李紅霞，高 靜，王文濤，王欣童，溫華珍，林吉柏

(北京穎泰嘉和分析技術有限公司，北京 102206)

我國是農(nóng)藥生產(chǎn)大國，也是農(nóng)藥出口大國。隨著農(nóng)藥市場的開放，我國農(nóng)藥企業(yè)加快開拓國外市場。農(nóng)藥進入相關國家市場前須在各國相關部門進行登記，獲取批準。農(nóng)藥境外登記人員在準備登記一個農(nóng)藥產(chǎn)品之前，需要先對該產(chǎn)品的可行性、運營模式和登記時間、費用等進行分析，確定其數(shù)據(jù)缺口，從而進行相關的試驗安排。在獲取試驗報告后，準備相應的卷宗，提交后跟蹤進度，直至獲得登記許可。

良好實驗室規(guī)范(Good Laboratory Practice，GLP)是一種質(zhì)量管理體系，是實驗室研究從計劃、試驗、監(jiān)督、記錄到試驗報告等一系列的管理而制定的法規(guī)性文件，用于對農(nóng)藥、醫(yī)藥等化學品進行安全性評價。GLP的目的就是降低試驗的誤差，確保試驗結(jié)果的真實性。許多國家在登記資料要求中，都規(guī)定企業(yè)提交的數(shù)據(jù)報告需由具有GLP資質(zhì)的實驗室出具。因此，作為境外登記人員，需要了解GLP項目的基本程序，委托、跟蹤 GLP項目執(zhí)行及審閱GLP報告時應重點關注的問題。本文概要介紹了境外登記人員如何進行相關的試驗委托，并對幾種常見的登記試驗項目如何進行審閱做了重點闡述。

1 選擇適合的GLP實驗室

境外登記人員在進行登記試驗準備工作時首先要確認登記試驗的種類，研究擬申請登記國家的相關要求，對可以提交查詢數(shù)據(jù)的材料，不需要安排GLP試驗，以避免不必要的資源浪費；但對登記資料要求中明確規(guī)定有關數(shù)據(jù)和報告必須符合GLP要求的項目，則必須選擇由具有GLP資質(zhì)的實驗室開展試驗并出具報告。此時，選擇、確定合適的GLP實驗室，就成為保障境外登記成功非常重要的一個環(huán)節(jié)。首先，境外登記人員要對備選的實驗室資源進行分析，考察GLP實驗室的資質(zhì)、能力以及GLP報告提交該國的通過情況等；其次，對GLP實驗室的報價、時間安排和周期等進行考察。此外，境外登記人員還要特別注意備選的GLP實驗室是否有多個地址，試驗在哪里進行等問題。

需要特別指出的一個細節(jié)是，境外登記人員在選擇GLP實驗室時還要考慮到擬登記產(chǎn)品的性質(zhì)及運輸條件，例如烯草酮這類易降解產(chǎn)品對運輸條件要求較高，優(yōu)先選擇本地的GLP實驗室會減少GLP試驗的風險。

2 明確委托方及受托 GLP實驗室的責任與義務

根據(jù)經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD) GLP準則[1]的定義，委托方是指委托、資助及提交非臨床健康和環(huán)境安全研究的實體和單位。試驗委托方在GLP準則實施中有很多的任務和責任，GLP項目不單是GLP實驗室的責任，委托方參與整個GLP項目的過程，從確定項目內(nèi)容，提供相應信息開始，到樣品確認，方法篩選，雜質(zhì)確認，簽署研究計劃，試驗期間的溝通，審閱、審批最終報告等，委托方都不可或缺。

委托方在項目運行的各個階段都需要明確其相應的職責并發(fā)揮作用：⑴ 試驗前階段：委托方需要對實驗室的資源進行分析，確認要進行的試驗類型，登記地所要求的試驗指南，提供合適的被試物信息。明確委托方和試驗機構的各自職責。⑵ 計劃書階段：對預試驗結(jié)果、試驗計劃、企標情況和可能出現(xiàn)問題等進行溝通。⑶ 試驗階段：當試驗結(jié)果出現(xiàn)問題或可疑數(shù)據(jù)等要及時溝通。例如動物死亡的原因，劑量調(diào)整，異常數(shù)據(jù)等。⑷ 報告階段：要仔細審核草稿報告，對出現(xiàn)的問題及時聯(lián)系實驗室進行修改或者補充試驗。當提交最終報告遇到登記當局的疑問時，要及時聯(lián)系實驗室協(xié)助解決。

