周文旭 譚湘淑 佘君

摘要：目的 ?觀察甲氨蝶呤（MTX）對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）大鼠滑膜細(xì)胞凋亡及細(xì)胞凋亡調(diào)控基因的影響，探討MTX的作用機(jī)制。方法 ?選擇SPF級(jí)雌性健康SD大鼠40只，每只大鼠尾根部皮下多點(diǎn)注射Ⅱ型膠原蛋白0.2 mg，造模后l0 d將動(dòng)物隨機(jī)分為假模型組、模型組，高（30 mg/kg）、中（3 mg/kg）、低（0.3 mg/kg）給藥組，各8只。給藥組每組按10 ml/kg MTX灌胃，假模型組、模型組給予等量生理鹽水灌胃。分離培養(yǎng)大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，WB技術(shù)檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 ?高、中、低劑量給藥組抑制大鼠足腫脹的作用均優(yōu)于模型組（P<0.05），且呈劑量依賴性;各組均能不同程度誘導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞凋亡，高劑量給藥組與模型組及假模型組比較，誘導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞凋亡更明顯（P<0.05）;高劑量給藥組Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達(dá)量與模型組比較明顯上調(diào)，Bc1-2蛋白表達(dá)量下降（P<0.05）。結(jié)論 ?MTX誘導(dǎo)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Caspase-3、Caspase-9與Bax表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕;甲氨蝶呤;細(xì)胞凋亡;滑膜;大鼠;Bcl-2;Caspase-3

中圖分類號(hào)：R593.22 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.05.021

文章編號(hào)：1006-1959（2020）05-0071-03

Abstract：Objective ?To observe the effects of methotrexate （MTX） on the apoptosis of synovial cells and apoptosis-regulating genes in rats with rheumatoid arthritis （RA）， and to explore the mechanism of action of MTX. Methods ?40 SPF female healthy SD rats were selected. Each rat was injected subcutaneously with 0.2mg of type Ⅱ collagen at the subcutaneous point.On the 10th d after modeling， the animals were randomly divided into a sham model group， a model group， a high （30 mg/kg）， a medium （3 mg/kg）， and a low （0.3 mg/kg） administration group.Each group consisted of 8 rats. Each dose group was administrated with 10 ml/kg MTX. The sham model group and model group were given the same amount of normal saline. The knee synovial tissue of rats was isolated and cultured， and the apoptosis rate was detected by flow cytometry， and the expression of Caspase-3， Caspase-9， Bax， Bcl-2 was detected by WB technology. Results ?The high， medium and low dose groups were better than the model group in inhibiting the swelling of the rats' feet，the difference was statistically significant （P<0.05） and was dose-dependent; each group could induce RA synovial cells to varying degrees Apoptosis， compared with the model group and the pseudo-model group， the high-dose administration group induced apoptosis of RA synovial cells more significantly （P<0.05）; the high-dose administration group expressed Caspase-3， Caspase-9， and Bax proteins with The model group was significantly up-regulated， and the expression of Bc1-2 protein decreased （P<0.05）. Conclusion ?MTX induces apoptosis of synovial cells in rheumatoid arthritis rats. The mechanism may be related to down-regulating Bcl-2 expression， up-regulating Caspase-3， Caspase-9 and Bax expression.

Key words：Arthritis， rheumatoid;Methotrexate;Apoptosis;Synovial membrane;Rat;Bcl-2;Caspase-3

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種臨床常見的以侵犯關(guān)節(jié)滑膜、軟骨及骨為主的自身免疫病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病變過程涉及多種細(xì)胞和細(xì)胞因子，位于關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)層的成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）在RA病變中異?；罨?，是介導(dǎo)關(guān)節(jié)局部炎癥的關(guān)鍵細(xì)胞之一。研究表明[1]，RA的關(guān)節(jié)軟骨和骨組織損害，與滑膜細(xì)胞的過度增生活化與凋亡不足密切相關(guān)。因此，抑制炎性滑膜組織增生及誘導(dǎo)滑膜組織中各種細(xì)胞凋亡是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的靶點(diǎn)[2，3]。甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）是傳統(tǒng)的改善病情抗風(fēng)濕藥（DMARDs），近20多年來已成為RA臨床治療的基石用藥（Anchor drug）[4]，但其治療RA的作用機(jī)制尚不明確。本研究采用CIA模型，觀察MTX對(duì)大鼠整體療效及對(duì)滑膜組織中Bcl-2、Bax、caspase-3、9蛋白的表達(dá)影響，探討MTX治療RA的作用機(jī)制，以期為尋找新的抗RA藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ?本實(shí)驗(yàn)方案已通過西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)審查同意，審批許可號(hào)為XJMU2018032。SPF級(jí)雌性健康SD大鼠40只，體重50～100 g，體重（120±20 g），鼠齡4～5周，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物制品研究所提供。實(shí)驗(yàn)開始前 ? ? 1周進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，保持室內(nèi)22℃，自由攝食。

