沈明芳　李園　郭志琴　郭曉珺　曾惠

[摘要] 目的 研究彌漫大B細胞淋巴瘤組織中細胞分裂周期蛋白6（CDC6）表達情況，分析CDC6 mRNA表達與彌漫大B細胞淋巴瘤臨床病理特征、預后的關系和意義。 方法 收集2012年1月～2018年12月期間我院60例DLBCL病例，以同期20例淋巴結反應性增生組織作為對照，采用實時熒光定量RCR（real-time PCR）檢測其CDC6 mRNA的表達水平，并分析CDC6 mRNA與DLBCL患者臨床病理特征及預后的關系。 結果 CDC6 mRNA在DLBCL中的表達量（0.441±0.070）較淋巴結反應性增生組織（0.113±0.029）顯著增高（P<0.05）;CDC6 mRNA在DLBCL中的上調與Hans分型中non-GCB亞型存在相關性（P=0.001）;單因素分析顯示，高表達CDC6 mRNA、臨床分期Ⅲ+Ⅳ期、IPI評分3～5分、LDH升高（>245 U/L）、貧血（Hb<100 g/L）、Hans分型non-GCB 亞型均與DLBCL患者不良預后有關;多因素Cox分析顯示，高表達CDC6 mRNA、貧血、non-GCB亞型是影響DLBC預后的獨立危險因素（P=0.006;0.001;0.022）。 結論 CDC6 mRNA表達與淋巴瘤關系密切，高表達CDC6 mRNA可能與DLBCL患者不良預后有關，可作為DLBCL患者預后的獨立危險因素。

[關鍵詞] 彌漫大B細胞淋巴瘤;細胞分裂周期蛋白 6;非生化中心B細胞樣亞型;預后因素

[中圖分類號] R733.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）07-0018-05

Expression of CDC6 mRNA in diffuse large B cell lymphoma and its clinical significance

SHEN Mingfang1? ?LI Yuan1? ?GUO Zhiqin2? ?GUO Xiaojun1? ?ZENG Hui1

1.Department of Hematology， the First Hospital of Jiaxing City in Zhejiang Province， Jiaxing? ?314000， China; 2.Department of Pathology， the First Hospital of Jiaxing City in Zhejiang Province， Jiaxing? ?314000， China

[Abstract] Objective To study the expression of cell division cycle protein 6（CDC6） in diffuse large B cell lymphoma（DLBCL）， and to analyze the relationship between the expression of CDC6 mRNA and the clinicopathological features and prognosis of DLBCL. Methods 60 cases of DLBCL treated in our hospital from January 2012 to December 2018 were selected. 20 cases of reactive hyperplasia of lymph nodes in the same period were used as the control group. Quantitative real-time RCR（real-time PCR） was used to detect the expression level of CDC6 mRNA， and the relationship between CDC6 mRNA and clinical pathological characteristics and prognosis of DLBCL patients was analyzed. Results The expression of CDC6 mRNA in DLBCL（0.441±0.070） was significantly higher than that in reactive hyperplasia of lymph nodes（0.113±0.029）（P<0.05）. The up-regulation of CDC6 mRNA in DLBCL was correlated with non-GCB subtype of Hans（P=0.001）. Univariate analysis showed that high expression of CDC6 mRNA， clinical stage Ⅲ+Ⅳ， IPI score 3-5， LDH increase（>245 U/L）， anemia（Hb<100 g/L） and non-GCB subtypes of Hans were all related to the poor prognosis of DLBCL patients. Multivariate Cox analysis showed that high expression of CDC6 mRNA， anemia and non-GCB subtypes were independent risk factors for DLBCL prognosis（P=0.006; 0.001; 0.022）. Conclusion The expression of CDC6 mRNA is closely related to lymphoma. The high expression of CDC6 mRNA may be related to the poor prognosis of DLBCL patients， which can be an independent risk factor for the prognosis of DLBCL patients.

