王斌霞， 劉秀英， 李小霞， 劉婉露， 趙 燚， 張毓洪

（寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，銀川 750004）

腦卒中已成為我國首位死因，其發(fā)病率、死亡率、致殘率高，并發(fā)癥多，且發(fā)病趨于年輕化[1-2]。缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）作為卒中的主要類型，約占總卒中的87%[3]，我國IS 的患病率和發(fā)病率分別占總卒中69.6%和77.8%[4]。因此，應(yīng)對(duì)其高度重視并及早預(yù)防。近年來，國內(nèi)外諸多學(xué)者已對(duì)腦卒中進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)存在能量、糖類、脂類和氨基酸代謝異常[5-7]。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，人體內(nèi)氨基酸在正常生理狀態(tài)下處于動(dòng)態(tài)平衡，病理狀態(tài)時(shí)出現(xiàn)失衡[8]。多項(xiàng)研究均表明腦卒中患者體內(nèi)存在氨基酸代謝紊亂[9-12]。既往研究資料主要來源于醫(yī)院的住院患者和健康體檢者的血液，而缺乏自然人群中IS 患者24 h 尿液氨基酸的研究。尿液作為代謝的終產(chǎn)物，可反映機(jī)體的代謝情況，較血漿更易獲取，且24 h 尿液代謝物濃度不受采樣時(shí)間和日變化的影響，是一種理想的檢測樣本[13-15]。因此，本研究從氨基酸代謝角度出發(fā)，分析IS 和24 h 尿液氨基酸的關(guān)系，探討與IS 發(fā)生相關(guān)的代謝物，以期為其發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究選擇寧夏青銅峽市和平羅縣作為調(diào)查現(xiàn)場，IS 患者來源于低鈉鹽與腦卒中的關(guān)系研究項(xiàng)目[16]。該項(xiàng)目從青銅峽市及平羅縣兩個(gè)地區(qū)的80～120 個(gè)行政村中，隨機(jī)選擇60 個(gè)村，共計(jì)120 個(gè)村，每個(gè)村按照診斷、納入和排除標(biāo)準(zhǔn)選擇35～40 名研究對(duì)象。分別于2016 年2 月、2017年2 月進(jìn)行隨訪，每個(gè)地區(qū)隨機(jī)抽取16 個(gè)村，共計(jì)32 個(gè)村，每村中隨機(jī)選擇20 名研究對(duì)象。根據(jù)年齡、性別成組匹配的原則在病例組所在村納入相應(yīng)的對(duì)照。對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行24 h 尿液收集。本次研究收集IS 患者286 例，排除有心腦血管疾病及糖尿病等慢性病者、重復(fù)測量及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)缺失者130 例，共156 例進(jìn)入研究；對(duì)照組301例，經(jīng)排除后，共280 例進(jìn)入研究。該研究通過了寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號(hào)：2013-175），所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 診斷、納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) IS 患者均符合第四屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的“各類腦血管病的診斷要點(diǎn)”中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[17]。

1.2.2 納入標(biāo)準(zhǔn) IS 組：既往有缺血性腦卒中史（具有縣級(jí)及以上醫(yī)院出具的診斷證明），且年齡在35 歲及以上者；對(duì)照組：既往無高血壓、腦卒中病史，現(xiàn)場兩次血壓值測量收縮壓≤140 mmHg和（或）舒張壓≤90 mmHg，且年齡、性別及居住地與IS 患者成組匹配者。

1.2.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 既往短暫性腦缺血發(fā)作及其他腦部疾病患者；有心臟病、糖尿病病史者；喪失基本行動(dòng)能力者；嚴(yán)重感染、自身免疫性疾病、急慢性腎臟疾病及腫瘤患者；酒精或藥物濫用史者；24 h 尿液收集不符者（尿液遺漏量超過總尿量的10%者；晨尿遺漏者；尿液被血、大便或分泌物等其他雜質(zhì)污染者；留尿期間出現(xiàn)大汗、惡心、嘔吐、腹瀉等情況者；急慢性尿道感染者）及實(shí)驗(yàn)檢測數(shù)據(jù)缺失者。

