王強(qiáng),賀稚非,謝躍杰,魏華恒,李洪軍*
1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,重慶, 400715)2(重慶第二師范學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院,重慶, 400067)3(重慶第二師范學(xué)院,脂質(zhì)資源與兒童日化品協(xié)同創(chuàng)新中心,重慶,400067)
結(jié)構(gòu)脂質(zhì)(structured lipids,SLs),簡(jiǎn)稱(chēng)結(jié)構(gòu)脂,是指經(jīng)化學(xué)或酶法改變甘油三酯碳鏈骨架上脂肪酸組成或者位置分布,且具有特定分子結(jié)構(gòu)、特殊功能作用的一類(lèi)甘油三酯(triglyceride,TAG)。結(jié)構(gòu)脂質(zhì)在其結(jié)構(gòu)上的差異不僅包含接入甘油三酯骨架上脂肪酸的不同種類(lèi),也包含由脂肪酸在甘油骨架上的隨機(jī)/選擇性定位效應(yīng)(外側(cè)的sn-1和sn-3位,或中間的sn-2位)。由于甘油骨架特定位置上連接了具有特殊營(yíng)養(yǎng)或生理功能的脂肪酸,所以結(jié)構(gòu)脂質(zhì)在保留天然油脂的部分或全部性質(zhì)外,還能夠最大程度上發(fā)揮各種脂肪酸的功能[1]。有多項(xiàng)研究表明[2],結(jié)構(gòu)脂作為一類(lèi)新型油脂在體內(nèi)消化吸收快,能量供應(yīng)少,兼具有特定的保健營(yíng)養(yǎng)和生物學(xué)功能,已逐步應(yīng)用于食品、保健品、醫(yī)藥和化妝品等眾多行業(yè)。美國(guó)、日本先后開(kāi)發(fā)出在減肥及脂肪替代等領(lǐng)域商用的結(jié)構(gòu)脂Salatrim(美國(guó)納貝斯克)、Caprenin(美國(guó)寶潔)、Salatrim (美國(guó)Nabisco)、Olestra(美國(guó)寶潔)、diacylglycerol(日本花王)、NovaLipidTM以及Loders Croklaan CrokvitolTM系列產(chǎn)品。在所有結(jié)構(gòu)脂中,長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸MLM型結(jié)構(gòu)脂被認(rèn)為是結(jié)構(gòu)脂最理想的結(jié)構(gòu)形式,具有吸收好、功能性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)特性顯著的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)。本文針對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)酯的合成方法及產(chǎn)物合成影響因素的最新研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述,以期為相關(guān)功能性結(jié)構(gòu)脂的制備及結(jié)構(gòu)修飾研究提供參考。
結(jié)構(gòu)脂并不是甘油三酯經(jīng)簡(jiǎn)單摻合形成的混合物,而是將不同脂肪酸以交叉組合的方式與甘油碳鏈骨架酯化后形成結(jié)構(gòu)多樣的甘油三酯。結(jié)構(gòu)脂有兩種公認(rèn)的分類(lèi)形式,一種是基于脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度分類(lèi)。