張 晨， 宋國(guó)瑞， 劉子歌， 陳德勝

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科，銀川 750004）

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨破壞及骨質(zhì)增生為主的伴有關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形及活動(dòng)障礙的慢性關(guān)節(jié)疾病[1]。據(jù)估計(jì)，2020 年骨性關(guān)節(jié)炎在全世界范圍內(nèi)將成為第四大致殘疾病[2]。KOA 的病因和發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，隨著研究的深入，以信號(hào)通路為靶點(diǎn)進(jìn)行研究KOA 的發(fā)病機(jī)制成為熱點(diǎn)。Notch 信號(hào)通路通過(guò)與靶基因Notch 1、Hes 1的結(jié)合，可以參與多種物質(zhì)從細(xì)胞膜向細(xì)胞核的傳遞，介導(dǎo)如細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及程序性死亡等過(guò)程[3]。本研究通過(guò)對(duì)比KOA 軟骨及正常軟骨組織中Notch1、Hes1 相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討其在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的作用及其意義，擬為KOA的診斷、治療及其預(yù)后提供新的臨床思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料

標(biāo)本收集自2018 年3 月1 日—2019 年2 月28 日寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院骨科，由同組手術(shù)醫(yī)療組骨科醫(yī)師主刀，32 例骨性關(guān)節(jié)炎標(biāo)本均經(jīng)術(shù)前體征、病史、X 線影像確診，作為病例組。其中女性20 例，男性12 例，年齡（53.32±9.22）歲；HE 染色結(jié)果通過(guò)采用改良的Mankin 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]對(duì)關(guān)節(jié)軟骨行病理分期：KOA 中期軟骨組9 例；KOA 晚期軟骨組23 例。全部病例術(shù)前均未接受骨性關(guān)節(jié)炎針對(duì)性治療。對(duì)照組為16 例膝關(guān)節(jié)內(nèi)骨折切開內(nèi)固定術(shù)中去除的部分軟骨組織，其中女性6 例，男性10 例，年齡（45.32±11.22）歲，無(wú)骨性關(guān)節(jié)炎病史。術(shù)前均經(jīng)患者或家屬知情，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器

蘇木素、番紅O、多聚甲醛；兔抗人Notch1 單克隆抗體、兔抗人Hes1 單克隆抗體（購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司），山羊抗兔IgG（購(gòu)自北京中山金橋有限公司）；DAB 顯色試劑盒、PBS 緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液（購(gòu)自博士德生物工程有限公司）；Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件（購(gòu)自美國(guó)Media Cybernetics 公司）；H6023i 顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)（購(gòu)自德國(guó)Leica 公司），CFX Connect 定量PCR 儀（購(gòu)自美國(guó)BIO-RAI 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織處理 所有標(biāo)本均截成0.5 cm ×0.3 cm×0.3 cm 的骨片，取材后經(jīng)4%多聚甲醛固定、0.2 mol·L-1磷酸緩沖液中充分漂洗后置于EDTA 脫鈣液中脫鈣，每周更替一次脫鈣液，待針刺組織而無(wú)明顯阻力感時(shí)取出，沖洗24 h，將組織沿矢狀面切為4 mm 組織塊，脫水、包埋、切片。

1.3.2 番紅染色 組織切片于70 ℃烤箱中過(guò)夜，后分別經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟20 min 2 次，梯度乙醇脫水后，鐵蘇木精染色5 min，蒸餾水沖洗，1%鹽酸乙醇分化30 s，蒸餾水沖洗2 min，固綠染色5min，蒸餾水漂洗30 s，番紅染色5 min，蒸餾水漂洗1 min，乙酸漂洗1 min，蒸餾漂洗1 min，風(fēng)干，二甲苯透明60 s，中性樹脂封固，顯微鏡下觀察。

1.3.3 HE 染色 將切片置于37 ℃恒溫箱中過(guò)夜，后分別經(jīng)過(guò)二甲苯玉、二甲苯Ⅱ各20 min，70%、80%、90%、95%乙醇各5 min，超純水5 min脫蠟入水。隨后在蘇木素中染色2.5 min，超純水沖洗干凈，然后在1%鹽酸乙醇中分化3 s 后自來(lái)水沖洗干凈，ddH2O 中反藍(lán)20 min，伊紅染色3～5 s，風(fēng)干后用中性樹脂封固，顯微鏡下觀察。

