歐盟農(nóng)藥內(nèi)分泌干擾物評價策略簡介

2020-05-09 08:25申繼忠

世界農(nóng)藥 2020年4期

申繼忠

(1.上海艾農(nóng)國際貿(mào)易有限公司，上海 220122；2.江蘇耘農(nóng)化工有限公司，江蘇鎮(zhèn)江 212132)

就全球范圍而言，歐美最早展開內(nèi)分泌干擾物相關(guān)工作。中國也于2015年頒布了《農(nóng)藥內(nèi)分泌干擾作用評價方法》農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

美國環(huán)保局 1996年開始著手內(nèi)分泌干擾物篩選工作。內(nèi)分泌干擾物篩選項目(EDSP)使用兩級辦法篩選農(nóng)藥、化合物和環(huán)境污染物對雌激素、雄激素和甲狀腺激素系統(tǒng)的潛在影響。EPA發(fā)布了包含在EDSP中的52個化合物的篩選結(jié)果。第一階段篩選本來包括67個物質(zhì)。但是，后來有15種被登記持有人撤銷或終止，不再使用，因此不再被篩選。在這52個化合物中，有20個化合物被證明對內(nèi)分泌途徑有潛在影響；有14個化合物顯示出對一種或多種內(nèi)分泌途徑有潛在影響，EPA已經(jīng)有足夠資料得出結(jié)論，它們不構(gòu)成風(fēng)險(即通過第一階段評審)。剩余的 18個化合物都表現(xiàn)出對甲狀腺途徑有潛在影響，其中 17個化合物對雄激素通路有影響，14個化合物對雌激素通路有潛在影響(18個化合物需進(jìn)行第二階段評審)。

歐盟自 1999年就開始內(nèi)分泌干擾物戰(zhàn)略(Strategy on Endocrine Disruptors)。后來歐盟的化學(xué)品立法都將這一戰(zhàn)略考慮在內(nèi)。2013年被歐洲議會和歐盟委員會采納的第 7版環(huán)境行動項目(The 7th Environment Action Programme，簡稱EAP)規(guī)定了統(tǒng)一的有危害的內(nèi)分泌干擾物鑒定標(biāo)準(zhǔn)。歐盟農(nóng)藥新法規(guī)[Regulation (EC) 1107/2009]和殺生物劑法規(guī)[Biocidal Products Regulation (EU) 528/2012]要求建立內(nèi)分泌干擾物鑒定標(biāo)準(zhǔn)。因此，殺生物劑內(nèi)分泌干擾物鑒定標(biāo)準(zhǔn)[Commission Delegated Regulation(EU) 2017/2100]于2017年9月4日發(fā)布，從2018年6月 7日開始實施。農(nóng)藥內(nèi)分泌干擾物鑒定標(biāo)準(zhǔn)[Commission Regulation (EU) No 2018/605]則于2018年4月19日發(fā)布，從2018年11月10開始實施。

2018年6月歐盟頒布了在殺生物劑法規(guī)和農(nóng)藥法規(guī)背景下的內(nèi)分泌干擾物鑒定指導(dǎo)[Guidance for the identification of endocrine disruptors in the context of Regulations (EU) No 528/2012 and (EC) No 1107/2009]。該指導(dǎo)的第3部分是其核心內(nèi)容：即評價某種物質(zhì)是否滿足內(nèi)分泌干擾物標(biāo)準(zhǔn)的策略(Strategy to assess whether a substance meets the endocrine disruptor criteria)。

該指導(dǎo)的目的是為執(zhí)行殺生物劑和植物保護(hù)劑法規(guī)中規(guī)定的 ED標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)指導(dǎo)。該指導(dǎo)服務(wù)對象是登記申請人和農(nóng)藥主管當(dāng)局評審員。

