都蕓，王開宇，左惠君，邱怡筠，張露月

(煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，山東 煙臺，264000)

氰化物是一種劇毒物質，在所有的氰化物中，氰化氫的毒性最大，CN-能夠抑制細胞色素C氧化酶的活性，阻斷呼吸鏈使組織缺氧，進而產(chǎn)生乳酸等大量酸性物質，最終導致代謝性酸中毒從而引起一系列神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[1]。白酒中氰化物的主要來源與其制作原料有關，如木薯、豆類、高粱等食物中都有氰苷的存在。食用植物中的氰化物多以氰苷配糖體形式存在，其種類有苦杏仁氰苷、亞麻氰苷、棉豆氰苷等[2]，氰苷在發(fā)酵過程中水解產(chǎn)生HCN。因此，氰化物是酒類的一項重要監(jiān)測指標，其檢測結果的準確性對白酒質量安全有重要意義。

目前，白酒中氰化物的檢測方法有化學分析法、分光光度法、色譜法、原子吸收法[3]。而GB 5009.36—2016食品安全國家標準 食品中氰化物的測定中規(guī)定了2種定量方法(分光光度法、氣相色譜法)和1種定性方法，本文根據(jù)白酒氰化物的判定標準GB 2757—2012食品安全國家標準 蒸餾酒及其配制酒對GB 5009.36—2016第一法分光光度法測量白酒中氰化物方法進行了系統(tǒng)、完整的不確定度評定，分析整個實驗過程中的不確定度來源，并分別進行計算，通過各個分量在整體不確定度中的占比，分析其對最終檢測結果的影響，為調整實驗過程進行指導，有效減少實驗結果的誤差，確保測量結果的準確度。

1 材料與方法

1.1 方法依據(jù)

測量依據(jù)GB 5009.36—2016 食品安全國家標準 食品中氰化物的測定中第一法分光光度法[4]，在堿性條件下加熱除去高沸點有機物，然后在pH=7.0條件下，CN-與氯胺-T反應生成CICN，CICN再與異煙酸作用，水解后生成戊烯二醛，最后與吡唑酮縮合成藍色染料[5]，與標準系列比較定量。該標準未規(guī)定測定時樣品的溫度，參照GB 5009.225—2016 食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定[6]中的要求，統(tǒng)一規(guī)定為在20 ℃下樣品中氰化物的含量。

1.2 試劑與儀器

白酒樣品使用45%vol優(yōu)級濃香型白酒；實驗室環(huán)境溫度(20±2) ℃。水中氰成分分析標準物質(標準物質編號GBW(E)080115)，ρ(CN-)=50.0 μg/mL，相對擴展不確定度Ur=1%。

Cary 60 UV—Vis紫外可見分光光度計，安捷倫科技有限公司；SCG-4恒溫水浴鍋(精密度0.1 ℃)，寧波新型生物。具塞比色管(10 mL)；單標吸量管(2 mL)；流出式分度吸量管(1、2 mL)；容量瓶(100 mL)(A級)。

1.3 測定方法

1.3.1 標準使用溶液配制

取2 mL水中氰成分分析標準物質，用2 g/L NaOH溶液定容至100 mL容量瓶中，標準使用溶液質量濃度為1.00 μg /mL。

1.3.2 標準溶液系列配制

用分度吸量管分別吸取1.00 μg/mL標準使用溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL于10 mL具塞比色管中，加2 g/L NaOH至5 mL。

1.3.3 樣品處理

吸取1.0 mL試樣于50 mL燒杯中，加入5 mL 2 g/L NaOH溶液，混勻后放置10 min，然后放于120 ℃電加熱板上加熱至溶液剩余約1 mL，取下放至室溫，用2 g/L NaOH溶液轉移至10 mL具塞比色管中，最后加2 g/L NaOH至5 mL。

1.3.4 顯色測定過程

于試樣及標準管中分別加入2滴酚酞指示劑，加入體積分數(shù)為4%的乙酸溶液調至紅色褪去，再用2 g/L NaOH溶液調至近紅色，然后加2 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.5 mol/L，pH=7.0)，放入25～30 ℃水浴中10 min，再加入0.2 mL氯胺-T溶液(10 g/L)，搖勻放置3 min，加入2 mL異煙酸-吡唑啉酮溶液(異煙酸溶液Ⅰ：稱取1.5 g異煙酸溶于24 mL 20 g/L NaOH溶液中，加水至100 mL；吡唑啉酮溶液Ⅱ：稱取0.25 g吡唑啉酮，溶于20 mL無水乙醇中。使用時將溶液Ⅰ、Ⅱ按體積比5 ∶1混合[7])，加水稀釋至刻度，加塞振蕩混合均勻，在37 ℃恒溫水浴鍋中放置40 min，取出冷卻至室溫。用1 cm 比色皿以空白管調節(jié)零點，于638 nm處測量吸光度。標準系列各點及樣品溶液分別測量3次。