1.3.4 免疫組化 組織切片于70 ℃烤箱中過(guò)夜，二甲苯脫蠟20 min，脫蠟兩次，梯度乙醇脫水后蒸餾水、PBS 漂洗各3 min。組織片于檸檬酸鈉緩沖液中微波爐煮沸13 min，自然冷卻后體積分?jǐn)?shù)3%H2O2去離子水浸泡10 min，PBS 沖洗3次，分別滴加Notch 1 一抗、Hes 1 一抗，4℃冰箱孵育，8 h 后取出，PBS 沖洗3 次，滴加山羊抗兔IgG 聚合物孵育15 min，PBS 沖洗3 次，DAB 顯色液顯色15 s，PBS 沖洗3 次，蘇木精復(fù)染5 min，蒸餾水沖洗2 次，1%鹽酸乙醇分化若干秒，蒸餾水沖洗2 min 梯度乙醇復(fù)水，二甲苯透明后用中性樹脂封固，顯微鏡下觀察。

1.3.5 切片結(jié)果判定 所有切片采用雙盲法由兩位實(shí)驗(yàn)員獨(dú)立閱片，進(jìn)行結(jié)果評(píng)定。HE 染色結(jié)果通過(guò)Mankin 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，0～3 分為正常軟骨，4～11 分為中期軟骨，12～14 分為晚期軟骨。免疫組化結(jié)果在40 倍光鏡下隨機(jī)選取每張切片的5 個(gè)視野，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件，測(cè)評(píng)正常組、中期軟骨組及晚期軟骨組軟骨細(xì)胞中Notch 1、Hes 1 的陽(yáng)性表達(dá)率，并進(jìn)行對(duì)比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組樣本均數(shù)間比較選用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KOA 軟骨組織番紅染色結(jié)果

對(duì)照組（16 例）：軟骨基質(zhì)番紅染色均勻、標(biāo)本表面較完整，光滑度較好，軟骨細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，胞膜完整，胞質(zhì)豐富，軟骨細(xì)胞數(shù)量多，潮線完整清晰（圖1A）；病例組（32 例）：軟骨表面不光滑，基質(zhì)番紅染色減退較重，軟骨細(xì)胞數(shù)量重度減少、成簇分布，潮線不完整（圖1B）。

2.2 KOA 軟骨組織HE 染色結(jié)果

對(duì)照組（16 例）：軟骨表面完整，軟骨細(xì)胞較多，排列較規(guī)整，潮線規(guī)整，偶見失染現(xiàn)象（圖2A）；病例組（32 例）：軟骨面不整，細(xì)胞凋亡較多，細(xì)胞排列紊亂，軟骨細(xì)胞減少，潮線中斷且部分消失，染色不均且有失染現(xiàn)象（圖2B）。按Mankin 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，從軟骨結(jié)構(gòu)、軟骨細(xì)胞數(shù)量、軟骨基質(zhì)染色以及潮線完整性進(jìn)行評(píng)分，根據(jù)評(píng)分結(jié)果將病例組分為中期軟骨組9 例、晚期軟骨組23 例（表1）。

表1 KOA 軟骨組織Mankin 評(píng)分（±s，分）

表1 KOA 軟骨組織Mankin 評(píng)分（±s，分）

組別 n Mankin 評(píng)分對(duì)照組 16 1.68±1.06中期軟骨組 9 8.47±3.39晚期軟骨組 23 13.11±0.88

2.3 免疫組化檢測(cè)KOA 軟骨組織Notch1、Hes1表達(dá)結(jié)果

Notch1 蛋白著色區(qū)域在正常細(xì)胞內(nèi)廣泛分布于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)少量表達(dá)（圖3A）；在病例組軟骨中，可見胞質(zhì)內(nèi)有游離Notch1 蛋白（圖3B）。Hes1 蛋白著色區(qū)域主要集中在細(xì)胞質(zhì)中，呈黃色或棕色顆粒（圖4A）。Hes1 主要作用于細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原纖維，在軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中也存在游離的Hes1 蛋白，在病例組軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中可看到顏色變化（圖4B）。

Notch1 和Hes1 在對(duì)照組與病例組軟骨細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)率見表2、表3。中期軟骨組與晚期軟骨組、對(duì)照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001）；兩兩比較發(fā)現(xiàn)中期、晚期軟骨組Notch1、Hes 1 陽(yáng)性表達(dá)率均高于對(duì)照組（P均＜0.05），晚期組陽(yáng)性表達(dá)率高于中期組（P均＜0.05）。