該指導(dǎo)的內(nèi)容包括⑴ 內(nèi)分泌干擾物定義，即與ED標(biāo)準(zhǔn)一樣，采用WHO/IPCS(國際化學(xué)品安全規(guī)劃署)的內(nèi)分泌干擾物定義：“內(nèi)分泌干擾物是一種外源物質(zhì)或混合物，能改變內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能，從而對一個完整的生物體或其后代或(亞)群體造成不利的健康影響”。⑵ 該指導(dǎo)覆蓋雌性激素(estrogen)、雄性激素(androgen)、甲狀腺(thyroid)和類固醇的合成方式(steroidogenesis)，這4項統(tǒng)稱EATS模式的內(nèi)分泌干擾作用機制。但是，對于可獲得的具有非EATS(Non-EATS modalities)作用機制的內(nèi)分泌干擾作用的信息也要予以考慮。⑶ 該指導(dǎo)覆蓋對脊椎動物，即哺乳動物(包括人類)、魚類和兩棲動物的內(nèi)分泌干擾作用，即對人和非靶生物的影響。

本文重點介紹該指導(dǎo)提出的內(nèi)分泌干擾物標(biāo)準(zhǔn)和評價策略。

1 內(nèi)分泌干擾物標(biāo)準(zhǔn)

歐盟殺生物劑法規(guī)[Regulations (EU) No 528/2012]和農(nóng)藥法規(guī)[Regulations (EC) No 1107/2009]分別要求對殺生物劑(biocides)和農(nóng)藥進(jìn)行內(nèi)分泌干擾特性評價。之后又分別發(fā)布了確定殺生物劑和農(nóng)藥之內(nèi)分泌干擾特性的科學(xué)標(biāo)準(zhǔn)[Commission Delegated Regulation (EU) 2017/2100和Commission Regulation (EU) 2018/605]。

確定內(nèi)分泌干擾性質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)有兩套，一是對人，二是對非靶標(biāo)生物。這兩套標(biāo)準(zhǔn)都被進(jìn)一步分為兩部分：第一部分是對 ED進(jìn)行定義，第二部分是確定ED性質(zhì)需要考慮的信息。

第一部分是定義在什么情況下某種物質(zhì)可以被認(rèn)為具有干擾內(nèi)分泌性質(zhì)。這部分對人和非靶標(biāo)生物都是一樣的。

根據(jù) ED標(biāo)準(zhǔn)，如果某種物質(zhì)同時符合下列 3項標(biāo)準(zhǔn)，則該物質(zhì)應(yīng)被視為具有內(nèi)分泌干擾性質(zhì)。3項標(biāo)準(zhǔn)為：⑴ 該物質(zhì)對某種完整的有機體(或其后代)或非靶標(biāo)生物顯示出某種或多種不利影響。這種不利影響包括形態(tài)、生理、生長、發(fā)育、繁殖變化或生物體壽命、系統(tǒng)或(子)群變化。這些變化能導(dǎo)致功能性能力的損傷，這種能力的損傷可彌補額外的壓力或?qū)ζ渌蛩氐拿舾行缘脑黾?；?該物質(zhì)具有內(nèi)分泌活性，即它能改變內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能；⑶ 上述不利影響與評價出來的內(nèi)分泌活性之間有生物學(xué)合理性聯(lián)系。

需要分別針對人類和非靶標(biāo)生物而得出是否滿足 ED標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)論。內(nèi)分泌干擾作用的識別策略需從回答以下兩個問題開始：⑴ 內(nèi)分泌活性與所觀察到的與人類有關(guān)的有害影響之間是否存在生物學(xué)上可信的聯(lián)系；⑵ 內(nèi)分泌活性與所觀察到的在種群水平上的對非靶標(biāo)生物體的不良影響之間是否存在生物學(xué)上可信的聯(lián)系。

上述兩個問題都必須得到解答，并且根據(jù)法規(guī)(EC) No 1107/2009和法規(guī)(EU) No 528/2012的要求，對人類和非靶標(biāo)生物的內(nèi)分泌干擾作用都必須得出結(jié)論。

為評價對人和非靶標(biāo)生物的內(nèi)分泌干擾作用所需要的信息有很多重疊。哺乳動物數(shù)據(jù)總與非靶標(biāo)生物的 ED評價有關(guān)。更有甚者，從非靶標(biāo)生物得到的信息也可能與人的ED評價有關(guān)。

第二部分規(guī)定了確定(包括對人和非靶生物)ED性質(zhì)時需要的信息。根據(jù)ED標(biāo)準(zhǔn)，“所有可得到的相關(guān)數(shù)據(jù)”都必須考慮在內(nèi)，ED標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定采用證據(jù)權(quán)重方法對科學(xué)數(shù)據(jù)予以評價。

