鄭萬財,白羽嘉,馮作山1,,阿衣古麗·阿力木,丁澤人,胡衛(wèi)成

1(新疆農(nóng)業(yè)大學 林學與園藝學院，新疆 烏魯木齊，830052)2(新疆農(nóng)業(yè)大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052)3(新疆果品采后科學與技術重點實驗室，新疆 烏魯木齊，830052)

新疆天山北麓地區(qū)具有典型的大陸性氣候的特點，光熱資源豐富，氣候條件、土壤、水資源完全滿足生產(chǎn)優(yōu)質葡萄原料的條件，是我國面積最大的釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)[1-2]。但葡萄采收季節(jié)干旱少雨、光照強度高、晝夜溫差大，葡萄采后易失水從而造成葡萄中酚類物質的損失，使釀造的葡萄酒糖高、酸低、色澤不穩(wěn)定[3]。葡萄中的酚類物質主要來源于葡萄皮下組織，是葡萄酒中最主要的有效成分[4-5]。葡萄中酚類物質成分復雜，與葡萄酒的口感、色澤、香氣密切相關[6]。葡萄酒中酚類物質變化不僅受到葡萄生長過程的積累，還受葡萄采后運輸、加工、貯藏等多方面的影響[7-8]。

葡萄采后酚類物質的降解主要是與氧接觸后發(fā)生酶促褐變，完整的葡萄果實中，酚類物質主要存在于液泡中，酶促褐變底物多酚氧化酶則存在于細胞質中，兩者并未發(fā)生接觸[9-10]。葡萄采后失水會使葡萄表皮蠟質層及細胞結構發(fā)生改變，溫度和水分脅迫加速了中果皮細胞的萎縮和調亡，在不同溫度水分脅迫下，葡萄采后失水使酚類物質與氧及多酚氧化酶發(fā)生反應，導致酚類物質的降解[11]。據(jù)報道[12]，在7 ℃和35%相對濕度條件下葡萄質量損失達30%和40%時，葡萄失水增加了其糖酸含量及抗氧化活性，影響了葡萄中酚類物質的含量，葡萄采后失水使葡萄品質特性發(fā)生變化。在真空條件下，不同溫度(50、60、70、80和90 ℃)對葡萄果實處理發(fā)現(xiàn)干燥溫度對酚類化合物有顯著影響，真空干燥后各溫度抗氧化活性均降低，結果表明葡萄采后酚類物質變化與失水率、失水溫度密切相關[13]。目前葡萄酚類物質的研究主要集中在葡萄成熟、釀造過程中其種類和含量的變化、葡萄酒中酚類物質組成及其與抗氧化活性的關系[14]，對于釀酒葡萄采后失水對酚類物質與細胞超微結構的影響研究相對較少。

釀酒葡萄采后失水可應用于釀造甜型、半甜型葡萄酒[15-16]，進一步研究葡萄采后失水機理，優(yōu)化采后失水條件有利于釀造特種加強型葡萄酒。新疆干燥的氣候條件易使葡萄發(fā)生失水反應，為釀造甜型、半甜型葡萄酒創(chuàng)造了得天獨厚的地理優(yōu)勢，目前葡萄采后失水過程中生理變化機制尚不明確，明確葡萄采后失水過程中生理生化機制，為開發(fā)新的釀酒工藝及其設備提供必要的數(shù)據(jù)參考，為促進新疆葡萄酒產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

挑選完全成熟“赤霞珠”葡萄(新疆農(nóng)業(yè)科技園)可溶性固形物質量分數(shù)為20%～21%，濕基含水率為77.10%，果實色澤深紫、大小均勻(直徑為1.25 mm)、單果平均果質量1.02 g，無病害、無損傷的果實為試驗材料。蘆丁、沒食子酸、單寧酸標準品，美國 Sigma 北京分公司；NaOH、H3PO4、HCl、甲醇、Na2HPO3、無水醋酸鈉、NaH2CO4、鎢酸鈉、磷鉬酸、NaNO2、Al(NO3)3、乙醇(分析純)，天津光復科技有限公司；福林肖卡試劑(優(yōu)級純)，北京索萊寶科技有限公司；Na2HPO4、Na2PO4、丙酮、環(huán)氧樹脂、戊二醛(分析純)，生工生物(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設備