表2 免疫組化檢測(cè)KOA 中期、晚期病例軟骨Notch1 陽(yáng)性細(xì)胞率比較（±s）

表2 免疫組化檢測(cè)KOA 中期、晚期病例軟骨Notch1 陽(yáng)性細(xì)胞率比較（±s）

與對(duì)照組比較*P＜0.05，與中期軟骨組比較#P＜0.05

組別 n Notch1 陽(yáng)性細(xì)胞率/% F 值 P 值對(duì)照組 16 21.16±7.86中期軟骨組 9 33.62±5.87* 39.660 ＜0.001晚期軟骨組 23 47.12±4.33*#

表3 免疫組化檢測(cè)KOA 中期、晚期病例軟骨Hes1 陽(yáng)性細(xì)胞率比較（±s）

表3 免疫組化檢測(cè)KOA 中期、晚期病例軟骨Hes1 陽(yáng)性細(xì)胞率比較（±s）

與對(duì)照組比較*P＜0.05，與中期軟骨組比較#P＜0.05

組別 n Hes1 陽(yáng)性細(xì)胞率/% F 值 P 值對(duì)照組 16 11.56±5.92中期軟骨組 9 27.42±6.27* 18.632 ＜0.001晚期軟骨組 23 33.47±4.63*#

3 討論

Sassi 等[5]提出了Notch 信號(hào)通路在KOA 中的作用，針對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨組織的研究也越來(lái)越多。Notch 信號(hào)通路是在Notch 配體與受體結(jié)合后開始激活的，即生成胞內(nèi)區(qū)（Notch intracellular domain，NICD）與細(xì)胞核中DNA 結(jié)合蛋白結(jié)合后激活下游靶基因如Notch1、Hes1 相關(guān)蛋白[6]。據(jù)研究統(tǒng)計(jì)[7]，Notch1 蛋白的活化出現(xiàn)在56%～63%的骨性關(guān)節(jié)炎中，是常見的導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎的信號(hào)通路效應(yīng)蛋白。本研究證實(shí)，Notch1 在病例組軟骨組織中有陽(yáng)性表達(dá)，且高于對(duì)照組。由于被異常激活后的Notch1 蛋白可以刺激巨噬細(xì)胞、炎性因子持續(xù)存在，導(dǎo)致骨代謝平衡能力下降，增加骨贅的形成，所以在關(guān)節(jié)畸形中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。

Hes1 蛋白是Notch 途徑的重要組成部分，是一種強(qiáng)堿性螺旋環(huán)螺旋轉(zhuǎn)錄抑制因子（bHLH），Hes1 蛋白的激活可以降解軟骨基質(zhì)的蛋白聚糖酶5（ADAMTS5）的血小板凝血酶敏感蛋白樣序列1 區(qū)（TSP-1）及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP13）[9]。蛋白聚糖酶5 含有一個(gè)結(jié)合Hes1 的典型序列，其中包含IL-6、IL-1、IL-33 受體編碼的靶基因。而IL-1 及IL-6 是誘發(fā)關(guān)節(jié)炎癥和軟骨退化的炎癥細(xì)胞關(guān)鍵因子[10]。在本實(shí)驗(yàn)中，Hes1 蛋白在對(duì)照組及病例組軟骨組織中均存在陽(yáng)性表達(dá)，且晚期軟骨組織中的陽(yáng)性表達(dá)率要高于中期軟骨組織，說(shuō)明Hes1 蛋白參與了膝關(guān)節(jié)軟骨磨損、退變的過(guò)程。研究表明[11]，在KOA 中，Hes1 通過(guò)抑制間充質(zhì)前體細(xì)胞 （mesenchymal progen itor cells，MPCs）向軟骨細(xì)胞分化，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化成熟，增強(qiáng)其骨吸收活性并阻止其凋亡，骨再生能力受損，軟骨組織出現(xiàn)不可逆性退化，甚至凋亡，出現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎。

所以，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)Notch1 和Hes1 相關(guān)蛋白的形態(tài)學(xué)及免疫學(xué)檢測(cè)，證實(shí)了其在KOA 組織中存在，且Notch1 和Hes1 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率隨著關(guān)節(jié)軟骨磨損程度的加重而升高，證實(shí)其參與甚至主導(dǎo)了骨性關(guān)節(jié)炎中異常細(xì)胞激活和分化過(guò)程，導(dǎo)致骨代謝失衡、骨質(zhì)破壞，正常軟骨細(xì)胞炎性改變，形成KOA。在異?；罨腘otch-1及Hes1 相關(guān)蛋白持續(xù)作用下，病變的骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞無(wú)法自行修復(fù)，在后期軟骨病變及骨贅的形成過(guò)程中起到關(guān)鍵作用[12]。綜上所述，Notch1和Hes1 相關(guān)蛋白參與了KOA 的發(fā)生發(fā)展，可作為診斷膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的參考指標(biāo)之一。