[Key words] Diffuse large B cell lymphoma; Cell division cycle protein 6; Non-germinal center B-cell-like; Prognostic factors

彌漫大B細胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是成人侵襲性淋巴瘤中最常見的類型，發(fā)病率占NHL的45.8%[1-2]。DLBCL在病理及臨床方面呈高度侵襲性和異質性，其組織學形態(tài)、免疫表型、分子遺傳學特征、臨床表現及轉歸在不同患者間存在明顯差異， 不同亞型對治療的反應及預后不同。隨著利妥昔單抗等靶向藥物的應用及治療方案的不斷優(yōu)化，DLBCL患者5年總體生存率（OS）提高至40%～65%[3]，但仍有大量患者面臨疾病復發(fā)、進展甚至死亡的風險。參照Hans等標準分類[4]，DLBCL可以分為生發(fā)中心B細胞樣（Germinal center B cell-like，GCB）和非生發(fā)中心B細胞樣（Non-geminal center B cell-like，non-GCB）型。研究表明，不論是使用CHOP/CHOP樣方案還是R-CHOP方案，non-GCB亞型都是DLBCL獨立的不良預后因素[5]。

DNA復制是細胞周期中的核心事件，它受到許多因子的調控，以便保證遺傳信息精確和完整地傳遞給子代細胞，細胞分裂周期蛋白6（Cell division cycle 6，CDC6）是細胞增殖和DNA復制所必需的蛋白質，在DNA復制許可階段起到限制性作用[6-8]。大量研究表明，CDC6具有原癌基因特性，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關[9-10]，許多腫瘤細胞高表達CDC6。為探討CDC6在DLBCL中的表達水平及其與臨床病理特征、預后的相關性，本研究回顧性分析本院60例接受R-CHOP方案或R-CHOP樣方案化療的DLBCL成人患者的臨床資料，檢測DLBCL組織中的CDC6 mRNA表達水平，分析其與淋巴瘤患者主要臨床特征及預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年1月～2018年12月期間我院病理科根據2008年淋巴造血組織WHO分類診斷標準[1]診斷的DLBCL病例，篩選出臨床病歷及隨訪資料相對完整的DLBCL患者60例，納入本次研究的所有患者均使用一線方案[R-CHOP/CHOP 21聯合或不聯合利妥昔單抗的CHOP方案（環(huán)磷酰胺、表阿霉素或多柔比星脂質體、長春地辛、地塞米松或潑尼松）]方案化療，部分老年患者使用減量R-CHOP或R-COP方案（不使用蒽環(huán)類化療藥）化療;治療效果欠理想者后期行二線方案化療[GDP（吉西他濱、順鉑、地塞米松）、ICE（異環(huán)磷酰胺、卡鉑、依托泊苷、表阿霉素）等];其中2例患者因不能耐受化療后期僅接受支持療法。以同期20例淋巴結反應性增生組織作為對照組。

1.2 方法

對全部患者進行一般臨床特征分析，包括性別、年齡、血清乳酸脫氫酶（Lactate dehyrogenase，LDH）、血紅蛋白（Haemoglobin，Hb）。所有標本在初診時由病理科切片，使用全自動免疫組化染色機Leica Bond Ⅲ對切片組織LCA、CD20、CD79a、CD3、CD5、CD10、BCL-6、MUM1、BCL-2、Ki-67、CyclinD1、TdT、CD56、UCHL1、CD23、CD21等指標進行免疫組化染色，以明確病理診斷。病理類型參照Hans等標準[4]分類，根據CD10、BCL-6和MUM1的表達情況，分為生發(fā)中心型（Germinal center B cell-like，GCB）和非生發(fā)中心型（Non-germinal center B cell-like，non-GCB）?；颊咝辛馨徒Y超聲、胸腹部CT、骨髓穿刺等常規(guī)檢查，部分患者行PET-CT檢查。參照Ann Arbor標準進行臨床分期，共分Ⅰ～Ⅳ期;根據中國彌漫大B細胞淋巴瘤診斷與治療指南（2013年版）[2]，IPI評分為0～5分。