在GLP項目的運行中，委托方要注意把關好被試物的質(zhì)量，提供的相應信息準確無誤，并在GLP項目運行期間和實驗室保持良好溝通。與此同時，承擔項目的GLP實驗室要嚴格按照程序要求進行試驗，確保試驗的質(zhì)量，并及時匯報溝通。只有委托方和實驗室雙方通力合作、溝通順暢，才能確保GLP項目的順利完成。

3 實施GLP項目的基本程序

進行一個GLP項目的基本程序如下：⑴ 委托方和 GLP實驗室簽署協(xié)議，確認要進行的項目及檢測內(nèi)容。⑵ 委托方提供被試物及相關信息。⑶ GLP實驗室獲得樣品后展開預試驗。⑷ GLP實驗室撰寫項目試驗計劃方案，質(zhì)量保證人員(QA)審核，委托方進行確認。⑸ GLP實驗室根據(jù)審核批準后的試驗計劃實施GLP試驗。⑹ GLP實驗室根據(jù)試驗結(jié)果出具草稿報告，經(jīng)QA和委托方審核后出具最終簽字版報告。

4 跟進GLP項目試驗過程

根據(jù)OECD GLP準則[1]的要求，試驗項目負責人(SD)是對試驗項目的實施和管理全面負責的人員，SD的首要職責是確保研究工作遵從GLP的要求。在GLP試驗體系中，質(zhì)量保證是一個獨立于試驗操作、旨在保證試驗單位遵循GLP準則的系統(tǒng)。QA會科學、客觀地對試驗設施、GLP軟硬件運轉(zhuǎn)狀態(tài)、研究計劃、試驗操作、原始數(shù)據(jù)及試驗報告等是否符合GLP規(guī)范進行監(jiān)督檢查。

GLP實驗室對其GLP項目的試驗過程有嚴格的要求，所有操作都需要按照實驗室的標準操作程序進行，試驗過程嚴格按照計劃書執(zhí)行。計劃書、試驗關鍵過程及最終報告QA都會進行審查以確保研究工作遵從GLP。境外登記人員在GLP項目實施過程要和SD保持良好的溝通以便GLP項目順利實施。

GLP項目的最終成果是GLP報告，境外登記人員最需要關注的就是GLP項目的報告。根據(jù)GLP準則要求，每個試驗項目均應當有一份最終試驗報告。試驗項目負責人應在最終試驗報告上簽署姓名和日期，對數(shù)據(jù)有效性、真實性和完整性負責，同時說明遵從本規(guī)范和試驗計劃的程度，以及偏離對試驗結(jié)果的影響。試驗報告修訂應明確說明修改或補充的理由，并由試驗項目負責人簽署姓名和日期。此外，最終試驗報告需要包括以下內(nèi)容：⑴ 試驗項目基本情況；⑵ 委托方和試驗單位的情況；⑶ 試驗開始時間和完成時間；⑷ QA聲明，QA聲明中需要列出檢查類型、檢查內(nèi)容、檢查結(jié)果等信息；⑸ 儀器、試劑、材料和方法等信息；⑹ 項目中的偏離和修訂，需要說明偏離規(guī)范和試驗計劃的程度，評價偏離的影響；⑺ 所做試驗的描述和結(jié)果，需要報告所用試驗計劃中要求的所有信息和數(shù)據(jù)。

境外登記人員在審閱GLP報告時，尤其要注意報告中的GLP遵循部分的說明，這部分內(nèi)容會說明該項目對遵循GLP準則程度或情況。正常情況下，GLP遵循中除被試物的信息或有些基于SD經(jīng)驗做出的譜圖解析或解釋之外，其他不遵循GLP準則的地方要特別引起重視，可能會對登記造成不良影響。此外，審閱人也要特別注意報告中的偏離和修訂，判斷其是否影響整個報告質(zhì)量。