1.2.4 吸煙判定標(biāo)準(zhǔn) 吸煙史[18]：平均每天至少吸1 支煙，并且連續(xù)吸煙＞1 年；現(xiàn)在吸煙：有吸煙史，并且在過去30 d，平均每天吸煙≥1 支者。

1.3 方法

調(diào)查工作由經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的具有醫(yī)學(xué)背景的人員進(jìn)行，收集研究對(duì)象的一般人口學(xué)特征、健康相關(guān)行為、慢病史等，并對(duì)其進(jìn)行體格檢查、血壓測量以及24 h 尿液收集。尿液標(biāo)本在低溫條件下運(yùn)輸至寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心于-80 ℃貯存待用。采用日立L-8900全自動(dòng)氨基酸萃取分析儀進(jìn)行24 h 尿液中氨基酸水平的測定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料滿足正態(tài)分布者采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不滿足正態(tài)分布則以中位數(shù)和四分位數(shù)間距［M（P25，P75）］表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman 相關(guān)對(duì)氨基酸代謝物及身體測量指標(biāo)間的相關(guān)性進(jìn)行分析，以熱圖表示；采用多因素調(diào)整Logistic 回歸分析與IS 發(fā)生相關(guān)的氨基酸代謝物。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 研究人群基本特征

納入的436 例研究對(duì)象中，男性238 例，女性198 例，平均年齡（62.6±7.6）歲，平均體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（23.8±3.5）kg·m-2。IS 組與對(duì)照組人群性別、現(xiàn)在吸煙比例、學(xué)歷及年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；IS 組患者吸煙史的比例、體質(zhì)量、收縮壓及舒張壓均高于對(duì)照組，身高低于對(duì)照組（P均＜0.05），見表1。

2.2 24 h 尿液中氨基酸水平

通過測定，對(duì)照組及IS 組人群24 h 尿液中均測出以下14 種氨基酸：絲氨酸（Serine，Ser）、谷氨酸（Glutamic acid，Glu）、甘氨酸（Glycine，Gly）、丙氨酸（Alanine，Ala）、半胱氨酸（Cysteine，Cys）、纈氨酸（Valine，Val）、甲硫氨酸（Methionine，Met）、異亮氨酸（Isoleucine，Ile）、亮氨酸（Leucine，Leu）、酪氨酸（Tyrosine，Tyr）、苯丙氨酸（Phenylalanine，Phe）、組氨酸（Histidine，His）、色氨酸（Tryptophan，Trp）、精氨酸（Arginine，Arg）。而天冬氨酸（Aspartic acid，Asp）、蘇氨酸（Threonine，Thr，）及脯氨酸（Proline，Pro）僅在少數(shù)研究對(duì)象尿液中測出，所以不予以分析。

由表2 可見，IS 組患者Cys、Val、Ile、Leu、支鏈氨基酸（BCAAs）及支鏈氨基酸/芳香族氨基酸（BCAAs/AAAs）水平均高于對(duì)照組（P均＜0.05），其他氨基酸在兩組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

表1 研究對(duì)象基本特征

表2 對(duì)照組與IS 組人群24 h 尿液中氨基酸水平比較（mg·L-1）

2.3 各氨基酸代謝物與身體測量指標(biāo)的關(guān)系

如圖1 所示，除BCAAs/AAAs 與各氨基酸間存在負(fù)相關(guān)外，其他各氨基酸指標(biāo)之間均存在正相關(guān)，其中Ser、Ala、Cys、Val、Leu、Tyr、Trp、BCAAs、AAAs 之間相關(guān)系數(shù)達(dá)0.8 以上；同時(shí)，各氨基酸與SBP、DBP、BMI 也存在弱相關(guān)。

2.4 IS 發(fā)生的Logistic 回歸分析

將14 種氨基酸代謝物及組合指標(biāo)進(jìn)行二分類條件Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示未調(diào)整任何變量時(shí)（Model 1），Ser、Cys、Tyr、Arg 進(jìn)入模型；在調(diào)整年齡、性別、吸煙史、現(xiàn)在吸煙及學(xué)歷后（Model 2），Ser、Cys、Arg 進(jìn)入模型；進(jìn)一步調(diào)整身高、體質(zhì)量（Model 3），結(jié)果未變，見表3。