HR 手持折光儀，上海儀邁儀器科技有限公司；WB20004 電子天平，上海方瑞儀器有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；TGL-16 gR高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；UC6超薄切片機，德國徠卡(Leica)儀器有限公司；JEOLM-1230透射電鏡，日本電子株式會社；DHG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；CS101型電熱恒溫恒濕干燥箱，烏魯木齊電器設備制造廠，經(jīng)本實驗室改造后，可對樣品質量進行實時自動檢測和顯示。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備

所取樣品隨機分為15組，每組2 kg，將各組葡萄平鋪于干燥箱中，分別在溫度25 ℃和45 ℃，相對濕度<20%，風速1 m/s條件下進行失水處理，分別在12、24、36、48、72 h時取樣并測定各項指標。另根據(jù)失水過程中的質量，分別在質量損失20%、40%、60%時取樣，以備于葡萄皮超微結構的觀察。

1.3.2 葡萄皮中酚類物質的提取

采用超聲輔助法進行提取，準確稱取3.00 g葡萄皮，用30 mL酸化甲醇溶液(1 mol/L HCl-甲醇-水，體積比1∶80∶19)，在100 W、25 ℃功率條件下超聲輔助提取30 min，然后8 000 r/min, 4 ℃離心15 min，收集上清液，重復3次，合并提取液。

1.3.3 葡萄皮中酚類物質的測定

采用手持折光儀測定可溶性固形物含量；總酚含量測定采用福林-肖卡法[17]；總花色苷含量測定采用pH示差法[18]；總黃酮的測定[19]；單寧含量的測定采用福林-丹尼斯法[17]。

1.3.4 葡萄皮超微結構觀察

用雙面刀片將“赤霞珠”葡萄果皮切成1 mm×1 mm×2 mm大小的塊，用4%戊二醛(0.1 mol/L磷酸緩沖液配制，pH 7.2)在4 ℃下前固定2 h。用pH 7.2的磷酸緩沖液漂洗3次，每次15 min。用1%鋨酸(磷酸緩沖配制)4 ℃后固定2 h，用磷酸緩沖沖洗漂洗3次，每次30 min。用50%、70%、80%、90%、100%丙酮梯度脫水，各級30 min。環(huán)氧樹脂EPon-812滲透包埋，37 ℃烘箱聚合12 h后，于45 ℃聚合12 h，最后在60 ℃下聚合24 h。用超薄切片機切成60 nm的薄片，再經(jīng)鉛鈾電子染色后，透射電鏡觀察拍照。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用Origin 8.5軟件作圖，并采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析和相關性分析，采用鄧肯氏多重比較法進行差異分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 葡萄采后失水對可溶性固形物含量的影響

葡萄在采后失水過程中重量下降，可溶性固形物含量上升。由圖1可知，采后新鮮葡萄果實葡萄總重為2 kg，可溶性固形物為28.1 °Brix，25 ℃和45 ℃失水72 h后，總質量分別為1.76、1.47 kg，可溶性固形物分別為32.4 °Brix、41.1 °Brix，隨著葡萄采后失水處理時間的延長，葡萄發(fā)生失水及代謝反應，導致葡萄質量在不斷下降，整個失水過程中，45 ℃葡萄失水量。大于25 ℃處理組葡萄失水量葡萄在失水過程中，可溶性固形物含量整體呈現(xiàn)不斷上升趨勢，0～24 h處理中25 ℃組和45 ℃組處理可溶性固形物含量升趨勢基本一致，24 h后45 ℃處理組上升速率顯著大于25 ℃處理組。