由于脂肪酸可分為短鏈脂肪酸(S,少于6個(gè)碳原子)、中鏈脂肪酸(M,6~12個(gè)碳原子)和長(zhǎng)鏈脂肪酸(L,多于12個(gè)碳原子),因此,基于甘油三酯中sn-1,sn-2及sn-3位置的差異和脂肪酸碳鏈的長(zhǎng)度,結(jié)構(gòu)脂可劃分為sn-1-短鏈-2-中鏈-3-短鏈型(SMS)、sn-1-短鏈-2-長(zhǎng)鏈-3-短鏈型(SLS)、sn-1-長(zhǎng)鏈-2-中鏈-3-長(zhǎng)鏈型(LML)、sn-1-中鏈-2-長(zhǎng)鏈-3-中鏈型(MLM)、sn-1-中鏈-2-中鏈-3-中鏈型(MMM)、sn-1-中鏈-2-長(zhǎng)鏈-3-長(zhǎng)鏈型(MLL)等種類(lèi)多樣的結(jié)構(gòu)類(lèi)型。此外,結(jié)構(gòu)脂還可以基于結(jié)構(gòu)的對(duì)稱(chēng)性進(jìn)行分類(lèi):非對(duì)稱(chēng)性結(jié)構(gòu)脂和對(duì)稱(chēng)性結(jié)構(gòu)脂。其中,對(duì)稱(chēng)性結(jié)構(gòu)脂還包括單酸型對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)脂(2-MAG)和二酸型對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)脂(1,3-DAG),非對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)脂包括二酸性非對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)脂(1,2-DAG)和三酸性非對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)脂(MLM或MMM等)[3]。有證據(jù)表明[4],結(jié)構(gòu)脂的脂肪酸組成及其在甘油碳鏈骨架上的位置均與天然油脂原料有所不同,這些不同使得結(jié)構(gòu)脂在物理、化學(xué)性質(zhì)上與天然油脂有較為明顯的差異,特別是在油脂結(jié)晶構(gòu)型、界面配向性、氧化穩(wěn)定性和低熱值等方面有較大的差異。此外,甘油三酯的3個(gè)?;贿€可以連接低聚糖類(lèi)、聚酯類(lèi)化合物、淀粉類(lèi)、生物堿等多種化合物,從而發(fā)揮更多理化及生理功能。SUN等[5]用蓖麻油作為咖啡?;荏w,通過(guò)酶促酯交換成功制備了一種新型蓖麻油基咖啡酰結(jié)構(gòu)脂,該結(jié)構(gòu)脂質(zhì)具有較強(qiáng)的生物抗氧化和紫外吸收能力,目前已用于多個(gè)食品和化妝品領(lǐng)域用作抗氧化劑和紫外線(xiàn)吸收劑。在營(yíng)養(yǎng)和醫(yī)療領(lǐng)域,結(jié)構(gòu)脂還廣泛用于生產(chǎn)模擬母乳的嬰兒配方奶粉、塑性脂肪、可可脂替代脂以及低熱量脂肪的生產(chǎn)與應(yīng)用[6]。
長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)脂可以通過(guò)物理調(diào)配、化學(xué)催化、酶催化等方法改性制得。在這些方法中,物理調(diào)配法雖然較為安全,但產(chǎn)物合成率較低,往往無(wú)法有效定量得到理想的結(jié)構(gòu)脂?;瘜W(xué)催化法雖然能夠通過(guò)特定的反應(yīng)合成路線(xiàn)獲得目標(biāo)結(jié)構(gòu)脂,但催化反應(yīng)是隨機(jī)的酯交換反應(yīng),無(wú)特異選擇性,且反應(yīng)產(chǎn)物難控制,不易生產(chǎn)出具有特定結(jié)構(gòu)的重構(gòu)脂質(zhì)。此外,化學(xué)法反應(yīng)條件劇烈(>100 ℃)、副反應(yīng)多,產(chǎn)物得率低且分離困難,生產(chǎn)過(guò)程中的化學(xué)試劑也容易污染環(huán)境[7]。與化學(xué)催化法相比,酶催化法是一種較為安全、綠色和可控的有效制備方法,具有反應(yīng)時(shí)間短、條件溫和(<70 ℃)、選擇性強(qiáng)、高效可控、操作簡(jiǎn)單、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),可以通過(guò)調(diào)控反應(yīng)條件(如時(shí)間、溫度、底物摩爾比、酶量等)來(lái)增加產(chǎn)品的純度和產(chǎn)量,是結(jié)構(gòu)脂制備的首選方法。SUBAJINY等[8]認(rèn)為酶法合成結(jié)構(gòu)脂不含反式脂肪酸的優(yōu)勢(shì)也是其可以廣泛用于食品工業(yè)油脂合成的重要原因。目前長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)脂的合成方法主要有3種:酯交換法、酸解法和醇解法。
