張大偉，劉德華，黃欽欽，田亞平

(江南大學，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫， 214122)

氨肽酶(EC 3.4.11)是一種重要的外切蛋白酶，可以高效催化蛋白質N端的肽鍵，使N端氨基酸游離出來[1]。其中亮氨酸氨肽酶(leucine aminopeptidase)屬于氨肽酶家族中重要成員，它可以高效水解蛋白質N端多種疏水性氨基酸例如亮氨酸、精氨酸，賴氨酸等[2]，在改善蛋白水解液風味和提高蛋白水解度等食品加工方面有極大的應用價值[1]。目前，來源于Pseudomonas[3],Aspergillus[4],Bacilluslicheniformis[1],Streptomyces[5],Lacticacidbacteria[6],Bacillussubtilis[7]的氨肽酶基因均有報道，其中一些氨肽酶基因已經(jīng)在E.coli[8],B.subtilis[9]和Pichiapastoris[2]中異源表達。

B.subtilis屬于一般安全(generally recognized as safe，GRAS)微生物，為非致病菌[10]。因此B.subtilis常被用作食品加工用酶的宿主菌。目前α-淀粉酶[11]、β-淀粉酶[12]、堿性木聚糖酶[13]、果膠酶[14]、氨肽酶[9]等多種食品加工用酶都已在B.subtilis中高效表達，但是所構建的重組B.subtilis需要添加抗生素以維持質粒穩(wěn)定性，這為B.subtilis成為食品工業(yè)宿主菌帶來了巨大阻礙。為解決這一問題，XIA等[15]將目的基因整合到基因組上，阻止目的基因丟失，但這種方法會降低目的基因的拷貝數(shù)，減少蛋白產(chǎn)量。YANG等[16]采用EndoA和EndoB的毒性蛋白和解毒蛋白的方法來增加質粒分離穩(wěn)定性，但是構建方法復雜并且EndoA和EndoB蛋白表達不易控制。與上述方法相比，構建營養(yǎng)缺陷型互補菌株阻止質粒丟失是一種更為有效的方法[17]。

本研究通過Cre/lox系統(tǒng)[18]敲除B.subtilis168中的dal以及遺留的博來霉系抗性基因(BleR)，LAP基因插入質粒pMA5中，并用dal替換質粒中的卡那霉素抗性基因(KanR)，繼而將pMA5質粒中E.coli的Ori和氨芐霉素抗性基因(AmpR)刪除。經(jīng)過基因敲除的缺陷型菌只能在添加D-丙氨酸的培養(yǎng)基中生長，而在普通培養(yǎng)基中不能生長。質粒中含有的dal可以和缺陷菌形成互補，從而產(chǎn)生篩選壓力，阻止質粒丟失現(xiàn)象。為提高所構建缺陷型菌株的氨肽酶發(fā)酵產(chǎn)量，在前面研究基礎上進一步對該菌株進行發(fā)酵過程優(yōu)化，為工業(yè)化生產(chǎn)LAP奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

底物L-亮氨酸-4-硝基苯胺，Alfa Aesar公司；蛋白胨、酵母粉，OXID；博來霉素，北京索萊寶公司；基因組提取、質粒提取、膠回收、產(chǎn)物純化試劑盒，上海生工生物工程公司。核酸內(nèi)切酶、T4連接酶、磷酸化酶以及l(fā)igation solutionⅠ、DNA marker，大連Takara公司；高斯組裝試劑盒，南京諾唯贊公司；其他未注明試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

核酸電泳儀和PCR儀，Bio-rad 公司；凝膠成像儀，北京賽智公司；5 L發(fā)酵罐，上海迪必爾生物工程有限公司；UH5300雙光束紫外分光光度計、高速低溫離心機，日本日立HITACH集團。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種、質粒、以及培養(yǎng)條件

本研究所用的菌種和質粒，實驗室保藏及本研究構建。

種子液在LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L)中37 ℃，220 r/min培養(yǎng)。LB培養(yǎng)基中額外添加氨芐霉素(Amp)100 μg/mL，卡那霉素(Kan)100 μg/mL，博來霉素(Ble)30 μg/mL和200 μg/mL 的D-丙氨酸。工程菌在Super Rich培養(yǎng)基(蛋白胨25 g/L，酵母提取物20 g/L，K2HPO4·3H2O 3.9 g/L培養(yǎng)基中發(fā)酵，葡萄糖30 g/L)中pH 7.0、37 ℃、220 r/min中發(fā)酵33 h。