圖1 葡萄采后失水對總重和可溶性固形物含量的影響Fig.1 Effect of postharvest dehydration on total weight and soluble solid content of grape注：*表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 葡萄采后失水對皮中總酚含量的影響

酚類物質與葡萄的色澤、品質和風味等作用密切相關，對葡萄的貯藏、加工性能、營養(yǎng)價值和醫(yī)療保健作用都具有重要影響。由圖2可知，采后新鮮葡萄果實皮中總酚含量為21.70 mg/g，隨著葡萄采后失水處理時間的延長，0～12 h葡萄總酚含量呈現(xiàn)上升趨勢，12 h后25 ℃和45 ℃處理組均呈現(xiàn)下降的趨勢，且45 ℃處理組總酚含量下降速率顯著大于25 ℃處理組，72 h時均達到最小值，分別為27.97 mg/g和14.32 mg/g，CK、25 ℃處理組在72 h時的總酚含量是45 ℃處理組的1.93和1.95倍?？偡雍侩S著失水處理整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。有研究表明，20 ℃葡萄采后失水10%時白藜蘆醇和兒茶素含量顯著增加；失水20%時酚酸含量顯著增加；花色苷在10 ℃和20 ℃顯著增加，在30 ℃時下降；PPO酶活在10 ℃時活性持續(xù)時間較長，在20 ℃和30 ℃時活性持續(xù)下降；苯丙烷代謝相關酶活基因在10 ℃時表達上調，在30 ℃時表達下調。說明葡萄中酚類物質變化在采后失水中受溫度影響較大[20]。

圖2 葡萄采后失水對皮中總酚含量的影響Fig.2 Effect of postharvest dehydration on total phenolics content in the skin

2.3 葡萄采后失水對皮中花色苷含量的影響

花色苷是葡萄酒中的主要呈色物質，對葡萄酒色澤至關重要[21-22]?；ㄉ辗€(wěn)定性受溫度影響非常大，并且花色苷的熱穩(wěn)定性與其結構、pH、氧以及體系中其他化合物的反應有關。當溫度升高時，花色苷轉化為無色的查爾酮和甲醇假堿，最后查爾酮迅速降解，生成苯甲酸及2，4，6-三羥基苯甲醛等終產(chǎn)物[23-24]。由圖3可知，采后新鮮葡萄果實皮中花色苷含量為3.38 mg/g，隨著葡萄采后失水處理時間的延長，0～12 h葡萄25 ℃處理呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，45 ℃處理在0～24 h時花色苷含量變化無顯著性差異，24 h后呈現(xiàn)下降的趨勢，且45 ℃處理下降速率總體顯著大于25 ℃處理組，其中，25 ℃失水處理在48 h達到最小值2.61 mg/g。45 ℃失水處理在72 h達到最小值0.73 mg/g，花色苷含量隨著失水處理整體呈現(xiàn)下降的趨勢。但25 ℃處理組在0～12 h有顯著上升的趨勢，隨著失水程度的升高，細胞破裂，導致花色苷分子的擴散和流動,與細胞間隙中所含氧氣、空氣中的氧氣接觸，致使其發(fā)生花色苷的氧化反應[25]。葡萄酒的色素主要來源于葡萄皮中的花色苷，葡萄采后失水花色苷含量的變化直接影響葡萄酒的色澤和品質。

圖3 葡萄采后失水對皮中總花色苷含量的影響Fig.3 Effect of postharvest dehydration on total anthocyanin content in the skin

2.4 葡萄采后失水對皮中總黃酮含量的影響

黃酮類化合物是自然界存在的酚類化合物的最大類別之一，黃酮類化合物主要來自于葡萄皮、葡萄籽及果梗，在紅葡萄酒中占酚類物質的80%以上[26]。由圖4可知，采后新鮮葡萄果實總黃酮含量為19.23 mg/g，隨著采后失水時間的延長，總黃酮含量隨著葡萄失水處理時間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。72 h處理結束時25 ℃總黃酮含量為27.58 mg/g，45 ℃失水達到最小值13.33 mg/g。葡萄皮中總黃酮含量受溫度和時間影響較大，與25 ℃處理組相比45 ℃處理在36～72 h處理時黃酮含量急劇下降。