將研究人群按這些氨基酸的四分位水平進(jìn)行分組，調(diào)整年齡、性別、吸煙史、現(xiàn)在吸煙、學(xué)歷、身高及體質(zhì)量后，Logistic 回歸分析結(jié)果顯示Ser、Cys 最高四分位數(shù)患者IS 的危險(xiǎn)分別是最低四分位數(shù)的0.086 倍、10.556 倍，見圖2。

3 討論

表3 氨基酸代謝物的Logistic 回歸分析

氨基酸作為蛋白質(zhì)合成的基質(zhì)，其代謝平衡對(duì)維持機(jī)體健康至關(guān)重要[8]。研究表明，BCAAs在大腦中發(fā)揮著獨(dú)特的調(diào)節(jié)作用，它們是星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元Glu/谷氨酰胺循環(huán)的組成部分，在興奮神經(jīng)元信號(hào)中對(duì)Glu 的有效攝取起重要作用[19]。本研究結(jié)果顯示，IS 患者24 h 尿液中BCAAs 較對(duì)照組升高。Kimberly 等[9]觀察發(fā)現(xiàn)，急性腦卒中大鼠血漿、腦脊液及患者血漿中BCAAs水平下降，并且其下降程度與不良神經(jīng)結(jié)局有關(guān)。Jung 等[20]發(fā)現(xiàn)腦梗死患者血漿中Val、Glu 水平降低，Ile、Leu 水平未變，尿液中Gly 水平降低；腦卒中或卒中后認(rèn)知功能損害人群血漿中Tyr 升高，Val、Ile、Trp 水平降低[21]。以上結(jié)果均與本研究不一致。因此，關(guān)于BCAAs 在IS 患者尿液中的代謝需要更進(jìn)一步探索。

熱圖相關(guān)性分析證實(shí)，多種氨基酸間存在密切聯(lián)系，與既往研究結(jié)果一致[9]。此外，本研究顯示氨基酸代謝物與血壓之間也存在相關(guān)性。有文獻(xiàn)報(bào)道[22]，青少年攝入BCAAs 對(duì)SBP、DBP 無影響。600 名農(nóng)村體檢居民的血清Val、Ile、BCAAs與SBP、DBP 均呈正相關(guān)[23]。朱曉偉等[24]認(rèn)為高血壓患者尿液中氨基酸與血壓呈負(fù)相關(guān)。由此可見，氨基酸代謝物與血壓之間存在一定的聯(lián)系。

氨基酸具有多種生理功能，它們的變化可能反映了腦卒中的一些病理生理學(xué)途徑。一些氨基酸，如BCAAs、Ser 可作為信號(hào)分子，調(diào)節(jié)各種必需的細(xì)胞過程，如維持生長和修復(fù)大腦功能損傷[25]。賴氨酸（Lysine，Lys）和Arg 是兩種基本氨基酸，給實(shí)驗(yàn)大鼠口服Lys 和Arg，發(fā)現(xiàn)抑制Glu 引起的神經(jīng)元活動(dòng)可能與Lys 和Arg 的神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)[26]。此外，Arg 是NO 的前體和有效的血管擴(kuò)張器，可降低腦梗死面積[27]。Cys 可通過減少氧化應(yīng)激、改善胰島素抵抗和葡萄糖代謝、降低高級(jí)糖化終產(chǎn)物、調(diào)節(jié)NO 及其他血管活性分子水平，直接或通過其儲(chǔ)存形式谷胱甘肽發(fā)揮降壓作用[28]，同時(shí)膳食研究表明Cys 的攝入與腦卒中的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)[29]。

綜上，本研究通過探索IS 患者24 h 尿液中氨基酸代謝變化，建立了由Ser、Cys 組成的新型尿液代謝物組，這可能有利于IS 發(fā)病機(jī)制的明確。本研究為橫斷面研究，未能明確判斷其時(shí)間先后順序；同時(shí)關(guān)于此代謝物組能否作為新型代謝物的普適性，需在大樣本人群中使用時(shí)間序列動(dòng)態(tài)監(jiān)測去驗(yàn)證，從而為早期的診斷或治療提供基礎(chǔ)。