郭明娟， 光翠娥*，， 干建平， 范志文

（1. 食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214000；2. 黃岡師范學院 經(jīng)濟林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室& 大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃岡438000）

金黃色葡萄球菌是葡萄球菌屬的一種重要病原菌，不僅能引起皮膚感染，還易導致細菌性食物中毒，有“嗜肉菌”之稱。 由葡萄球菌引起的食物中毒是由于攝入了含有耐熱葡萄球菌腸毒素的食物。在受污染的食品中， 當金黃色葡萄球菌濃度達到106.5CFU/g 時， 這種腸毒素劑量就能達到使人中毒的水平[1]。 如果食物生產(chǎn)和儲存期間的環(huán)境條件對金黃色葡萄球菌的生長有利，就會產(chǎn)生葡萄球菌腸毒素[2]，對消費者產(chǎn)生危害。 每年因金黃色葡萄球菌引起的中毒事件在世界各地時有發(fā)生，中國也不例外。

植物蛋白飲料營養(yǎng)豐富，但也是微生物的大本營，生產(chǎn)若有忽視，則會導致嚴重質(zhì)量問題，短期內(nèi)出現(xiàn)腐敗變酸、分層沉底或脹瓶等后果[3]。 椰汁作為一種植物蛋白飲料，汁味清甜，香濃沁爽，富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素C 及鈣、磷、鐵、鉀、鎂、鈉等礦物質(zhì)，是營養(yǎng)極為豐富的飲料[4]。 因此椰汁作為天然的培養(yǎng)基，極易受到微生物污染，適于金黃色葡萄球菌的生長。 2006 年7 月，在法國的法蘭西島爆發(fā)了關于椰汁的中毒事件，Hennekinne[5]等人從導致人們中毒的椰汁中分離出了金黃色葡萄球菌。 目前國內(nèi)外關于金黃色葡萄球菌在食品中的研究涉及肉類[6-8]、乳制品[9-10]、米面制品[11-13]等，但關于金黃色葡萄球菌在椰汁中的研究還沒有。

食品中的預測性微生物學是食品微生物學領域的一個研究領域，旨在提供數(shù)學模型來預測食品環(huán)境中的微生物行為[14]。它主要結(jié)合微生物學、工程數(shù)學及統(tǒng)計學，通過前期收集大量數(shù)據(jù)，建立一級和二級模型，結(jié)合計算機建立仿真軟件，利用軟件輸入初始條件得出微生物的生長情況，對產(chǎn)品安全進行評估[15]。 預測微生物學的應用主要包括食品的貨架期預測、風險評估等。Gompertz、Logistic、Baranyi和Richards 模型[16]等是預測微生物學中常見的一級模型， 常見的二級模型有平方根、Arrhenius 和多項式模型等。 Anderson[17]等人收集了不同溫度下（7~30 ℃）沙門氏菌和單增李斯特菌在生菜中的生長參數(shù)，構(gòu)建了溫度與生長參數(shù)最大比生長速率和延滯期的函數(shù)關系。 牛會敏[18]等人檢測了低溫條件下假單胞菌在冷卻豬肉中的生長，發(fā)現(xiàn)冷卻豬肉中假單胞菌的最適生長模型在不同溫度下各不相同，0 ℃時是Baranyi 模型，5 ℃時是修正的Gompertz 模型，10 ℃時是Huang 模型。

本研究的目的是找到一級和二級模型描述椰汁中金黃色葡萄球菌的生長。 以椰汁為原材料，測定不同溫度下（20、25、30、36 ℃）椰汁中金黃色葡萄球菌的生長數(shù)據(jù)， 應用MGompertz 模型、 MLogistic模型和Baranyi 模型擬合出一級生長預測模型， 根據(jù)擬合度選取適宜的一級模型，得到最大比生長速率（μmax）和延滯期（tlag）。采用平方根和二次多項式模型建立溫度與μmax、溫度與tlag關系的二級生長模型，選擇最優(yōu)模型， 并對所得結(jié)果進行可靠性驗證， 為指導椰汁生產(chǎn)和消費、 控制椰汁腐敗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與材料

金黃色葡萄球菌（CMCC26003）：北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司；椰汁：椰樹集團；Baird-Parker 平板、亞碲酸鉀卵黃菌增液：上海谷研實業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設備