評價內(nèi)分泌干擾特性的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：在應(yīng)用證據(jù)加權(quán)時，對科學(xué)證據(jù)的質(zhì)量、可靠性、重現(xiàn)性和一致性的評估要特別考慮表1中的所有因素。針對人類或針對非靶標(biāo)生物體的內(nèi)分泌干擾特性的評估需要考慮的因素不同(表1)。

表1 ED標(biāo)準(zhǔn)中列出的在證據(jù)加權(quán)評價中必須考慮的因素

2 內(nèi)分泌干擾物評價策略

2.1 確定評價策略的總原則

評價策略的制定是為了有效地利用可獲得的數(shù)據(jù)，總的原則是對ED 的評價始于對現(xiàn)有數(shù)據(jù)的利用。前提是數(shù)據(jù)必須符合殺生物劑(農(nóng)藥)法規(guī)要求。其次，只有在必要時才能產(chǎn)生進(jìn)一步的數(shù)據(jù)。第三是對哺乳動物/人以及非靶標(biāo)生物的作用的可獲得的信息要在評價中全面使用。

2.2 確定憑借策略的法規(guī)和技術(shù)依據(jù)

⑴ 殺生物劑和植物保護(hù)劑的內(nèi)分泌干擾物標(biāo)準(zhǔn)(Commission Delegated Regulation (EU) 2017/2100和Commission Regulation (EU) 2018/605)。

⑵ 關(guān)于內(nèi)分泌干擾物測試和評價的 OECD概念框架(OECD CF)：在其中列出可用于評價物質(zhì)之內(nèi)分泌干擾作用的OECD測試指導(dǎo)和其他標(biāo)準(zhǔn)的測試方法。提供測試方法使用指導(dǎo)，但不是測試策略。

⑶ 關(guān)于內(nèi)分泌干擾物評價標(biāo)準(zhǔn)化試驗指導(dǎo)的OECD指導(dǎo)文件150(OECD GD 150)。它有助于解釋ED測試中獲得的結(jié)果(參數(shù))。

2.3 五步評價策略

2.3.1 總策略

⑴ 為了研究內(nèi)分泌活性，應(yīng)采用分步進(jìn)行的方法，使用表2列出的測試數(shù)據(jù)，并考慮到現(xiàn)有的信息，遵循圖1所述的策略。

⑵ 該策略建議進(jìn)行表2列出的第2級測試即離體測試(或使用來自文獻(xiàn)的等效信息)，以減少動物測試，以促進(jìn)MoA分析。

⑶ 按照圖 1的策略，當(dāng)離體測試結(jié)果為陽性時，就足以進(jìn)行作用機制(MoA)分析。

⑷ 然而，如果離體試驗為陰性，由于內(nèi)分泌系統(tǒng)的復(fù)雜性和目前離體試驗的局限性，這通常也不足以證明被試物質(zhì)沒有活體測試內(nèi)分泌活性(因此需要進(jìn)一步的活體試驗)。

表2 推薦的調(diào)查EATS-有關(guān)的內(nèi)分泌活性的試驗方法

2.3.2 評價策略之第一步：搜集所有相關(guān)信息

所有相關(guān)信息包括但不限于：⑴ 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)進(jìn)行研究獲得的數(shù)據(jù)；⑵ 其他科學(xué)數(shù)據(jù)，包括非標(biāo)準(zhǔn)試驗數(shù)據(jù)、QSAR模型和交叉參照(read-across approaches)獲得數(shù)據(jù)、離體方法獲得數(shù)據(jù)、數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)、流行病數(shù)據(jù)、田間、監(jiān)測和種群模擬數(shù)據(jù)等。

其次要根據(jù)農(nóng)藥和殺生物劑等法規(guī)之規(guī)定對數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行評價。把有效研究數(shù)據(jù)(參數(shù))根據(jù)其與ED評價的相關(guān)性歸為如下各組：⑴ 活體方式(in vivo mechanistic)；⑵ 離體方式(in vitro mechanistic)；⑶ EATS-介導(dǎo)的方式(EATS-mediated)；⑷ 對 EATS敏感，但不作為對EATS的診斷。