1.3.2 引物及PCR擴增

本研究所有引物由SnapGene軟件設計，上海生工生物工程公司合成。

1.3.3 基因操作方法及試劑

基因組提取，質粒提取，膠回收，產(chǎn)物純化，高斯組裝均按照試劑盒說明書操作。1%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物，Spizizen法[19]轉化B.subtilis感受態(tài)。

1.3.4 宿主菌構建

通過Cre/lox系統(tǒng)敲除B.subtilis168基因組中dal(GenBank no. CAB12271.1)。首先以質粒p7Z6為模板擴增lox71-BleR-lox66，B.subtilis168基因組為模板分別擴增dal上下游同源臂，以lox71-BleR-lox66和上下游同源臂為模板，通過融合PCR獲得敲除片段，即上游同源+lox71-BleR-lox66+下游同源臂。其次直接將純化好的敲除片段轉化進B.subtilis感受態(tài)中，在含有Ble和D-丙氨酸的LB平板37 ℃過夜培養(yǎng)，PCR驗證正確的即為缺陷型菌株BS168 (dal-,BleR)。最后將溫度敏感型質粒pDG148轉化至BS168 (dal-,BleR)感受態(tài)中，在含有Kan和D-丙氨酸的LB平板上過夜培養(yǎng)，挑取轉化子至僅添加D-丙氨酸的LB平板上51 ℃培養(yǎng)12 h除去質粒pDG148，得到無抗性基因且不含pDG148質粒的敲除菌BS168 (dal)-。

1.3.5 質粒的構建

首先以pET-28a-lap為模板擴增LAP基因，通過Ned Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切，T4酶連接插入至pMA5質粒中得到質粒pMA5-lap。其次以pMA5-lap為模板，通過高斯組裝[20]的方法將質粒中KanR替換為dal構建缺陷互補型表達載體pMA5-lap-dal。最后，為保證食品級表達載體基因來源的安全性，本研究采用定點突變試劑盒的方法刪除pMA5中原有的AmpR和E.coli的Ori。具體方法如下：以pMA5-lap-dal質粒為模板，通過反向PCR的方法得到不含AmpR和Ori (E.coli)的線性質粒 pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-；線性質粒骨架依次通過磷酸化處理，ligation solution環(huán)化，Dpn Ⅰ消化；將環(huán)化質粒轉化至缺陷型菌株BS168 (dal)-感受態(tài)中，得到食品級工程菌BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-。

1.3.6 重組質粒的分離穩(wěn)定性

參照HUANG等[21]方法，考察食品級工程菌BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-質粒分離穩(wěn)定性。具體操作如下：挑取食品級工程菌于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h作為種子液；將種子液分別轉接至含有D-丙氨酸的LB和普通LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，吸取菌液稀釋105后分別涂布于含有D-丙氨酸的LB平板中過夜培養(yǎng);從中分別挑取100個菌落轉接至含有D-丙氨酸和普通LB平板中，統(tǒng)計兩平板菌落數(shù)作為傳代20代的質粒穩(wěn)定性。以此類推，傳代至第100代。用CC/CD來表示質粒分離穩(wěn)定性。其中CC代表重組菌在普通LB培養(yǎng)基中的菌落數(shù)，CD代表重組菌在LB+D-丙氨酸培養(yǎng)基中生長的菌落數(shù)。

1.3.7 酶活測定方法

按照WANG等[22]的方法測定亮氨酸氨肽酶酶活，如公式(1)所示：

(1)

式中：X，樣品的酶活，U/mL；N，于405 nm處測得吸光度值；Y，酶液稀釋的倍數(shù)。

氨肽酶酶活定義為在以上分析測定的基礎上，定義一個酶活單位(U)為在特定條件下(50 ℃，pH 8.5)，每分鐘催化分解L-亮氨酸-硝基苯胺產(chǎn)生1 μmol的對硝基苯胺所需要的酶量。

1.3.8 5 L發(fā)酵罐優(yōu)化

探究不同轉速、溫度、pH對發(fā)酵的產(chǎn)酶的影響，5 L發(fā)酵罐初始轉速設置為200、300、400、500 r/min，溫度設置為30、33、36、39 ℃，pH設置為7.0、7.5和不控制。此外使用搖床優(yōu)化培養(yǎng)基(蛋白胨15 g/L，酵母提取物30 g/L，葡萄糖25 g/L，K2HPO4·3H2O 3.9 g/L，L-谷氨酸鈉5 g/L)發(fā)酵。初始pH為7.0，發(fā)酵過程中使用30%的H3PO4和適當濃度的氨水控制pH，使用20%有機硅消除泡沫。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5軟件作圖，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean±SD)表示。