1.2.1 Real-Time PCR檢測CDC6 mRNA表達? 收集DLBCL患者術后或者活檢的石蠟標本，取切片組織（5～20 μm）3～4片，采用RNeasy FFPE Kit（Qiagen）和SuperScriptTM Ⅲ First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR（Thermo Fisher）對上述細胞分別進行總RNA提取以及第一鏈cDNA合成，具體步驟參照試劑盒說明書。采用Primer Premier 6.0軟件進行定量PCR目的基因及內參引物設計，并由生工生物工程（上海）股份有限公司負責合成，其序列見表1。采用Power SYBRR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）進行qPCR，反應體系：Power SYBRR Green Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，補充SDW至20 μL。反應條件為 95℃預變性1 min、95℃變性15 s、63℃退火延伸25 s，進行40個循環(huán)。每個樣品重復3次，CDC6 mRNA相對表達量采用2-△△Ct的方法計算獲得。

1.2.2 隨訪? 通過電話咨詢、住院病歷查詢獲得隨訪資料，隨訪時間為10～89個月，計算患者的總體生存期（Overall survival，OS）。OS指患者從診斷到任何原因死亡或最后一次隨訪的時間，隨訪日期截止至2019年9月1日，60例患者中死亡22例。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行分析，CDC6 mRNA表達水平采用均數±標準差（x±s）進行統(tǒng)計描述;應用獨立樣本t檢驗分析CDC6mRNA表達與DLBCL臨床病理特征的關系;應用ROC曲線找出DLBCL中CDC6 mRNA相對表達量（2-△△Ct）高、低的截點值（cutoff值）。采用Kaplan-Meier法進行生存曲線分析，依據Log-rank檢驗進行生存曲線的單因素比較;多因素分析采用Cox比例風險模型，找出影響DLBCL生存的獨立預后因素，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者臨床特征

納入本次研究的60例DLBCL患者中，男35例，女25例，男女比例1.4：1;年齡19～86歲，中位年齡63歲;血清乳酸脫氫酶水平正常（≤245 U/L）33例，升高（>245 U/L）27例;血紅蛋白水平≥100 g/L 47例，<100 g/L 13例;根據Ann Arbor臨床分期，Ⅰ+Ⅱ期32例，Ⅲ+Ⅳ期28例;淋巴瘤國際預后指數（IPI）評分0～2分45例，3～5分15例;依據Hans分型，GCB亞型22例，non-GCB亞型38例。

2.2 CDC6 mRNA 在 DLBCL和淋巴結反應性增生組織中的表達

CDC6 mRNA在DLBCL中的表達量（0.441±0.070）較淋巴結反應性增生組織（0.113±0.029）顯著增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3 CDC6 mRNA表達量與DLBCL臨床病理特征的相關性

non-GCB患者CDC6 mRNA的表達量顯著高于GCB型，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而CDC6 mRNA表達量與患者的年齡、性別、血清LDH水平、血紅蛋白水平、疾病分期、IPI評分及病變部位均無明顯的相關性。見表2。

2.3 預后影響因素分析

根據ROC曲線分析，DLBCL患者中CDC6 mRNA表達量的cutoff值為0.300，CDC6 mRNA表達量<0.300定義為低表達，≥0.300定義為高表達（封三圖1）。單因素生存分析結果顯示：低表達CDC6 mRNA的DLBCL患者平均生存期為（69.272±6.042）個月，明顯長于高表達者（30.780±6.756）個月，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=11.687，P=0.001）（封三圖2），同時，DLBCL患者的臨床分期Ⅲ+Ⅳ期、IPI評分3～5分、LDH升高（>245 U/L）、貧血（Hb<100 g/L）、Hans分型non-GCB亞型均與DLBCL患者不良預后有關（P值分別為0.005、0.048、0.003、0.001、0.001），見表3。多因素分析結果顯示：高表達CDC6 mRNA（P=0.006）、血紅蛋白<100 g/L（P=0.001）、non-GCB（P=0.022）均為DLBCL獨立的不良預后因素，見表4。