1.4 樣品測量數(shù)據(jù)及計算結果

樣品測量數(shù)據(jù)及測量結果如表1所示。

表1 樣品測量數(shù)據(jù)及測量結果Table 1 Sample measurement data and measurement results

2 數(shù)學模型建立及測量不確定度來源分析

2.1 白酒氰化物計算

根據(jù)白酒氰化物的判定標準GB 2757—2012食品安全國家標準 蒸餾酒及其配制酒中氰化物(以HCN計)質量濃度≤8.0 mg/L，且按酒精度100%vol折算[8]，將GB 5009.36—2016中計算修改為公式(1)：

(1)

式中：X，白酒樣品中氰化物質量濃度(以HCN計)(按酒精度100%vol折算)，mg/L；c，樣品溶液中氰根的質量，μg；V，樣品體積，mL；27.0，HCN摩爾質量的數(shù)值，g/mol；26.0，CN-摩爾質量的數(shù)值，g/mol；100，換算為酒精度100%vol，%vol；E，白酒樣品實際酒精度，%vol；R，回收率，%。

2.2 測量不確定度來源分析

分光光度計檢測溶液的吸光度與溶液中目標物的濃度成正比，因此顯色液的定容體積也是測量不確定度的一個分量，將其合并至標準溶液系列和樣品溶液質量含量的不確定度評定中，標準溶液和樣品溶液濃度不確定度模型如公式(2)、公式(3)所示：

c標=f(c1，V3，V4)

(2)

c=f′(c標，c擬，V2)

(3)

式中：c1， 氰標準使用液濃度；V3，吸取氰標準使用液的體積；V4，標準溶液系列的定容體積；c擬，標準溶液系列曲線擬合；V2，樣品溶液顯色定容體積。

因此樣品不確定度的測量模型如公式(4)所示：

X=F(c，V1，MHCN，MCN-，E，R)

(4)

式中：c，樣品溶液中氰化物的質量，μg；V1，樣品取樣體積，mL；MHCN，HCN摩爾質量的數(shù)值，g/mol；MCN-，CN-摩爾質量的數(shù)值，g/mol；E，白酒樣品實際酒精度，45.2 %vol；R，回收率，%。

根據(jù)測量模型，將模型中樣品溶液中氰化物質量的不確定度分量按照JJF1059.1—2012 測量不確定度評定與表示[9]要求展開，分光光度法測量白酒中氰化物含量的不確定度因果分析如圖1所示。

圖1 氰化物測定不確定度來源Fig.1 A graphical representation of the source of uncertainty in cyanide determination

3 測量不確定度評定

3.1 評定A類不確定度

A類不確定度就是測量重復性的不確定度，等于測量結果平均值的標準偏差[10]。6次測量結果的標準偏差、測量平均值的標準偏差、相對不確定度為：

3.2 評定樣品吸取體積的不確定度u(V1)

3.2.1 單標吸量管容量引入的不確定度u1(V1)

3.2.2 溫度波動對單標吸量管引入的不確定度u2(V1)

45%vol白酒的體積膨脹系數(shù)根據(jù)《新編酒精密度濃度和溫度常數(shù)數(shù)據(jù)表》[12]中表Ⅱ“酒精溶液密度與溫度和體積濃度關系表”， 45%vol酒精在20 ℃附近的密度如表2所示。

表2 45%vol酒精在不同溫度下的密度Table 2 Density of 45%vol alcohol at different temperatures

3.2.3 取樣體積不確定度u(V1)的合成

容量允差和溫度對取樣體積產(chǎn)生的不確定度是互相獨立的，根據(jù)公式合成得到取樣體積的不確定度和相對不確定度為：

3.3 樣品溶液顯色定容體積的不確定度u(V2)

3.3.1 比色管容量允差引入的不確定度u1(V2)

3.3.2 溫度波動引入的不確定度

u(V2)=u1(V2)=0.057 7 mL

3.4 標準溶液系列配制引入的不確定度u(c標)

3.4.1 標準使用溶液配制引入的不確定度u(c1)

3.4.1.1 水中氰成分分析標準物質(儲備液)引入的不確定度u1(c1)

查證書得相對擴展不確定度為1%(k=2),相對不確定度為：

3.4.1.2 吸取標準物質(儲備液)引入的不確定度u2(c1)

比如說“東漢青釉雙系瓷壺”，只翻譯成了Double-lug Celadon Kettle，“東漢”卻沒有翻譯。關于文物的出土地大多沒有翻譯。出土地應該屬于提示性公示語，對于對象起到提示或者告知作用，應當翻譯，卻沒有翻譯。

3.4.1.3 定容體積引入的不確定度u3(c1)