對(duì)于天然油脂而言,脂肪酸在甘油?;簧系姆植际请S機(jī)的。目前學(xué)術(shù)界主要有3種分布學(xué)說(shuō),分別是:全隨機(jī)分布學(xué)說(shuō)、sn-1-隨機(jī)-sn-2-隨機(jī)-sn-3-隨機(jī)分布學(xué)說(shuō)、sn-1,3-隨機(jī)-sn-2-隨機(jī)分布學(xué)說(shuō)。對(duì)于天然植物油的甘三酯來(lái)說(shuō),sn-1,3-隨機(jī)-sn-2-隨機(jī)分布學(xué)說(shuō)具有更廣泛的普適性。與天然油脂的結(jié)構(gòu)相比,脂肪酶可定向作用于甘油三酯的特殊?;恢?,因此酶法合成結(jié)構(gòu)脂的產(chǎn)物主要由結(jié)構(gòu)脂的制備方法決定。KIM等[9]用兩種固定化脂肪酶將二十碳戊烯酸(EPA,eicosatrmacnioc acid)與葵花籽油進(jìn)行酯化,不僅降低了天然玉米油中三油酸甘油三酯的含量,改性后的甘油三酯還含有更高含量的EPA。PINA-RODRIGUEZ等[10]使用Novozym 435脂肪酶在莧菜油sn-2位置接入了棕櫚酸,然后用脂肪酶RM IM在sn-1,3位置接入二十二碳六烯酸(DHA,docosahexaenoic acid),最終將DHA作為目標(biāo)脂肪酸加入至莧菜油甘油三酯中,改變了原有天然莧菜油的脂肪酸組成。
酯交換法是酰基脂肪酸在TAG內(nèi)部和TAG之間隨機(jī)化或定向交換位置的過(guò)程。酶促酯交換反應(yīng)分兩步完成,脂肪酶Ser—OH基團(tuán)親核進(jìn)攻酰基碳,形成?;?酶共價(jià)復(fù)合物后導(dǎo)致脂肪酸和甘油骨架碳鏈之間的鍵發(fā)生斷裂,待釋放后的脂肪酸與游離脂肪酸混合后,再隨機(jī)或定向接入至甘油骨架“空白”的位置形成新的甘油三酯。TEICHERT等[11]通過(guò)Novozym 435脂肪酶催化三棕櫚酸甘油酯(PPP)與硬脂酸大豆油酯交換反應(yīng)合成sn-2位棕櫚酸結(jié)構(gòu)甘油三酯,在反應(yīng)時(shí)間18 h,反應(yīng)溫度65 ℃,底物摩爾比1∶2條件下得到了含量為60.63%的sn-2位棕櫚酸酯。NAGACHINTA等[12]則通過(guò)Lpozyme TL IM脂肪酶催化三棕櫚甘油酯與二十二碳六烯酸、花生四烯酸(AA)乙酯乙酸進(jìn)行酯交換合成含有sn-2位富含棕櫚酸與不飽和脂肪酸的結(jié)構(gòu)脂質(zhì),其sn-2位棕櫚酸含量可高達(dá)40%以上。在脂肪酶作用的酯交換反應(yīng)中,當(dāng)原料油脂與目標(biāo)產(chǎn)物均為甘油三酯時(shí),目標(biāo)產(chǎn)物分離較為困難且無(wú)法通過(guò)分離副產(chǎn)物的方式使反應(yīng)平衡向目標(biāo)產(chǎn)物方向移動(dòng)。因此,針對(duì)不同的原料脂肪酸差異化的選擇定向脂肪酶是降低副產(chǎn)物、提高最終產(chǎn)物合成率的關(guān)鍵因素之一(圖1)。
圖1 酯交換法制備結(jié)構(gòu)脂反應(yīng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of structural lipid reaction prepared by transesterificatio