5 審閱GLP報告及重點注意事項

GLP項目需要完全按照簽署的研究計劃進行實施，而GLP報告需要完全精確地反映研究的實施和研究數(shù)據(jù)。不管是試驗方案還是報告草案都需要仔細的審查，一旦簽字確認后，根據(jù)GLP的規(guī)范，任何的修改都需要以修訂或偏離的形式出現(xiàn)，并顯示在報告中。如果修訂或偏離過多，可能會降低登記審查機關對該GLP報告的好感，影響登記進程。無論是GLP實驗室，還是作為委托方代表的登記人員或咨詢顧問，都要在草案階段盡可能的去避免相應的錯誤和疏漏。

中國絕大多數(shù)企業(yè)的產(chǎn)品境外登記是相同產(chǎn)品登記，本文就目前市場相同產(chǎn)品登記中經(jīng)常使用的幾種類型的GLP項目，整理了一些需要重點注意的事項以供參考。

5.1 GLP項目中的信息審閱

根據(jù)不同國家的要求，檢測項目和導則會不同。在GLP項目的草稿計劃過程中，實驗室和委托方一定要審查研究計劃中的檢測項目和對應的試驗方法和導則。提供準確的樣品信息是委托方的責任，樣品信息雖然看起來簡單，但是出現(xiàn)的問題很多，要給予特別重視。樣品產(chǎn)品分析單(COA)中容易出現(xiàn)如下情況：⑴ COA中樣品名稱、物理特性等與GLP試驗中使用的不一致；⑵ COA中質(zhì)檢報告日期晚于試驗開始日期；⑶ COA中含量、批號與試驗使用的不一致；⑷ 同一個批號供試品的COA不一樣，或者單位印章位置不同；⑸ 樣品COA信息與郵件、方案中不一致；⑹ 樣品COA保存條件前后不一致；⑺ 樣品COA中含量與GLP報告中差距較大；⑻ 樣品COA中只有公司印章，沒有責任人簽字；⑼ 需要注意，在巴西除五批次外的GLP報告都需要GLP的COA。

此外，在進行GLP項目中，有時需要委托方提供其他與試驗相關的數(shù)據(jù)，如分散性、持久起泡性和懸浮性等，需要提供稀釋倍數(shù)等。

5.2 五批次項目審閱

農(nóng)藥原藥的五批次分析是指針對有效成分、含量達到0.1%及以上的任何顯著雜質(zhì)，以及FAO (聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織)、WHO (世界衛(wèi)生組織)、歐盟或者是各國農(nóng)藥主管部門規(guī)定的相關雜質(zhì)定性和定量分析。五批次全分析鑒定出的組分總量在98%～102%，一般是由委托方提供五個批次的工業(yè)化原藥來進行。

GLP的五批次報告是進行國外市場開發(fā)及農(nóng)藥登記不可或缺的重要技術資料。目前絕大多數(shù)國家的登記都需要提供五批次報告，一些中高端市場更是日趨嚴格，越來越多的市場要求登記申請人提供 GLP五批次報告。五批次報告是解析原藥產(chǎn)品組分的核心登記資料，是判定原藥產(chǎn)品質(zhì)量是否合格的關鍵要素，也是農(nóng)藥藥效、毒理和環(huán)境等一系列試驗的源頭。

GLP的五批次報告對判斷產(chǎn)品的質(zhì)量至關重要，該報告的結(jié)論直接反映了原藥的品質(zhì)。在幾乎所有的高端市場，原藥的五批次分析報告還作為評價原藥產(chǎn)品是否符合相同產(chǎn)品的判定依據(jù)，直接決定產(chǎn)品是否可以按照相同產(chǎn)品原則進行登記——即是否可以以最低的登記成本取得登記。一份高質(zhì)量的五批次報告，幾乎可以在全球通用，可以說是市場開發(fā)的敲門磚。

對于GLP的五批次報告的具體要求，各國之間存在一定的差別。對于GLP的五批次報告的格式，除了符合OECD GLP導則中的規(guī)定內(nèi)容外，美國環(huán)境保護署(EPA)提出了一定的要求，如報告要增加是否有保密部分的聲明等[2]。按照美國EPA要求出具的GLP報告在其他國家提交基本沒有問題，一般不需要為各國準備各自的報告模板。在五批次項目運行過程中，實驗室和委托方還要注意以下這些可能存在的問題。