2.3.3 評價策略之第二步：收集、評價和整合證據(jù)鏈

在搜集所有可獲得的信息后，分組整合證據(jù)鏈:

⑴ 收集和評價來自如下方面的有害影響證據(jù)鏈：① “EATS-介導(dǎo)”的參數(shù)；② “對 EATS敏感”，但不作為對EATS的診斷的參數(shù)。

⑵ 收集和評價來自如下方面的內(nèi)分泌活性證據(jù)鏈：① “離體試驗”參數(shù)；②“活體試驗”參數(shù)；③“EATS-介導(dǎo)的”參數(shù)(活體參數(shù))；④ 整合有害影響和內(nèi)分泌活性兩方面證據(jù)鏈；⑤ 報告數(shù)據(jù)鏈。

2.3.4 評價策略之第三步：證據(jù)的初步分析

通過對證據(jù)的分析，可以得出3種結(jié)論：

⑴ 在下面情況下，可以得出“不符合ED標(biāo)準(zhǔn)”的結(jié)論：① “EATS-介導(dǎo)”的參數(shù)得到充分研究但是沒有觀察到EATS介導(dǎo)的有害影響；或者 ②內(nèi)分泌活性得到充分研究但是沒有觀察到內(nèi)分泌活性(而且沒有EATS介導(dǎo)的有害影響)。

⑵ 在下面情況下轉(zhuǎn)向作用機制(MoA)分析：①觀察到EATS介導(dǎo)的有害影響；或② 觀察到內(nèi)分泌活性。

⑶ 在下面情況下，需要生成新的信息(數(shù)據(jù))：沒有發(fā)現(xiàn) EATS介導(dǎo)的有害影響而且沒有觀察到內(nèi)分泌活性，但是內(nèi)分泌活性沒有得到充分研究。

2.3.5 評價策略之第四步：作用機制(MoA)分析

當(dāng)潛在的與內(nèi)分泌有關(guān)的有害影響和內(nèi)分泌活性被確定后，則兩者之間的生物學(xué)合理性聯(lián)系必須得到確立(利用現(xiàn)代科學(xué)知識和證據(jù)權(quán)重方法)。這種“生物學(xué)合理性聯(lián)系”就是作用機制。內(nèi)分泌干擾物的作用機制(MoA)是指能導(dǎo)致特定有害影響的一系列生物學(xué)事件(KE)，這些事件產(chǎn)生有害影響。至少這些生物學(xué)事件之一牽涉到內(nèi)分泌干擾系統(tǒng)的一個或多個要素。

MoA分析步驟：

⑴ 首先假定有害影響和/或內(nèi)分泌活性作用機制(MoA)，如表3。

⑵ 建立生物學(xué)合理性聯(lián)系，可能是如下一種或幾種：① EATS-介導(dǎo)的有害影響；② 對EATS參數(shù)敏感但不能作為診斷依據(jù)的有害影響；③ 基于非-EATS內(nèi)分泌參數(shù)的有害影響；④ 多作用機制；⑤替代性非-內(nèi)分泌作用機制。

⑶ 考慮哪些進(jìn)一步的信息有助于闡明假定的作用機制。

⑷ 另外還要考慮非-內(nèi)分泌或非-EATS介導(dǎo)的作用機制。

⑸ 所獲得證據(jù)對作用機制分析全面評價的支持程度。

⑹ 得出MoA分析的結(jié)論。

2.3.6 評價策略之第五步：所評價物質(zhì)是否符合ED標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)論

⑴ 根據(jù)足夠的數(shù)據(jù)集，沒有觀察到“EATS-介導(dǎo)”的有害作用，或者內(nèi)分泌活性呈陰性，則可以忽略(by-passed)作用機制(MoA)分析，從而得出不符合ED標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)論。

⑵ 如果某種作用機制(MoA)是基于“EATS-介導(dǎo)”的有害影響，那么就被認(rèn)為符合ED標(biāo)準(zhǔn)，除非證明替代性非-內(nèi)分泌作用機制是更好的解釋。

⑶ 如果某種作用機制是建立在“對EATS敏感性而非診斷性”有害作用的基礎(chǔ)上，并且大量證據(jù)支持有害作用和內(nèi)分泌活性之間的生物學(xué)合理性聯(lián)系，那么就認(rèn)為符合ED標(biāo)準(zhǔn)，除非證明替代性非-內(nèi)分泌作用機制是更好的解釋。