與酯交換法類(lèi)似,結(jié)構(gòu)脂的脂肪酶酸解反應(yīng)也需要兩步完成:水解與酯化。首先TAG在酶作用下水解生成游離脂肪酸和DAG(或MAG),在脂肪酶的作用下新的游離脂肪酸再與DAG(或MAG)酯化合成TAG。對(duì)于酸解反應(yīng)而言,要制備sn-2長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸TAG,游離脂肪酸最好來(lái)源于單一長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸,在此條件下得到的目標(biāo)TAG含量才會(huì)比較高。TEICHERT等[13]通過(guò)脂肪酶催化sn-2位含棕櫚酸的單硬脂酸大豆油結(jié)構(gòu)脂與DHA和α-亞麻酸(ALA)酸解反應(yīng)制成含PUFA的結(jié)構(gòu)脂,其sn-2位棕櫚酸含量均能夠達(dá)到54%以上。酸解反應(yīng)常被用于在非水介質(zhì)中由sn-1,3-特異性脂肪酶催化合成sn-2長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)脂,其優(yōu)勢(shì)在于能夠更簡(jiǎn)單地預(yù)測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的組成[14]。但是,在無(wú)溶劑系統(tǒng)中使用熱穩(wěn)定性較好的脂肪酶可以有效降低最終產(chǎn)品中脂肪酶純化和回收,因此,基于脂肪酶的酸解反應(yīng)通常需要增加中長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的含量來(lái)提高結(jié)構(gòu)脂的合成率。
在酸解法制備多不飽和脂肪酸TAG過(guò)程中,辛酸和癸酸常被用作sn-1,3位置的酰基供體積。YANG等[15]利用脂肪酶對(duì)金槍魚(yú)油和辛酸進(jìn)行酸解,得到的MLM型結(jié)構(gòu)脂類(lèi)反應(yīng)產(chǎn)物中sn-1,3位的辛酸占比為22.50%,sn-2位點(diǎn)DHA+EPA的含量則與生金槍魚(yú)油相似。該研究表明制備sn-2長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸TAG的供體最好以富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的動(dòng)植物油為供體進(jìn)行酯基化反應(yīng)為宜。除了?;w以外,在水解過(guò)程中影響酸解反應(yīng)的主要因素還包括特異性脂肪酶和底物的摩爾比,適量増加脂肪酸和選擇適當(dāng)?shù)闹久妇商岣呓Y(jié)構(gòu)脂的產(chǎn)量。WEI等[16]在有溶劑條件下使用sn-1,sn-3特異性脂肪酶催化油酸與PPP生成sn-2位棕櫚酸甘油酯,并研究了酶添加量和底物摩爾比對(duì)酸解反應(yīng)的影響,結(jié)果顯示,結(jié)構(gòu)脂質(zhì)在無(wú)溶劑和有溶劑情況下得到的產(chǎn)率分別為40.23%和32.34%,其中sn-2位棕櫚酸酯的含量分別高達(dá)86.62%、92.92%。由于酸解法中的甘油三酯可根據(jù)需要直接采用各種油脂,由于原料來(lái)源廣泛,所以生產(chǎn)成本相對(duì)較低,產(chǎn)物中過(guò)量的游離脂肪酸可采用蒸餾的方法從混合物中簡(jiǎn)便的分離出去。因此,工業(yè)化生產(chǎn)選擇性結(jié)構(gòu)脂質(zhì)生產(chǎn)大多采用酸解法。
圖2 酶促酸解法制備結(jié)構(gòu)脂反應(yīng)示意圖Fig.2 Schematic diagram of enzymatic hydrolysis reaction