5.2.1 各國對五批次的不同要求

一般而言，各國對五批次的定性、定量的要求基本一致，有效成分的定性一般2種方法就可以(一般接受核磁共振波譜和質(zhì)譜法定性)，定量分析方法驗證也基本都認可遵從歐盟的SANCO 3030[3]指南。但在細節(jié)要求上，還存在一定的差異，需要實驗室和委托方給予重視。

歐盟會根據(jù)生產(chǎn)工藝的資料來評估原藥整個生產(chǎn)過程中用到的所有溶劑或溶劑催化劑的毒性。毒性評估可以直接從官網(wǎng)上下載 MSDS (物質(zhì)安全數(shù)據(jù)單)，并對毒性進行比較。如果所用溶劑的毒性大于原藥主成分的毒性，就需要對溶劑進行測定。在實驗室檢測過程中，建議將定量限設為至多 0.01%或0.02%，以保證溶劑不會影響原藥的毒性。此外，溶劑測定的期限最好是距離生產(chǎn)日期近一些，這樣更容易反映出在生產(chǎn)過程中溶劑的真實殘留情況。

5.2.2 五批次GLP報告中的雜質(zhì)確認及毒性評價

GLP的五批次分析一般包含2個階段，首先是實驗室進行的預掃描階段，這部分內(nèi)容不體現(xiàn)在GLP五批次報告中。在這個階段，實驗室和委托方要確認正式GLP試驗中要進行檢測的雜質(zhì)，包括毒性相關雜質(zhì)和大于0.1%的任何顯著雜質(zhì)。這是一個五批次報告是否能順利拿到等同登記的關鍵，需要委托方和實驗室共同確認。在確認好雜質(zhì)種類及準備好雜質(zhì)標準品后，實驗室就進入到GLP階段，對有效成分及雜質(zhì)進行定性、定量分析。

表1 各國對GLP五批次報告的特殊要求

因此，確認及收集有關產(chǎn)品的雜質(zhì)信息非常重要，這對評估產(chǎn)品是否符合登記要求以及制定研究計劃等非常有幫助。除了FAO/WHO規(guī)格上會提到相關雜質(zhì)，在歐盟、澳大利亞和加拿大等官網(wǎng)上可以查詢及下載已登記產(chǎn)品的評價報告，會提及需要關注的雜質(zhì)。GLP的五批次報告必須滿足登記國的要求，要考慮到報告的使用范圍，確認好相關雜質(zhì)。

對于顯著雜質(zhì)而言，其是否會有毒性，是否會影響登記是委托方非常關心的問題。對于不確認的雜質(zhì)，可以根據(jù)預分析的結(jié)構，先用定量構效關系(QSAR)來評判一下該化合物的毒性。QSAR是指定量的構效關系，是使用數(shù)學模型來描述分子結(jié)構和分子的某種生物活性之間的關系。有很多免費的QSAR軟件可以幫助來進行毒性評估，如 QSAR toolbox、Toxtree、VEGA等。

5.2.3 農(nóng)藥的儲存條件

大部分農(nóng)藥在常溫下儲存，其雜質(zhì)及性質(zhì)長時間不會發(fā)生改變。但有些特殊農(nóng)藥要特別注意特殊儲存條件以免影響到五批次的結(jié)果。吸水性強的農(nóng)藥，如煙嘧磺隆，需要在干燥條件下儲存，實驗室在稱量樣品時也需要注意空氣中水分的影響。有些農(nóng)藥在常溫下易分解，主成分含量還沒有顯著變化時，雜質(zhì)變化就已經(jīng)異常明顯，如烯草酮原藥，建議最好選擇國內(nèi)實驗室進行分析，且以冷凍狀態(tài)進行運輸，避免運輸途中雜質(zhì)發(fā)生變化。

5.2.4 水分、不溶物等其他組分

水分含量是五批次項目中必須測試的項目。有些時候，根據(jù)不同產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝，需要做干燥失重、不溶物或硫酸鹽灰分等項目。在進行這些項目時，要多思考其相關性。如干燥失重量遠大于水分含量，需要解釋其他組分可能會是什么。五批次報告中的不溶物如果含量超過0.1%，在韓國登記時會被要求對這些不溶物進行定性。