CHP-80 培養(yǎng)箱： 上海市三發(fā)科學儀器有限公司；DSX-280B 手提式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；GZX-9070 MBE 電熱鼓風干燥箱： 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；DK-8D 電熱恒溫水槽：上海精宏實驗設備有限公司；SF-CJ-1A 凈化工作臺：上海三發(fā)科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同溫度下生長曲線測定 為模擬金黃色葡萄球菌污染椰汁的情況，將適量的菌液接種到椰汁中。 挑取一環(huán)金黃色葡萄球菌菌落，浸入裝有10 mL 滅菌生理鹽水試管中振蕩， 制成濃度為107～108CFU/mL 的菌懸液。 對菌懸液稀釋一定倍數(shù)后，將菌懸液按1∶100 的比例接種到椰汁中， 分別置于20、25、30、36 ℃下培養(yǎng)。 其中30、36 ℃下2 h 取樣測量一次，25 ℃下3 h 取樣一次，20 ℃下6 h 取樣一次。每次吸取10 mL 樣品置于裝有90 mL 無菌生理鹽水的錐形瓶中振蕩，依次進行10 倍稀釋。 選取2 個稀釋度適宜的樣品， 每次吸取兩個100 μL 樣品加入Baird-Parker 平板中，用涂布棒涂布[19]。 倒置于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。每個樣品做兩次重復。1.3.2 金黃色葡萄球菌生長的一級模型 一級模型用于描述微生物數(shù)量變化與培養(yǎng)時間的關系，用Matlab 軟件分析不同溫度條件下金黃色葡萄球菌在椰汁中的生長數(shù)據(jù)，擬合S 型曲線，建立生長模型。比較3 種模型的擬合指標，選取最佳模型。研究選取預測微生物學最常用的3 種一級預測模型，即MGompertz 模型、MLogistic 模型和Baranyi 模型來擬合不同溫度下金黃色葡萄球菌在椰汁中的生長模型。

修正的Gompertz 模型[20]：式中，lg（Nt）為t時刻細菌的對數(shù)值；lg（N0）為初始細菌的對數(shù)值；lg（Nmax）為最大細菌數(shù)的對數(shù)值；tlag為延滯期；μmax為最大比生長速率。

1.3.3 金黃色葡萄球菌生長的二級模型 二級模型一般用于描述不同生長環(huán)境下環(huán)境因子對微生物生長的影響。 根據(jù)一級模型獲得相關的生長參數(shù)μmax和tlag，采用Matlab 軟件，利用平方根和二次多項式模型分別擬合溫度與μmax和tlag的關系，兩種模型的表達式如下。

平方根模型：

式中，b為模型參數(shù)；Tmin為最低生長溫度。二次多項式模型：

式中，T為實驗溫度；a、b、c為模型參數(shù)。

1.3.4 一級模型可靠性評價 應用Matlab 軟件對所得生長數(shù)據(jù)進行非線性擬合， 采用R2、RMSE、RSS、RSE 和AIC 整體分析3 種模型的擬合效果。R2用于對擬合效果進行總的評價，其值越接近于1，擬合效果越好；RMSE 可衡量預測準確度，說明模型預測值的離散程度；RSS 和RSE 值越小， 擬合效果越好；AIC 是衡量統(tǒng)計模型擬合優(yōu)良性的一種標準[23]，AIC 值最小的模型是最準確的。 其中：

式中，pred 為用模型擬合出的生長數(shù)據(jù)，即擬合值；obs 為實際所測得的數(shù)據(jù)值， 即實測值；n為樣本數(shù)量；m為模型中參數(shù)的個數(shù)。

1.3.5 二級模型的評估與驗證 采用偏差因子（Bf）和準確因子（Af）來評價二級模型的可靠性。

Af 可測量預測值和實測值之間的準確程度，Af＞1，越接近1，模型準確度越高。

Bf 可判斷預測值和實測值之間的偏差度，其值處于0.9～1.05 范圍內(nèi)較好。

2 結(jié)果與分析

2.1 一級模型的建立

2.1.1 殘差分布 4 個溫度下的方程擬合值與實測值的殘差見圖1。擬合度較好的模型，其殘差應呈隨機分布[24]。 由圖1 可知，4 個溫度下3 種模型的殘差分布未呈現(xiàn)任何規(guī)律，所以3 種模型均對實測值擬合程度較好， 沒有系統(tǒng)誤差。 但相較于MGompertz和MLogistic 模型，Baranyi 模型的殘差值大部分在±0.2 上下來回波動，分布更為集中。

圖1 不同溫度條件下的殘差分布Fig. 1 Plots of residual at different temperatures

2.1.2 曲線擬合 對20、25、30、36 ℃4 個溫度下的生長數(shù)據(jù)進行擬合， 結(jié)果見圖2。 由圖2 可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，金黃色葡萄球菌的濃度也隨之增加，且遵循S 型曲線，培養(yǎng)一定時間后都趨于穩(wěn)定。30、36 ℃下，金黃色葡萄球菌的濃度都達到8 lg（CFU/mL）以上，25 ℃的濃度接近8 lg（CFU/mL），20 ℃的濃度接近7 lg（CFU/mL）。

圖2 不同溫度條件下擬合曲線Fig. 2 Fitting curves at different temperatures

2.1.3 擬合度統(tǒng)計指標分析 擬合完成后對模型的準確度進行進一步的評估，得出3 種模型的相關擬合度指標，見表1。

表1 反應的是不同溫度下3 種模型擬合度指標的分析?？梢钥闯觯? 個溫度下的擬合效果都比較好，相關系數(shù)R2都在0.99 以上。 相較于MGompertz和MLogistic 模型，Baranyi 模型擬合出的相關系數(shù)R2最大，R2的平均值達到0.996 1； 均方根誤差RMSE 最小， 平均值為0.131 6；RSE 和AIC 的平均值最小，分別為0.145 5 和-36.685 8，擬合效果相對更好。 因而選擇Baranyi 模型作為擬合金黃色葡萄球菌在椰汁中生長的一級模型。