酶催化醇解合成多不飽和脂肪酸TAG通常采用兩步法:首先是富含PUFA的油脂或三多不飽和脂肪酸甘油酯(如DHA甘油三酯)與乙醇在sn-1,3特異性脂肪酶作用下催化醇解反應(yīng)生成sn-2單甘酯(2-MAG);其次是游離脂肪酸與2-MAG在脂肪酶的催化下進(jìn)行酯化得到長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸TAG。SCHMID等[17]通過(guò)sn-1,3位特異脂肪酶催化醇解法制備sn-2位棕櫚酸甘油酯,第一步將PPP醇解得到MPG,使用低溫溶劑結(jié)晶法分離MPG,其純度超過(guò)95%且得率達(dá)85%;第二步在相同酶催化作用下使油酸與MPG進(jìn)行酯化反應(yīng)制得sn-2位棕櫚酸甘油酯,其含量高達(dá)96%。PFEFFER等[18]也采用相同的方法合成sn-2位棕櫚酸甘油酯,第一步得到的2-MPG純度為77%且產(chǎn)率為73%,第二步制得sn-2位棕櫚酸含量達(dá)95%。盡管采用醇解法制備的TAG副產(chǎn)物較少且易分離,目標(biāo)產(chǎn)物sn-2不飽和脂肪酸TAG的純度和產(chǎn)量也較高,但是醇解反應(yīng)分兩步進(jìn)行,反應(yīng)中間環(huán)節(jié)還需要分離單甘酯,因此酶催化醇解方法的成本較高,并不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
圖3 酶促醇解法制備結(jié)構(gòu)脂反應(yīng)示意圖Fig.3 Schematic diagram of enzymatic hydrolysis reaction
盡管如此,與一步催化反應(yīng)相比,醇解法制備TAG的過(guò)程可大大減少酰基轉(zhuǎn)移的發(fā)生,在增強(qiáng)反應(yīng)特異性的同時(shí),還提高了工藝生產(chǎn)率,適合于制備結(jié)構(gòu)復(fù)雜、生產(chǎn)成本高的結(jié)構(gòu)脂。一般情況下,在結(jié)構(gòu)脂質(zhì)合成的過(guò)程中甘油酯的酰基容易發(fā)生轉(zhuǎn)移,這個(gè)過(guò)程會(huì)產(chǎn)生不必要的甘油酯致使目標(biāo)產(chǎn)物純度下降。即使采用sn-1,3區(qū)域選擇性脂肪酶,也會(huì)發(fā)生?;w移現(xiàn)象生成TAG的副產(chǎn)物。因此,?;w移必須主要通過(guò)控制反應(yīng)參數(shù)(如反應(yīng)溫度、催化劑負(fù)載、含水量和溶劑類(lèi)型)來(lái)加以控制。操麗麗等[19]以菜籽油和無(wú)水CH3CH2OH為原料,用Lipozyme TL IM固定化脂肪酶催化制備高純度的2-MAG來(lái)獲取中長(zhǎng)碳鏈型(MLM)結(jié)構(gòu)脂。在最優(yōu)化工藝條件下,2-MAG的含量從38.82%上升到90.76%。結(jié)果證實(shí)醇解法減少了sn-2?;w移并提高了工藝生產(chǎn)率。ABED等[20]在無(wú)溶劑體系中,用Lipozyme RM IM脂肪酶催化醇解微生物油與辛酸,得到的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)在sn-2位含有49.45%的花生四烯酸,在sn-1,3位含有29.7%辛酸。
表1 長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)脂酶法合成研究底物及合成方法Table 1 Studies on the Lipase Synthesis of PUFAs for Structured lipids
直接酯化法是以長(zhǎng)碳鏈脂肪酸、中碳鏈脂肪酸(?;w)和甘油為原料,在合適的溫度下,控制好底物相應(yīng)的摩爾比,在脂肪酶的催化作用下使反應(yīng)平衡向有利于酯化的方向進(jìn)行。SNEHAL等研究[39]在異辛烷中用直接酯化法探究了反應(yīng)時(shí)間、脂肪酶的用量、底物摩爾比對(duì)合成膽固醇癸二酸單烯酯的影響,結(jié)果該實(shí)驗(yàn)的平均酯化率與響應(yīng)面擬合方程酯化率的預(yù)估值較吻合,表明直接酯化法工藝反應(yīng)時(shí)間短,合成條件簡(jiǎn)單,取得了理想的結(jié)果。