3.4.1.4 標準使用溶液配制相對不確定度的合成

標準使用溶液配制相對不確定度為：

3.4.2 標準溶液系列配制引入的不確定度u(V標)

標準系列各個點的配制過程引入的不確定度主要由分度吸量管容量允差、比色管定容和溫度組成，而溫度在較短時間內(nèi)變化較小，故忽略溫度對其的影響。

表3 各濃度的不確定度及其分量計算結果Table 3 Uncertainty of each concentration and calculation results of its components

3.4.3 標準溶液系列配制不確定度的合成

按每個濃度相對不確定度算術平方和開方得到[15]不確定度為:

ur(c)=

3.5 擬合標準曲線引入的不確定度u(c擬)

標準溶液系列共6個濃度，每個濃度測量3次，得到線性方程為A=0.366 8m+0.003 65，R2=0.999 8，在測量范圍內(nèi)，吸光度值對CN-線性關系良好；每份樣品溶液測量3次，以吸光度平均值計算溶液中氰根質量。由表1可知樣品溶液氰根的平均質量為0.953 μg。標準溶液系列具體測量結果如表4所示。

表4 標準系列各點吸光度的測量值Table 4 measurement values of absorbance at each point in the standard series

樣品溶液由擬合曲線引入的不確定度[16]為:

標準曲線峰面積比的殘差計算為:

式中:Ai為標準溶液吸光度；M為標準溶液曲線點數(shù)，M=6；n為標準溶液每點測量次數(shù)，n=3。

擬合標準曲線引入的相對不確定度為：

3.6 白酒酒精度不確定度的評定u(E)

酒中酒精度測定的不確定度的來源主要有酒精度的測量重復性、容量瓶取樣和蒸餾后的定容體積、蒸餾液20 ℃下密度的測定、酒精度測量結果的修約，具體評定過程見《密度瓶法測量白酒中酒精度的不確定度評定》[17]，評定結果為酒精度45.2%vol，擴展不確定度u(E) =0.1%vol，相對不確定度為:

3.7 評定摩爾質量比值的不確定度u(M比)

表5 國際原子量數(shù)值及其標準不確定度Table 5 international atomic weight values and their standard uncertainties

M(H+)、M(CN-)的不確定度由原子量和數(shù)據(jù)修約2部分組成， H+、CN-修約為3位有效數(shù)字，其中M(CN-)的不確定度由C和N兩部分組成，不確定度計算結果如表6所示:

表6 M(H+)、M(CN-)不確定度計算結果Table 6 uncertainty calculation results of M(H+)、M(CN-)

不確定度和相對不確定度為：

0.001 11

3.8 加標回收率R的不確定度評定

加標試驗的具體過程：吸取水中氰成分分析標準物質溶液1.00 mL于100 mL容量瓶中，并用體積分數(shù)為45%的乙醇溶液定容，搖勻，即加標物質溶液濃度為0.5 μg/mL，后續(xù)測定過程同1.3，分別進行6次加標回收實驗，測定結果如表7所示。

表7 回收率試驗結果Table 7 Results of recovery rate test

3.8.1 平均回收率測量重復性引入的不確定度u(xs)

3.8.2 加標標準物質引入的不確定度u(xs)

加標標準物質引入的不確定度有水中氰成分分析標準物質(儲備液)、吸取標準溶液、定容體積，具體評定過程參考3.4.1。

水中氰成分分析標準物質(儲備液)、吸取標準溶液定容體積相對不確定度分別為：

加標標準物質引入的不確定度合成為：

3.8.4 回收率R顯著性檢驗

3.9 評定標準測量不確定度

根據(jù)評定過程可知，氰化物測量重復性、樣品的取樣體積、樣品的定容體積、標準溶液系列、標準曲線擬合、酒精度折算及摩爾質量這7部分互相獨立，因此合成相對不確定為：

=0.013 7

4 擴展不確定度及不確定度報告

取包含因子k=2，U=k×ur×X=2×0.013 7×2.19=0.06 mg/L,白酒中氰化物報告：X=(2.19±0.06)mg/L，k=2，各類相對不確定度主要分量及貢獻如表8及圖2所示。

5 結論

通過對白酒氰化物分光光度檢測方法不確定度的評定，當測量結果為2.19 mg/L時，擴展不確定度為0.06 mg/L，通過此次評定,可以得出標準溶液系列配制引入的不確定度分量是該測量結果不確定度中占比最大的，因此在實驗過程中，對于標準溶液系列配制時要嚴格按照實驗要求規(guī)范操作，降低其引入的不確定度,確保檢測結果的準確性。

圖2 各類不確定度主要分量占比Fig.2 Schematic diagram of the proportion of major components of various uncertainties

表8 各類相對不確定度主要分量及貢獻Table 8 Major components and contributions of various relative uncertainties

注：-代表無