根據(jù)上述結(jié)論，以Baranyi 模型為基礎，得到不同溫度下椰汁中金黃色葡萄球菌的生長動力學參數(shù)，包括初始菌落數(shù)N0、最大菌落數(shù)Nmax、最大比生長速率μmax和延滯期tlag，見表2。20 ℃下金黃色葡萄球菌生長較慢，最大比生長速率較小，延滯期則較長。 隨著溫度的升高，最大比生長速率逐漸升高，延滯期則相應縮短。25、30、36 ℃時最大比生長速率分別為20 ℃時的2 倍、3 倍和3.5 倍；20 ℃時延滯期分別為25、 30、36 ℃時的2.5 倍、4 倍和5.7 倍。各溫度下一級預測模型方程為：20 ℃：

其中t是以h 為單位的時間。

2.2 二級模型的建立

根據(jù)Baranyi 模型擬合出的生長參數(shù)， 利用平方根和二次多項式模型，建立溫度與最大比生長速率及延滯期之間的二級模型。 表3-4 為兩種模型相關擬合指標的比較。

表1 3 種生長動力學模型擬合度的比較與評價Table 1 Comparison and assessment of three growth kinetic models

表2 金黃色葡萄球菌的生長動力學參數(shù)Table 2 Growth kinetics parameters of Staphylococcus aureus

表3 最大比生長速率的擬合度指標Table 3 Goodness of fit of μmax

表4 延滯期的擬合度指標Table 4 Goodness of fit of tlag

由表3-4 可知，對于兩個生長參數(shù)來說，二次多項式模型的相關系數(shù)R2更接近1，Af 大于1 且更接近1，Bf 也更接近于1，擬合度相對平方根模型來說更好，所以選擇二次多項式模型表達溫度與生長參數(shù)的關系。用Matlab 軟件擬合出的溫度與最大比生長速率及延滯期的擬合曲線見圖5-6。

圖5 最大比生長速率與溫度的二級模型擬合圖Fig. 5 Fitted μmax and temperature of the secondary model

圖6 延滯期與溫度的二級模型擬合圖Fig. 6 Fitted tlag and temperature of the secondary model

由圖5-6 可知，在20~36 ℃范圍內(nèi)，最大比生長速率隨溫度的升高而升高，延滯期隨溫度的升高而減小， 方程的相關系數(shù)R2分別為0.997 6 和0.978 5，擬合效果良好，說明二次多項式模型能夠較好地反映溫度與最大比生長速率及延滯期的關系。 因此選擇二次多項式模型可作為金黃色葡萄球菌生長的二級模型。

溫度與最大比生長速率模型擬合方程為μmax=-0.001 3T2+0.096T-1.255， 溫度與延滯期的擬合方程為tlag= 0.110 6T2-7.295T+123.6。

2.3 模型的驗證

根據(jù)擬合出的二級模型的方程，分別求出28 ℃和33 ℃下金黃色葡萄球菌在椰汁中的生長動力學參數(shù)μmax和tlag，將其帶入公式（3）得到金黃色葡萄球菌在28 ℃和33 ℃下的生長曲線。 圖7 為預測生長曲線與實測生長曲線的對比圖，可看出預測模型可以較好地預測金葡菌在椰汁中的生長曲線。

圖7 33、28 ℃下的實測值與預測值Fig.7 Growth curves observed and predicted at 33 and 28 ℃

3 結(jié) 語

在選取的3 種一級模型中，Baranyi 模型的相關系數(shù)R2平均值最高， 達到0.996 1；RMSE、RSE 和AIC 最小， 分別為0.131 6、0.145 5 和-36.685 8，因此Baranyi 可作為描述椰汁中金黃色葡萄球菌生長的一級模型。

環(huán)境因素對微生物的生長有著重要的影響，不同溫度下金黃色葡萄球菌在椰汁中生長的差異性較大。 在20~36 ℃下，最大比生長速率隨溫度升高先增大后減小，延滯期則相反。 用二次多項式模型描述金黃色葡萄球菌生長參數(shù)的相關系數(shù)R2分別為0.997 6、0.978 5， 偏 差 因 子Bf 分 別 為0.999、0.997，準確因子Af 分別為1.044、1.006。 準確度較高，說明二次多項式模型可較好地描述溫度與最大比生長速率及延滯期的關系。

根據(jù)擬合出的一級模型和二級模型，可以更好地掌控溫度對金黃色葡萄球菌在椰汁中生長的影響，為控制椰汁中腐敗微生物、引導安全消費提供理論依據(jù)。