電流變化情況考察電極聚合情況。結(jié)果顯示，掃描5圈時(shí)印跡電極的峰電流響應(yīng)值較小，這是由于掃描時(shí)間短，在玻碳電極表面形成的聚合膜較薄，當(dāng)洗脫時(shí)能夠得到的“空穴”較少[19]，使得探針溶液中的[Fe(CN)6]3-能夠結(jié)合的位點(diǎn)少，從而導(dǎo)致峰電流響應(yīng)值較小。隨著掃描圈數(shù)的增加，MIP/GO/GCE在探針溶液中的峰電流也增加，在掃描15圈時(shí)峰電流達(dá)到最大。繼續(xù)增加掃描圈數(shù)，MIP/GO/GCE的峰電流呈遞減趨勢(shì)。這是由于掃描時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，聚合膜變厚，使得在洗脫時(shí)洗脫液不易破壞模板分子與功能單體間的氫鍵[20]，從而導(dǎo)致洗脫效果不好，峰電流下降。因此選擇掃描圈數(shù)15為制備MIP/GO/GCE的最佳圈數(shù)。

圖4 模板分子與功能單體的摩爾比對(duì)聚合的影響Fig.4 Influence of different ratios of template molecule to function monomers on polymerization

2.4.3 鄰苯二胺與吡咯的比例優(yōu)化聚合液中的模板分子與功能單體的比例會(huì)影響聚合膜的結(jié)構(gòu)和電化學(xué)性能，因此需考察聚合液中模板分子與功能單體的比例，以尋找最佳配比。固定SA與o-PPD的最佳摩爾比為1∶4，改變Py的用量，使得聚合液中SA∶o-PPD∶Py的摩爾比分別為1∶4∶1、1∶4∶2、1∶4∶3、1∶4∶4、1∶4∶5、1∶4∶6，考察其峰電流響應(yīng)情況，結(jié)果如圖4。當(dāng)SA∶o-PPD∶Py比例為1∶4∶4時(shí)，MIP/GO/GCE峰電流的響應(yīng)值最大，說(shuō)明此比例下有效結(jié)合位點(diǎn)最多，形成的印跡膜最穩(wěn)定。因此，實(shí)驗(yàn)選擇SA∶o-PPD∶Py的最佳摩爾比為1∶4∶4。

圖5 不同洗脫液種類的洗脫效果Fig.5 Effect of different types of eluents

2.4.4 洗脫液的選擇考察了混合洗脫液與單一洗脫液的洗脫效果，結(jié)果如圖5所示，采用乙腈-乙酸(1∶1，體積比)、乙醇-乙酸(1∶1)混合液洗脫SA后，MIP/GO/GCE的峰電流與裸電極的峰電流幾乎無(wú)差別，說(shuō)明洗脫較完全，出現(xiàn)此現(xiàn)象可能是由于乙腈和乙醇均為優(yōu)良的有機(jī)溶劑，在乙酸配合下可將大部分模板分子洗脫下來(lái)[21-22]，甚至?xí)?dǎo)致印跡效果被破壞。采用用水-乙酸混合液(1∶1)雖效果略差，但相對(duì)較為溫和，不會(huì)對(duì)印跡膜造成破壞。單一洗脫液氫氧化鈉、乙醇、甲醇、水及乙酸洗脫后，峰電流響應(yīng)較小(見圖5)，說(shuō)明洗脫不完全，效果不佳。而甲醇-乙酸混合溶液(1∶1)的峰電流響應(yīng)明顯小于水-乙酸(1∶1)混合溶液，綜上，本實(shí)驗(yàn)選擇水-乙酸(1∶1)混合液為最佳洗脫液。

2.4.5 洗脫時(shí)間的優(yōu)化采用方波伏安法考察了不同洗脫時(shí)間對(duì)MIP/GO/GCE峰電流的影響。結(jié)果顯示，峰電流隨著洗脫時(shí)間的增加而增加，在20 min時(shí)達(dá)到平衡，故選擇最佳洗脫時(shí)間為20 min。

2.5 SA分子印跡傳感器的性能研究

2.5.1 吸附平衡時(shí)間的確定將MIP/GO/GCE放入1.0×10-6mol/L SA溶液，采用方波伏安法研究了該電極對(duì)SA的峰電流以及與吸附時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果顯示，隨著吸附時(shí)間的增加，SA分子在MIP/GO/GCE上的峰電流響應(yīng)值呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，當(dāng)吸附21 min后，峰電流趨于平穩(wěn)，表明吸附21 min時(shí)反應(yīng)達(dá)到平衡。為了吸附更加充分，實(shí)驗(yàn)選擇吸附時(shí)間為24 min。