2 結果與分析

2.1 缺陷型宿主菌的構建

在B.subtilis生長代謝中，D-丙氨酸是參與其細胞壁合成的重要物質。然而在普通培養(yǎng)基中，丙氨酸多為L型，需要D-丙氨酸消旋酶將L-丙氨酸酶催化為D-丙氨酸才能保證菌株的正常生長[23]。如若刪除B.subtilis基因組中的dal，則B.subtilis會因為缺失D-丙氨酸而無法生長。

在敲除過程中，由于敲除片段與B.subtilis168基因組dal區(qū)域同源性極高，會和dal區(qū)域發(fā)生雙交叉互換。而在含有Ble和D-丙氨酸的平板中，只有發(fā)生雙交叉互換的菌株才可以正常生長。為保證食品級表達宿主菌基因組不含有抗性基因，需要質粒pDG148進一步刪除BS168 (dal-,BleR)基因組中遺留的BleR。pDG148質粒含有Cre重組酶編碼基因cre，Cre重組酶可以特異性識別loxP位點并催化lox71和lox66位點使之發(fā)生特異性重組[18]，從而刪除位于lox71和lox66之間的BleR。此外，雖然B.subtilisWB600和B.subtilisWB800刪除了部分的蛋白酶基因，更有利于蛋白質的異源表達。但是它們在構建過程引入了其他抗性基因，不符合GRAS菌的要求，因此B.subtilis168更適合做食品級用酶的宿主菌。

2.2 質粒的構建

質粒圖譜如圖1所示，首先構建質粒pMA5-lap-dal，質粒含有D-丙氨酸消旋酶的完整基因及其啟動子，從而保證含有質粒pMA5-lap-dal的缺陷菌BS168 (dal)-可以在普通培養(yǎng)基中正常生長。為保證基因來源的安全性，在質粒pMA5-lap-dal的基礎上刪除E.coli的Ori和AmpR，進一步構建食品級質粒pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-。

圖1 質粒pMA5-lap、pMA5-lap-dal、pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-圖譜Fig.1 Construction of the plasmid pMA5-lap, pMA5-lap-dal, pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-

與傳統(tǒng)的抗生素依賴性工程菌相比，食品級工程菌是靠自身對D-丙氨酸的營養(yǎng)缺陷形成篩選壓力的。自身的dal代替了原來質粒上的抗性基因，在發(fā)酵過程中不需要額外添加抗生素維持質粒穩(wěn)定性。在源頭上杜絕了抗生素的添加，省略了產(chǎn)物提取過程中去除抗生素這一步驟，即節(jié)省了發(fā)酵生成本，也提高了產(chǎn)物安全性。此外，缺陷型菌株BS168 (dal)-和質粒pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-的構建原理和方法也可以為其他食品用酶表達系統(tǒng)構建提供新思路。

2.3 重組菌的發(fā)酵分析

將BS168/pMA5-lap、BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal、BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-3株重組菌在Super Rich培養(yǎng)基中發(fā)酵33 h。如圖2所示，在發(fā)酵時間達到30 h時，3株菌OD600均達到最大。其中BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal和BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-的OD600曲線相似，最大值分別為9.23和9.58，稍高于BS168/pMA5-lap的最大值。比較3株菌產(chǎn)酶情況可以發(fā)現(xiàn)，菌株BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal、BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-產(chǎn)酶曲線相似，酶活最高達到60 U/mL，是BS168/pMA5-lap最高酶活的2倍。以上結果表明，BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal、BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-在生長、產(chǎn)酶水平方面優(yōu)于BS168/pMA5-lap。

這可能是由于BS168/pMA5-lap的篩選壓力是由卡那霉素提供的，卡那霉素是通過結合核糖體抑制蛋白質合成。雖然KanR在質粒中表達的氨基糖苷磷酸轉移酶可以水解卡那霉素以阻止這種結合[24]，但會在一定程度上影響細胞生長。對于BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal、BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-，篩選壓力是基于菌株自身dal的缺失造成的，篩選標記基因來源于宿主菌自身，菌株的生長負荷小，更有利于食品用酶的表達[16]。最后，為保證重組菌達到GRAS菌株標準，本研究選取BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-做為最終產(chǎn)LAP的工程菌。

a-LAP酶活；b-OD600圖2 菌株BS168/pMA5-lap, BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal, BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-發(fā)酵曲線Fig.2 The fermentation curve of BS168 /pMA5-lap,BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal, BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-