此外，在GLP五批次分析中，也要格外注意樣品的COA和五批次檢測項的符合程度，雖然可能由于測量方法的不同造成 COA中的含量和五批次結(jié)果中不一致，但是如果相差太大，將難以解釋。

5.2.5 農(nóng)藥的異構體現(xiàn)象

農(nóng)藥的異構體現(xiàn)象很普遍，其異構體分幾何異構體和光學異構體。有的異構體之間，生物活性有明顯甚至很大的差別，有的則差別不明顯。在GLP五批次報告中，實驗室首先需要仔細查詢該農(nóng)藥的有效組分究竟是其中的單一組分還是混合體。一般而言，如果有效成分是混合體，可以不用分開檢測，但是各國對異構體拆分要求的嚴格程度不同，需要根據(jù)登記市場進行確認。此外，雜質(zhì)的光學異構體一般不再要求拆分檢測。

5.2.6 質(zhì)量平衡及產(chǎn)品規(guī)格

五批次GLP全分析分析報告中鑒定出的組分總量應該為 98%～102%，當測得的各種組分含量的總和不足98%時，應采用其他可能的方法進一步鑒定分析；當各種組分含量的總和超過102%時，應分析原因并做出合理解釋。絕大部分國家在制定登記產(chǎn)品的規(guī)格時，是根據(jù)五批次GLP報告中的平均數(shù)據(jù)加減三倍標準偏差進行計算的，所以在預分析階段，就要關注其結(jié)果的可能分布情況。

5.3 理化項目審閱

任何化學物質(zhì)都具有自己獨特的物理性質(zhì)和化學性質(zhì)。物理性質(zhì)是指不經(jīng)過化學變化就能體現(xiàn)出來的性質(zhì)，如外觀、熔點和密度等；化學性質(zhì)是物質(zhì)經(jīng)過化學變化才能體現(xiàn)出來的性質(zhì)，如閃點、燃點、可燃性和爆炸性等。物理性質(zhì)和化學性質(zhì)簡稱“理化性質(zhì)”或“物化性質(zhì)”。

和五批次GLP報告不同，各國和地區(qū)對理化性質(zhì)報告的要求差別很大，這就要求委托方在進行理化試驗項目的安排前，必須先設計好要登記的國家及地區(qū)。此外，在審閱理化項目中，還需要關注如下問題。

5.3.1 理化性質(zhì)的導則

理化性質(zhì)有很多國際通用的導則文件，普遍使用的有經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)、歐盟(EU)、美國環(huán)境保護署(EPA)及國際農(nóng)藥分析協(xié)作委員會(CIPAC)方法，它們之間既有聯(lián)系也有不同。GLP實驗室在進行項目前需要仔細核對。

很多指南對某個理化性質(zhì)給出了多種測試方法，一般情況下可酌情選擇其中一種。比如密度的測量有8種方法，蒸氣壓的測定有6種方法等。在使用不同的分析方法時，要注意指南對應的檢測范圍是否合適。

表2 理化性質(zhì)的國際指南文件

5.3.2 和文獻值不一致的情況

在實施理化性質(zhì)測定中，實驗室和委托方有時會發(fā)現(xiàn)，GLP報告中的數(shù)據(jù)和文獻報道值相差很大，這一方面可能是由于不同實驗室使用了不同的分析方法；另外一方面，不同實驗室之間的操作也會引起一定的差異。尤其是數(shù)值較小的檢測項目，如蒸氣壓，不同的分析方法測定的結(jié)果差異很大。在遇見結(jié)果差異很大的情況下，實驗室應該首先進行自查，看是否屬于自身操作引起的誤差，并合理分析偏差存在的原因。

5.4 毒理項目審閱

毒理試驗項目可以簡單分為生態(tài)毒理和哺乳動物毒理。生態(tài)毒理試驗是研究各種有毒有害因素，尤其是化學環(huán)境污染物對生態(tài)環(huán)境影響及其對人類之外其他生物種類包括動物、植物和微生物等的損害作用。哺乳動物毒理試驗是研究外來化合物對生物體的損害作用及其機理。哺乳動物毒理試驗主要是應用動物來進行，所觀察到的毒性反應與人體有很多相似之處，但有些方面也有很大差異。因此，一定要進行綜合分析，不能簡單外推于人。