2.5.2 線性范圍與檢出限以MIP/GO/GCE為工作電極，在濃度分別為1.0×10-8、1.0×10-7、1.0×10-6、1.0×10-5、1.0×10-4、1.0×10-3、1.0×10-2mol/L 的SA溶液中，用方波伏安法測(cè)定SA濃度與峰電流的關(guān)系。結(jié)果顯示，在1.0×10-8～1.0×10-2mol/L濃度范圍內(nèi)，MIP/GO/GCE的峰電流(Y)與SA濃度的負(fù)對(duì)數(shù)(lgc)呈線性關(guān)系，線性方程為Y=6.087 5×10-6+9.201 1×10-6lgc(r=0.998 1)，檢出限(S/N=3)為8.6×10-9mol/L。

圖6 SA及其結(jié)構(gòu)類似物在印跡傳感器上的響應(yīng)Fig.6 Selective responses of the imprinted electrochemical sensor for SA and its structural similarities

2.5.3 方法的選擇性選擇與SA結(jié)構(gòu)類似的化合物(乙酰水楊酸、苯甲酸、苯甲醛、對(duì)羥基苯甲酸)作為干擾物進(jìn)行選擇性實(shí)驗(yàn)。分別配制濃度為5.0×10-6mol/L的SA、乙酰水楊酸、苯甲酸、苯甲醛、對(duì)羥基苯甲酸溶液，將MIP/GO/GCE在上述溶液中浸泡吸附24 min，自然干燥后采用方波伏安法在探針溶液中掃描。結(jié)果如圖6所示，SA的峰電流響應(yīng)值最小，這是因?yàn)镸IP/GO/GCE上的“空穴”被SA“填滿”，能結(jié)合探針溶液中[Fe(CN)6]3-的活性位點(diǎn)非常少，故峰電流響應(yīng)值小。取10 μL上述干擾物質(zhì)溶液加入空白PBS溶液中，用方波伏安法掃描印跡電極。由于SA在PBS溶液中以陰離子形式存在，在通電時(shí)與正性的“空穴”結(jié)合形成導(dǎo)電性“網(wǎng)格”，因此其電流響應(yīng)值最大，而干擾分子則因空間構(gòu)型與“空穴”不匹配[23]，所以峰電流響應(yīng)值較小。上述研究說(shuō)明所制備的MIP /GO/GCE僅對(duì)SA有較高的選擇性。

2.6 方法的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

將MIP/GO/GCE置于濃度為1.0×10-7mol/L的SA溶液中，檢測(cè)其峰電流響應(yīng)值，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品平行測(cè)定6次，測(cè)得其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.2%，說(shuō)明MIP/GO/GCE的重現(xiàn)性較好。將MIP/GO/GCE置于pH 6.6的PBS溶液中存放1周后再檢測(cè)1.0×10-7mol/L的SA溶液，其峰電流響應(yīng)值基本穩(wěn)定在原來(lái)的93%左右，說(shuō)明MIP/GO/GCE的穩(wěn)定性較好。

2.7 混合樣品的檢測(cè)

在39 mL空白PBS溶液中加入10 mL 1.0×10-6mol/L對(duì)羥基苯甲酸干擾溶液，再加入1 mL已知濃度為1.0×10-6mol/L的SA溶液，平行測(cè)定MIP/GO/GCE 3次，測(cè)得其加標(biāo)回收率分別為101%、106%、102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%，說(shuō)明此傳感器可以用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

3 結(jié) 論

本文以SA為模板分子，o-PPD與Py作為復(fù)合功能單體，在石墨烯修飾的玻碳電極上制備對(duì)SA具有特定識(shí)別功能的電化學(xué)傳感器。研究顯示，SA在1.0×10-8～1.0×10-2mol/L濃度范圍內(nèi)，分子印跡傳感器的峰電流與SA濃度的負(fù)對(duì)數(shù)呈良好的呈線性關(guān)系，其線性方程為Y=6.087 5×10-6+9.201 1×10-6lgc(r=0.998 1)，檢出限為8.6×10-9mol/L。將所制備的傳感器用于混合樣品檢測(cè)，其回收率為101%～106%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%。該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，為SA的提取、分離和檢測(cè)提供了新思路。