姜洋等[40]在傳統(tǒng)的直接酯化法上,改變不同環(huán)境介質(zhì)體系,將辛酸、癸酸和甘油等物料混合,用 Novozyme435 脂肪酶制備中碳鏈TAG,研究所得的中碳鏈TAG的產(chǎn)率為 95.1%,酯化率為 98.62%。結(jié)果表明,該制備工藝不僅有效提高了脂肪酸的利用率及中碳鏈TAG的產(chǎn)率,而且所得酯化產(chǎn)物色澤比較淺。由此可見(jiàn),直接酯化法可一步完成,且反應(yīng)時(shí)間較短,酶反應(yīng)器利用率高,生成的副產(chǎn)物少,產(chǎn)物純度高,易分離純化出產(chǎn)品。但是,直接酯化法在反應(yīng)過(guò)程中的酯化反應(yīng)均為一次性完成,因此反應(yīng)過(guò)程中需要及時(shí)脫水,水量的不斷增加會(huì)加厚酶分子表面的水膜,會(huì)阻礙底物與酶活性部位的結(jié)合,致使產(chǎn)率降低。因此,在sn-2位長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)脂直接酯化法反應(yīng)中要隨時(shí)除去水分,以防止逆向水解反應(yīng)降低結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的產(chǎn)率。
脂肪酶(lipase),又稱(chēng)甘油三酯水解酶,是由以甘露糖為主的親水糖基部分和以蛋白質(zhì)為主體的疏水部分組成,其活性中心靠近分子的蛋白質(zhì)部分。脂肪酶的來(lái)源很多,商業(yè)用途脂肪酶主要來(lái)源于微生物、植物和動(dòng)物源性。其中,微生物脂肪酶大多屬于依賴(lài)于由 Ser、His 和 Asp 殘基形成的催化三聯(lián)體的α/β脂解酶,熱穩(wěn)定性好,催化過(guò)程中無(wú)需輔酶,應(yīng)用范圍較廣。盡管脂肪酶用于酶解合成結(jié)構(gòu)脂,并作為生物催化劑用于TAG的水解和酯化,但是在酶法合成結(jié)構(gòu)脂反應(yīng)中,并不是所有的脂肪酶都具有?;恢眠x擇性,大多數(shù)脂肪酶水解TAG的?;恢靡簿哂须S機(jī)性,只有一部分特異性脂肪酶(如sn-1,3脂肪酶)在接近室溫和常壓條件下才會(huì)在甘油三酯的某個(gè)?;稽c(diǎn)發(fā)揮定點(diǎn)催化作用。
盡管來(lái)自微生物源的商業(yè)固定化脂肪酶已廣泛用于結(jié)構(gòu)脂的制備,但因?yàn)槠鋬r(jià)格昂貴,限制了某些工藝和產(chǎn)品難以工業(yè)化生產(chǎn)[41]。相對(duì)于化學(xué)反應(yīng)來(lái)說(shuō),酶法合成結(jié)構(gòu)脂的優(yōu)點(diǎn)是操作溫度較低,熱降解最小,且可得到理想的反應(yīng)產(chǎn)物。盡管如此,受反應(yīng)條件的制約,還是有諸多因素會(huì)影響酶法合成結(jié)構(gòu)脂,這些因素包括:酶的種類(lèi)、酰基供體種類(lèi)、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、水分活度、酶量及底物比例等[42]。在眾多影響因素中,酶的種類(lèi)對(duì)結(jié)構(gòu)脂合成類(lèi)別尤為重要,是結(jié)構(gòu)脂合成的主要限制性條件之一。因此,脂肪酶的活性、穩(wěn)定性、重復(fù)利用次數(shù)、成本和可得到性等因素也決定著酶催化結(jié)構(gòu)脂工業(yè)化生產(chǎn)的可行性。