2.3.7 草甘膦案例

2016年，歐盟委員會要求歐洲食品安全局考慮該農(nóng)藥潛在的內(nèi)分泌活性信息。評估報告說：“目前的評估得出的結(jié)論是，大量證據(jù)表明，草甘膦不會通過雌激素、雄激素、甲狀腺或類固醇生成的方式干擾內(nèi)分泌。該研究基于毒理學(xué)領(lǐng)域的全面數(shù)據(jù)庫?！笔称钒踩珯C構(gòu)2017年9月7日發(fā)布的評估報告發(fā)現(xiàn)，沒有證據(jù)表明草甘膦對人體激素系統(tǒng)有有害影響。歐洲食品安全局(EFSA)得出結(jié)論，世界上使用最多的農(nóng)藥草甘膦不具有內(nèi)分泌干擾特性。這一結(jié)果也與美國環(huán)境保護(hù)署在2015年6月得出的結(jié)論一致。

圖1 在內(nèi)分泌干擾物評估背景下調(diào)查EATS-有關(guān)的內(nèi)分泌活性的試驗策略

表3 假定的作用機制(MoA)舉例

但是，一項新的研究表明，草甘膦制劑(農(nóng)達(dá))是一種成年雄性大鼠內(nèi)分泌干擾物。測試發(fā)現(xiàn)最低劑量10 mg/kg bw/d的草甘膦可降低大鼠皮質(zhì)脂酮水平，皮質(zhì)脂酮是腎上腺產(chǎn)生的類固醇激素。因為沒有發(fā)現(xiàn)草甘膦在這種劑量下有其他毒性作用，所以如果沒有專門研究草甘膦對內(nèi)分泌的影響，就不會有其他跡象表明這種劑量的草甘膦有毒。研究人員并沒有針對更低劑量水平的農(nóng)達(dá)進(jìn)行測試，因此不知道在內(nèi)分泌紊亂方面是否存在“安全”的低劑量農(nóng)達(dá)。在技術(shù)上，這意味著沒有發(fā)現(xiàn) NOAEL(沒有觀察到的不良影響水平)。

3 評價內(nèi)分泌干擾物所需信息來源

根據(jù)上述內(nèi)分泌干擾物評價策略可知，收集各種信息，包括試驗數(shù)據(jù)、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)以及各種非試驗數(shù)據(jù)等。表4歸納了該指南給出的評價內(nèi)分泌干擾物需要收集的信息來源。

表4 支持內(nèi)分泌干擾物評價的信息來源

此外，OECD GD150提供了各種分級測試方法指導(dǎo)，共分為5級。很多數(shù)據(jù)都是由這些試驗產(chǎn)生。為便于參考，特將這些方法指導(dǎo)列出(表4-8)。

表5-9所列是OECD測試指導(dǎo)和現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)測試方法。所列方法不完全是目前內(nèi)分泌干擾物評價策略所要求的，只是提供現(xiàn)有的測試方法名單以及它們所能提供的信息。由于內(nèi)分泌干擾領(lǐng)域仍在發(fā)展中，因此，這些方法也要經(jīng)歷不斷變化。目前美國環(huán)保局內(nèi)分泌干擾物篩選項目(EDSP)采取的兩級篩選體系所用的方法中的某些方法未來可能由替代方法所取代(表10)。

表5 第一級測試方法(現(xiàn)有數(shù)據(jù)好而非測試信息)

4 結(jié) 語

歐盟內(nèi)分泌干擾物鑒定指導(dǎo)為申請者和主管機構(gòu)的評價者提供進(jìn)行 ED評價或評估的指導(dǎo)。該評價策略的建立是為了有效地利用可用的數(shù)據(jù)。針對殺生物劑登記所要求的核心數(shù)據(jù)集可能足以進(jìn)行ED評價，只有當(dāng)必要時才進(jìn)行更多數(shù)據(jù)的生產(chǎn)。對EATS-介導(dǎo)的有害影響的知識可能足以進(jìn)行作用機制(MoA)分析并對內(nèi)分泌活性與有害作用之間的生理上的合理性聯(lián)系做出結(jié)論。