不同國家和地區(qū)對毒理試驗的要求差別很大。目前只有巴西對生態(tài)毒理項目有要求，墨西哥和泰國等國家要求急性毒理試驗，巴西、阿根廷和中國臺灣除了急性毒性試驗外，還要求致突變試驗。因此，委托方必須要確認好要登記地區(qū)的要求。此外，毒理試驗中還應該注意以下問題。

5.4.1 試驗導則

絕大多數(shù)國家和地區(qū)都認可按照OECD的試驗導則進行的GLP試驗，但對于同一個試驗，OECD也有多種指南文件，比如急性經(jīng)口毒性試驗方法，就有 OECD TG420-固定劑量法(Fixed dose procedure，F(xiàn)DP)、OECD TG423-分級試驗法(Acute toxic class method，ATC)和 OECD TG425-序貫法或上下移位法(Up-and-down procedure，UDP)。其中OECD TG423為大多數(shù)國家接受的方法。GLP實驗室和委托方都要清楚這些要求及區(qū)別所在。

此外，由于毒理試驗導則的更新較為頻繁，試驗室需要隨時關注OECD網(wǎng)站上的更新，了解最新要求，避免使用已廢止的導則進行GLP試驗。

5.4.2 體外替代試驗的新要求

因動物福利及動物試驗方法的不確定性等原因，現(xiàn)在各國正推進毒性測試替代方法的進程。即使用沒有知覺的試驗材料代替活體動物，或使用低等動物代替高等動物進行試驗。目前歐盟和巴西已經(jīng)做出了相應的要求，因此實驗室和委托方應關注各國對體外替代試驗的要求，使報告符合登記注冊的要求。

5.4.3 毒性等級

在進行毒理試驗時，有時候需要用統(tǒng)計軟件計算出毒性大小，通常用半致死中量(LD50)或致死中濃度(LC50)表示。毒性等級決定該農(nóng)藥產(chǎn)品是否能順利登記。當毒性數(shù)據(jù)落在兩個等級之間的數(shù)值時，要特別注意是否是統(tǒng)計方法引起的差異性。

5.4.4 文獻數(shù)據(jù)

一般情況下，農(nóng)藥電子手冊是境外登記人員經(jīng)常查詢的資料之一，需要注意的是農(nóng)藥電子手冊上的數(shù)據(jù)存在一定的誤差。當審閱草稿報告時，發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥產(chǎn)品和文獻數(shù)據(jù)不一致的情況時，要查詢該產(chǎn)品在各國的登記材料加以佐證。

5.4.5 病理學報告

毒理病理學報告是一般毒理試驗、嚙齒類致癌性試驗以及生殖發(fā)育毒理試驗等GLP試驗需要的。毒理病理學報告要求較高，專題病理學家要具有病理學專業(yè)技能，并在毒理病理報告中簽字。毒理病理學報告中應該有試驗方法、數(shù)據(jù)及特殊切片或技術的詳細描述，并且有清晰的照片、圖片幫助登記機構對結(jié)果進行確認。此外，報告中還需要給出給藥相關的生物學和毒理學關系等的相關科學文獻或試驗背景數(shù)據(jù)等。

6 結(jié) 語

我國是農(nóng)藥生產(chǎn)和出口大國，要開拓海外市場，優(yōu)秀的GLP報告是不可或缺的工具。GLP實驗室和企業(yè)委托方是保證其質(zhì)量的兩大支柱。

一份優(yōu)秀的 GLP報告要有國際通用的導則(一般是OECD Guidelines)，以及國際通用的統(tǒng)計學方法，要完全按照導則中要求的試驗條件、物種、年齡、性別和環(huán)境等條件等進行試驗。在GLP報告中需要描述試驗的詳細步驟、給藥方法、觀察方法、毒性反應癥狀、體重變化、死亡時間、LD50和LD5及其可信限的計算方法和結(jié)果討論等。試驗報告中要提供各種清晰可辨代表性譜圖或圖片，要具有科學性的令人信服的解釋。

隨著我國企業(yè)對農(nóng)藥海外登記的重視，及國內(nèi)GLP實驗室的興起，相信中國農(nóng)藥企業(yè)能夠獲得在國際市場更多的話語權，實現(xiàn)由農(nóng)藥大國向農(nóng)藥強國的轉(zhuǎn)變。