脂肪酶對(duì)結(jié)構(gòu)脂位置及酰基種類(lèi)的特異選擇性與脂肪酶來(lái)源、脂肪酶結(jié)合位點(diǎn)、界面處物理化學(xué)狀態(tài)以及底物結(jié)構(gòu)特征有較大關(guān)系。根據(jù)反應(yīng)特異性類(lèi)型,長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)脂脂肪酶大致可以分為三類(lèi):第一類(lèi)脂肪酶催化時(shí)具有位置或區(qū)域選擇性,這類(lèi)脂肪酶會(huì)定向?qū)R凰釺AG中sn-1和/或sn-3的?;B接位置,使反應(yīng)環(huán)境中較多的脂肪酸優(yōu)先連接在TAG的sn-1和/或sn-3位置上。由于空間位阻及催化活性效應(yīng),這類(lèi)脂肪酶對(duì)sn-2位酰基連接位點(diǎn)不產(chǎn)生催化連接作用,因此適用于選擇sn-1和/或sn-3的?;铣傻腡AG。位置專(zhuān)一性由脂肪酶種類(lèi)和底物濃度所決定。LIN等[43]研究證實(shí),使用sn-1,3特異性脂肪酶催化甘油和sn-2位不飽和脂肪酸含量高的甘三酯的酯交換,可以降低甘油三酯整體的飽和程度,提高不飽和脂肪酸的在甘油三酯的相對(duì)含量。第二類(lèi)脂肪酶由于自身結(jié)合位點(diǎn)的局限性,能夠有效識(shí)別TAG的sn-1和sn-3酰基結(jié)合位置,其水解這兩類(lèi)酯鍵的速度存在較大差異。立體專(zhuān)一性由脂肪酶來(lái)源,底物濃度和TAG連接的?;鶝Q定。HE等[44]分別使用Novozym 435, Lipozyme 435, Lipozyme TL-IM和Lipozyme RM IM四種sn-1,3特異性脂肪酶催化微藻油與PUFA酸解合成出富含PUFA的母乳模擬結(jié)構(gòu)脂,結(jié)果表明,盡管4種特異性脂肪酶催化效果存在差異,但其均能夠較好實(shí)現(xiàn)對(duì)sn-1,3?;坏挠行ёR(shí)別。第三類(lèi)脂肪酶能夠有效識(shí)別脂肪酸種類(lèi)。對(duì)于不飽和脂肪酸、長(zhǎng)碳鏈脂肪酸、中碳鏈脂肪酸以及短碳鏈脂肪酸具有差別化的催化能力。胰脂肪酶對(duì)短鏈脂肪酸具有專(zhuān)一性作用,Lipozyme TL IM則對(duì)中長(zhǎng)鏈脂肪酸具有特異選擇性。
表2 常用的商業(yè)化結(jié)構(gòu)脂固定脂肪酶Table 2 Common commercial lipid-immobilized lipase
脂肪酶是一種活性蛋白質(zhì),其催化作用受溫度的影響較大,提高溫度可以增加酶促反應(yīng)的速度。大多數(shù)sn-2位長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)脂脂肪酶的最佳溫度為30~60 ℃,在此溫度范圍,脂肪酶活性最強(qiáng),酶促反應(yīng)速度最大。當(dāng)溫度每升高10 ℃時(shí)反應(yīng)速度加快一倍左右,溫度繼續(xù)升高后,高溫則會(huì)破壞脂肪酶分子的二硫鍵,導(dǎo)致肽鍵水解、天門(mén)冬氨酸和谷氨酰胺殘基的脫氨反應(yīng),進(jìn)而降低脂肪酶在反應(yīng)體系中的穩(wěn)定性、親和力和競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)優(yōu)勢(shì),最終導(dǎo)致sn-2位長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)脂脂肪酶失活。一般而言,動(dòng)物和植物來(lái)源脂肪酶通常比胞外微生物來(lái)源脂肪酶的熱穩(wěn)定差。在酯交換反應(yīng)中所用的最佳溫度選擇主要是考慮對(duì)原料性質(zhì)及反應(yīng)體系的影響。無(wú)溶劑體系中,溫度必須保持足夠高以保持底物的液體狀態(tài),在某些情況下溫度必須超過(guò)一定溫度才能使底物液化,此時(shí)熱穩(wěn)定性更強(qiáng)的脂肪酶才能發(fā)揮催化作用,因此,有/無(wú)溶劑體系是結(jié)構(gòu)脂合成反應(yīng)選擇脂肪酶的重要考量之一。