2.4 重組質粒分離穩(wěn)定性

如果質粒分離穩(wěn)定性較差，會發(fā)生嚴重的質粒丟失現(xiàn)象，導致發(fā)酵后期質粒丟失的菌株成為優(yōu)勢菌種，從而嚴重影響目的蛋白表達量[21]。由表1可知，BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-在LB+D-丙氨酸培養(yǎng)基中，第60代以前質?；究梢员ＷC正常的傳代，然而到80代時質粒出現(xiàn)嚴重的丟失現(xiàn)象，傳代至100代，質粒保持率僅為57%。而在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，傳代100代，質粒仍保持良好。這可能是由于普通LB培養(yǎng)基中對BS168 (dal)-存在著強有力的篩選壓力，質粒一旦丟失，則菌株無法正常生長。而在LB+D-丙氨酸的培養(yǎng)基中不存在篩選壓力，無法維持質粒長期分離穩(wěn)定性。

2.5 重組菌5 L發(fā)酵罐不同條件對產(chǎn)酶及生長影響

不同的發(fā)酵條件對菌株的生長代謝和產(chǎn)酶水平往往會有重要影響[25-26]，在搖床優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的基礎上進行5 L發(fā)酵罐優(yōu)化。

考察不同轉速對BS168(dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-產(chǎn)LAP的影響，轉速分別設置為200、300、 400和500 r/min，由圖3可知，隨著轉速的增加，菌體OD600和LAP酶活都呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢。轉速為300 r/min時，OD600和酶活均處于較高水平。

表1 質粒pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-分離穩(wěn)定性Table 1 Separationstabilities of the plasmid pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-

a-LAP酶活；b-OD600圖3 不同轉速對BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-發(fā)酵的影響Fig.3 The effects of different stirring speeds on the fermentation of BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-

考察不同溫度對BS168(dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-產(chǎn)LAP的影響，溫度分別設置為30、 33、 36和39 ℃。如圖4所示，隨著溫度的升高，菌株的產(chǎn)酶周期縮短，最高酶活力減少。在溫度為33 ℃時酶活達最高為206 U/mL。

a-LAP酶活；b-OD600圖4 不同溫度對BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-發(fā)酵的影響Fig.4 The effects of different temperature on the fermentation of BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-

a-LAP酶活；b-OD600圖5 不同pH對BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-發(fā)酵的影響Fig.5 The effects of different pH on the fermentition of BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-

pH可以影響物質分子狀態(tài)和細胞原生質體所帶的電荷，繼而使得細胞的代謝通路和細胞膜的通透性發(fā)生改變，從而影響發(fā)酵產(chǎn)率[27]?？疾觳煌琾H對食品級重組菌產(chǎn)LAP的影響，pH分別設置為7.0、7.5、不控制。由圖5可知，當pH為7.0時，重組菌在36 h酶活達到最大為220 U/mL；在pH為7.0和pH為7.5的條件下，菌體OD600較為接近，但低于pH不控制條件下的OD600。為使菌體更利于產(chǎn)酶，因此選用恒定pH為7.0的條件進行后續(xù)發(fā)酵。

圖6 分批補料條件下，BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal (AmpR, Ori)-發(fā)酵過程曲線Fig.6 Time courses of LAP production by the food-grade recombinant B. subtilis under fed-batch conditions

發(fā)酵后期葡萄糖消耗大，殘?zhí)菨舛鹊停瑫绊懞笃诰w的生長和產(chǎn)酶。合理的補料可以進一步提高產(chǎn)酶[28]。在轉速，溫度，pH 三條件優(yōu)化的基礎上，采用分批流加補料，結果如圖6 所示。在發(fā)酵33～61 h，每隔6 h向發(fā)酵罐中補充葡萄糖，補料4次。重組菌在發(fā)酵至54 h時LAP酶活和OD600均達到最大。發(fā)酵周期雖然延長至54 h，但最高酶活達302 U/mL，相較于未補料時最高酶活220 U/mL，酶活提高37%。

3 結論

本研究基于D-丙氨酸消旋酶缺陷互補，構建了1株不含抗性基因的高產(chǎn)亮氨酸氨肽酶食品級工程菌，解決了B.subtilis在發(fā)酵過程中需要添加抗生素這一問題。在本研究中，發(fā)現(xiàn)食品級工程菌BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-相較于抗生素依賴型工程菌，更適合LAP的表達。對BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-進行5 L發(fā)酵罐優(yōu)化，在轉速300 r/min, 溫度33 ℃，pH 7.0，31～61 h、4次分批補料條件下，酶活最高達到302 U/mL，高于目前汪曉東等[29]報道的138 U/mL，XI等[2]報道的28.5 U/mL，孔峰等[30]報道的232.5 U/mL。結果表明，食品級重組菌BS168 (dal)-/pMA5-lap-dal(AmpR, Ori)-具有較好的工業(yè)應用前景，且該研究也為其他食品加工用酶的菌株構建提供了一定的借鑒和理論指導。