圖4 葡萄采后失水對皮中總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of postharvest dehydration on the total flavonoids content in the skin

2.5 葡萄采后失水對皮中單寧含量的影響

單寧是主要的酚類物質，對葡萄酒的滋味與口感有顯著影響。由圖5可知，采后新鮮葡萄果實皮中單寧含量為18.33 mg/g，隨著葡萄采后失水處理時間延長，0～12 h葡萄單寧含量呈現(xiàn)上升趨勢，12 h后25 ℃處理和45 ℃處理單寧含量均呈現(xiàn)下降的趨勢，且45 ℃處理組單寧含量下速率勢顯著大于25 ℃處理組，失水處理葡萄皮中單寧72 h均達到最小值，25 ℃和45 ℃單寧含量分別為18.84 mg/g和11.48 mg/g，25 ℃處理組在72 h時單寧含量高于采后新鮮葡萄，45 ℃處理組在72 h時單寧含量明顯低于采后新鮮葡萄果實。葡萄中單寧含量隨著葡萄失水處理整體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，45 ℃處理組單寧降解顯著大于25 ℃處理組。

圖5 葡萄采后失水對皮中單寧含量的影響Fig.5 Effect of postharvest dehydration on tannin content in the skin

2.6 葡萄采后失水對果皮超微結構影響

新鮮葡萄果皮細胞，細胞核、葉綠體、細胞壁清晰可見。如圖6中的A，在透射電鏡下葡萄果皮細胞呈不規(guī)則狀分布，液泡占細胞體積較大；細胞核結構完整，具有清晰的雙層膜結構，染色質均勻地分散在細胞質中，細胞膜結構完整，細胞壁和細胞膜結合緊密；細胞壁均勻致密，結構清晰；葉綠體有完整的細胞膜，葉綠體內有較多的淀粉顆粒，可以觀察到數(shù)量較多的線粒體。

隨著葡萄不斷失水，細胞核、葉綠體發(fā)生降解，細胞壁發(fā)生變形，不斷出現(xiàn)質壁分離現(xiàn)象，且溫度越高現(xiàn)象越明顯。如圖6中的B，質量損失20%時，25 ℃處理組細胞核結構完整，具有清晰的雙層膜結構，染色質出現(xiàn)凝結現(xiàn)象；細胞壁結構整齊，結構清晰。與對照組相比，細胞結構無明顯差異，細胞質壁分離現(xiàn)象不明顯，可以觀察到數(shù)量較多的線粒體。45 ℃處理組細胞核結構完整，具有清晰的雙層膜結構，染色質出現(xiàn)大量凝結現(xiàn)象，細胞壁和細胞膜出現(xiàn)質壁分離；細胞壁整齊，但發(fā)生收縮變形；葉綠體數(shù)量減少，嗜鋨顆粒明顯增多，由于液泡膜的破壞，細胞基質中出現(xiàn)囊泡。如圖6中的C，質量損失40%時，25 ℃處理組，細胞核已經(jīng)降解消失，細胞質發(fā)生大量凝聚，出現(xiàn)明顯的質壁分離現(xiàn)象；細胞壁發(fā)生變形、凝聚；細胞內出現(xiàn)大量嗜鋨顆粒明顯增多和囊泡。45 ℃處理組細胞核已經(jīng)降解消失，細胞質發(fā)生大量凝聚，質壁分離現(xiàn)象嚴重；細胞壁發(fā)生凝集、降解。葉綠體、線粒體數(shù)量明顯減少，嗜鋨顆粒和囊泡大量出現(xiàn)。如圖6中的D，質量損失60%時25 ℃處理組，細胞核降解消失，細胞質高度凝結；細胞壁不再致密，質壁分離嚴重。由于細胞器的融合降解，細胞內出現(xiàn)大量空洞。45 ℃處理組細胞核降解消失，細胞質松散凝結；細胞壁和細胞膜質壁分離；細胞內出現(xiàn)大量嗜鋨顆粒和囊泡，細胞器降解消失。