一般情況下,催化反應(yīng)中反應(yīng)速率與脂肪酶濃度成正比關(guān)系,即酶濃度越高,催化反應(yīng)速率越快。但這種量效線(xiàn)性關(guān)系僅在一定范圍內(nèi)是成立的,反應(yīng)速率不會(huì)由于酶濃度的持續(xù)升高而無(wú)休止的增加。KADIVAR等[48]研究發(fā)現(xiàn),隨著Lipozyme RM IM脂肪酶加入量的增加,油酸在甘油三酯中sn-2位的插入率有顯著提高,當(dāng)脂肪酶添加量超過(guò)底物質(zhì)量的10%時(shí),產(chǎn)物的得率不再發(fā)生明顯變化。究其原因是由于脂肪酶量的增加會(huì)加快反應(yīng)速度,與此同時(shí)油脂副水解反應(yīng)也會(huì)相應(yīng)加速。隨著脂肪酶催化作用的增強(qiáng),水解作用會(huì)逐步減少酶對(duì)底物的酶解作用。此外,由于具有特異性脂肪酶的來(lái)源途徑比較單一,制備成本較高,因此脂肪酶的作用效率與產(chǎn)物的生產(chǎn)成本密切相關(guān),這兩者均決定了結(jié)構(gòu)脂在合成過(guò)程中對(duì)脂肪酶的需求量水平。
盡管底物濃度對(duì)酶的活性不產(chǎn)生影響,但底物濃度和底物分子構(gòu)型卻能通過(guò)增加底物和酶接觸面積從而影響脂肪酶催化酯交換的速率。當(dāng)?shù)孜餄舛炔粩嘣黾?,酶促反?yīng)速率也會(huì)逐漸加快,達(dá)到某一值后酶促反應(yīng)不再隨著底物濃度的增加而增加。有研究證實(shí)[46],低底物摩爾比較高底物摩爾比需要更長(zhǎng)的催化反應(yīng)時(shí)間,后者的反應(yīng)平衡會(huì)更容易向產(chǎn)物生成的方向進(jìn)行移動(dòng),此時(shí)酰基與甘油碳鏈的結(jié)合比率也會(huì)有所提高。此外,反應(yīng)過(guò)程中間產(chǎn)物(例如水)也會(huì)影響脂肪酶對(duì)結(jié)構(gòu)脂的催化效果。在脂肪酶催化酯化反應(yīng)中,反應(yīng)的本質(zhì)是酯化和水解反應(yīng)的結(jié)合。隨著酯化過(guò)程的深入,反應(yīng)中的水會(huì)逐步增加,當(dāng)水含量過(guò)高時(shí),則會(huì)誘導(dǎo)脂肪酶對(duì)TAG的水解反應(yīng),為了增加酯化反應(yīng)減少水解,獲得高產(chǎn)率的產(chǎn)物,在反應(yīng)過(guò)程中不斷地去除水分是很重要的。然而,在系統(tǒng)中保持一定的水分是很重要的,因?yàn)橹久冈诜枪矁r(jià)反應(yīng)中的動(dòng)力學(xué)行為需要水來(lái)維持。另一方面,有水存在的環(huán)境會(huì)阻礙脂肪酶的整體構(gòu)象移動(dòng)從而限制脂肪酶催化作用的發(fā)揮。因此,水解和酯化之間的底物之間的平衡關(guān)系對(duì)脂肪酶發(fā)揮催化作用十分關(guān)鍵[49]。
相比一步酶法和三步酶法而言,兩步酶法是一種形成的副產(chǎn)物相對(duì)較少的理想方法,這種方法能夠很好地利用sn-1,3特異性脂肪酶酶解天然油脂,生成2-MAG,再通過(guò)脂肪酶催化純化的2-MAG和中鏈脂肪酸酯化得到純MLM型結(jié)構(gòu)脂。在天然甘油三酯的所有組成類(lèi)型中,當(dāng)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸位于sn-2位置時(shí)其吸收效果要優(yōu)于位于sn-1,3位置或隨機(jī)分布狀態(tài)。因此,今后有必要開(kāi)展將DHA、ALA等n-3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸通過(guò)兩步酶法接入甘三酯的sn-2位合成sn-2長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)脂的相關(guān)研究。此外,由于脂肪酶醇解法獲得的TAG副產(chǎn)物較少且易分離,目標(biāo)產(chǎn)物不飽和脂肪酸TAG的純度和產(chǎn)量也較高,因此是未來(lái)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)脂合成路線(xiàn)中極具潛力的綠色高效方法。