3 討論

細胞分裂周期蛋白6（Cell-division cycle 6，CDC6）屬于ATP酶家族-AAA+ 成員，通過與細胞分裂周期蛋白10依賴性轉錄因子1（Cell division cycle 10 dependent transcript 1，CDT1）相互作用水解ATP，進而促進DNA解旋酶-六聚微小染色體維持蛋白復合體裝配在DNA上，與起始識別復合體（Origin recognition complex，ORC）共同形成復制前復合體（Pre-replicative complexes，Pre-RC）[6]，控制細胞從G1期進入S期，保證一個細胞周期內DNA復制不會被反復多次啟動[11-12]。近年來，大量研究發(fā)現CDC6具有原癌基因的特性，CDC6高表達在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，許多腫瘤細胞高表達CDC6，包括肺癌、乳腺癌、膠質母細胞瘤、宮頸癌、白血病和套細胞淋巴瘤等[13-17]。但CDC6在DLBCL中的表達及其潛在的調控機制仍有待闡明。本研究結果表明，CDC6 mRNA在彌漫大B細胞淋巴瘤中表達明顯高于淋巴結反應性增生組織，同時其高表達與non-GCB亞型有關，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但是具體機制還有待細胞生物學和DLBCL動物模型等實驗研究來進一步驗證。

單因素生存分析顯示，高表達CDC6、臨床分期Ⅲ+Ⅳ期、IPI評分3～5分、LDH升高、貧血及Hans分型non-GCB亞型均與DLBCL患者不良預后有關;多因素Cox回歸分析，高表達CDC6、貧血及non-GCB 亞型可能是DLBCL患者預后不良的獨立危險因素。提示CDC6高表達可能是判斷DLBCL患者預后的獨立危險因素，但是，也不排除我們的數據分析可能會受到回顧性分析、患者數量較少和隨訪時間較短等因素影響。因此，有必要擴大病例數、隨訪更長的時間，甚至設計前瞻性研究來進一步檢驗這些結果。

Pinyol M等[17]研究表明，在套細胞淋巴瘤CDC6和其他DNA復制許可基因如CDT1之間的不平衡在疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，其機制與p53通路抑制有關。Xiong XD等[18]報道CDC6基因G1321A位點的多態(tài)性是NHL特別是DLBCL的不良的預后因素（P=0.012），G1321多態(tài)性能改變CDC6 mRNA的次級結構。大量研究表明，通過沉默CDC6基因能阻止細胞增殖和促進凋亡[8]。Feng D等[19]首先驗證無論癌細胞中P53是否突變，通過小干擾RNA（siRNA）下調CDC6的表達可誘導腫瘤細胞凋亡，抑制細胞生長，但不影響正常細胞。在BCR/ABL陽性的慢性粒細胞白血病細胞株K562中，利用同樣的方法靶向CDC6，獲得了類似的效果[16]。Karanika S等[20]也報道了CDC6可提高Chk1/2抑制劑對前列腺癌細胞的治療作用。本研究表明，CDC6高表達在DLBCL患者non-GCB亞型中確實存在，且其平均生存期較短，大膽設想抑制CDC6的表達對DLBCL患者可能具有潛在的治療益處，CDC6有可能成為一種有前景的治療惡性淋巴瘤的突破點。

綜上所述，本研究結果表明在DLBCL樣本中CDC6表達上調，尤其在DLBCL non-GCB亞型表現更突出，CDC6高表達與DLBCL患者不良預后相關，CDC6可能對DLBCL具有潛在的診斷及治療價值，可作為DLBCL患者不良預后的獨立危險因素。而CDC6在DLBCL中的作用機制和作用的分子靶點、過表達CDC6的致癌潛力以及靶向CDC6治療淋巴瘤的作用等問題尚需進一步深入研究。

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（收稿日期：2019-11-08）