嗜鋨顆粒是葉綠體類囊體膜降解以及脂質類降解物聚集的結果，其出現(xiàn)作為細胞膜結構和色素瓦解的積累產(chǎn)物[27]，葉綠體“囊泡化”是植物在逆境脅迫下普遍產(chǎn)生的共同現(xiàn)象[28]。URCAN 等[15]研究認為，在較高溫度條件下脫水時，溫度脅迫導致葡萄不斷失水，阻止氧氣的進入，脫水使表皮破損有利于酚類化合物轉移至果肉中，但低溫失水易與氧氣接觸發(fā)生褐變。ROGIERS等[29]分析發(fā)現(xiàn)果皮表面蠟質層在果實成熟后基本保持穩(wěn)定，葡萄采后蠟質層不斷減少，從而使葡萄表皮蒸騰速率加強。BONADA等[30]研究葡萄采后溫度對細胞凋亡的影響結果顯示，升高溫度加速了葡萄采后中果皮細胞的死亡和萎縮。研究結果表明，葡萄采后不同溫度失水使葡萄表皮發(fā)生皺縮、破裂、凋亡，葡萄中的酚類物質在失水過程中不斷發(fā)生氧化降解，失水溫度越高越顯著。酚類物質的氧化降解與葡萄表皮的皺縮、破裂、凋亡密切相關。與上述研究結果基本一致。

A-采后新鮮葡萄果皮；B-質量損失20%處理組；C-質量損失40%處理組；D-質量損失60%處理組Ⅰ、Ⅱ分別為25 ℃和45 ℃失水處理圖6 葡萄采后失水對皮超微結構的影響Fig.6 Effect of postharvest dehydration on the ultrastructure of the skin

3 結論

隨著葡萄采后失水時間的變化，45 ℃失水質量下降較25 ℃失水快。失水過程中葡萄可溶性固形物含量呈上升趨勢，失水后期45 ℃失水固形物含量顯著高于25 ℃處理組?？偡?、總花色苷、單寧、總黃酮含量隨著葡萄失水均呈現(xiàn)初期上升后下降趨勢，45 ℃處理組降解速率顯著大于25 ℃處理組，失水初期葡萄失水速率較快，葡萄受到失水應激反應，失水初期酚類物質呈現(xiàn)一定的上升趨勢，后期隨著細胞的破裂死亡，與氧氣接觸后發(fā)生氧化降解，酚類物質含量不斷下降。通過細胞表皮電鏡觀察，采后新鮮葡萄果實細胞表皮細胞呈扁平狀，液泡占細胞體積較大；細胞膜結構完整，細胞中葉綠體數(shù)量較多且有一定的淀粉顆粒；細胞質中染色質分散均勻。隨著葡萄不斷失水，葡萄表皮細胞發(fā)生嚴重的皺縮、變形、死亡。

結合采后失水過程中各指標含量的檢測分析與細胞表皮電鏡觀察，葡萄失水導致其質量不斷下降、可溶性固形物含量升高，采后失水使葡萄中的水分散失，糖類物質發(fā)生濃縮結晶，葡萄皮細胞發(fā)生皺縮、破裂、細胞器消失、最終細胞發(fā)生凋亡。較高失水溫度加速了葡萄采后失水速率，由于細胞中內容物溢流至細胞外，其中多酚氧化酶及酚類物質與外界氧氣充分接觸，使葡萄皮中總花色苷、總黃酮、單寧等酚類物質發(fā)生氧化降解，故其含量不斷下降。通過采后失水的方式釀造甜型葡萄酒，需要進一步優(yōu)化工藝條件以防酚類物質的降解。葡萄采后失水機制還需進一步的研究，以確定其采后失水代謝通路與關鍵代謝產(chǎn)物，以期為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。