1.2藥品與試劑 ?酸可溶性Ⅱ型膠原蛋白（CⅡ）與弗氏不完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品，MTX片（通化茂祥制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H22022674，規(guī)格：2.5 mg×100片），Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2和GAPDH抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗大鼠IgG購自碧云天生物技術(shù)有限公司。Trizol購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司;熒光定量試劑購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。引物由Invitrogen公司合成。藥物均研磨成粉末，用生理鹽水制成所需濃度。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物造模與分組 ?選取SPF級(jí)雌性健康SD大鼠40只，用0.l mmol/L醋酸溶解Ⅱ型膠原蛋白 ? ?（2 mg/ml，4℃，過夜），再與等量弗氏完全佐劑混合，于冰浴中充分乳化，除正常組外每只大鼠尾根部皮下多點(diǎn)注射膠原蛋白0.2 mg。造模后10 d將動(dòng)物隨機(jī)分為假模型組、模型組，高、中、低給藥組，各8只。各組給藥（MTX）量如下：高劑量給藥組30 mg/kg，中劑量給藥組3 mg/kg，低劑量給藥組0.3 mg/kg，按10 ml/kg量灌胃，1次/d。假模型組、模型組給予等量生理鹽水灌胃，1.0 g/kg，1次/d。各組給藥頻次按照藥物的臨床用藥規(guī)格，連續(xù)用藥30 d。分別于致炎后第14、16、18、20、24、28天用毛細(xì)管放大測(cè)量法測(cè)右后足體積，求出腫脹增長百分率=[（給藥后值-給藥前值）/給藥前值]×100%。分別于造模前、造模后每天觀察大鼠體毛的色澤改變、神志及活動(dòng)狀態(tài)、局部炎癥紅腫及全身遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)等，并每周測(cè)1次體重。

1.3.2滑膜細(xì)胞分離培養(yǎng) ?各組大鼠末次給藥后24 h，無菌操作取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，剪成1 mm3大小后加4 m1 0.4 mg/ml的Ⅱ型膠原酶（溶于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基），于5% CO2條件下孵育3 h，離心收集未貼壁的細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于含有15%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用第2～4代細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)時(shí)用含15%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液將滑膜細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1×106個(gè)/ml細(xì)胞加入6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔2 ml，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 ?取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按細(xì)胞濃度為2×105/ml，每孔接種1 ml于6孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h后，吸棄殘余培養(yǎng)基，根據(jù)動(dòng)物造模結(jié)果選取大鼠足腫脹抑制作用最有效的藥物濃度組（3 mg/kg MTX），與未給藥的模型組共3個(gè)組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸棄上清液，PBS洗滌2次，胰酶消化收集細(xì)胞，重懸于離心管中，室溫下2000 r/min離心5 min。用Loading Buffer懸浮細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，向懸液中加入5 μl AnnexinV FITC和10 μl碘化丙啶（PI），混勻。室溫避光孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，重復(fù)3次。

1.3.4 Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)測(cè)定 ?提取細(xì)胞總蛋白，然后取蛋白質(zhì)樣品50 μg加上樣緩沖液煮沸變性后，進(jìn)行10% SDS PAGE;電轉(zhuǎn)移至PVDF膜;用含5%脫脂奶粉的TBS（pH 8.0）封閉2 h;分別加入適量Bc1-2、Bax 鼠單抗IgG （1∶400）、Caspase-3兔多抗IgG（1∶400），搖床上室溫反應(yīng)2 h，洗膜3次，20 min/次;加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶6000），室溫反應(yīng)2 h;洗膜后作ECL化學(xué)發(fā)光，X光顯影。圖像經(jīng)掃描儀掃描后，用圖像分析軟件Band Scan 5.0進(jìn)行吸收度積分值分析，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參照GAPDH蛋白表達(dá)量的吸收度積分值之比作為目的蛋白表達(dá)量的相對(duì)含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ?本研究全部數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以（x±s）表示，進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 MTX對(duì)Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)大鼠足腫脹的抑制作用 ?與模型組比較，MTX抑制大鼠足腫脹的作用呈劑量依賴性，模型的足腫脹度越高，MTX的抑制作用越強(qiáng)，藥物在致炎后28 d左右抑制作用達(dá)到峰值，見圖1。其中，以高劑量給藥組最為明顯（P<0.05），與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 MTX對(duì)RA滑膜細(xì)胞凋亡的影響 ?流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組凋亡細(xì)胞結(jié)果見圖2，以右上和右下象限為凋亡細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)各組凋亡細(xì)胞百分率。各組均能不同程度誘導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞凋亡，以高劑量給藥組的作用最明顯。與模型組及假模型組比較，高劑量給藥組明顯誘導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞凋亡（P<0.05）。

2.3對(duì)大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響 ?高劑量給藥組的Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達(dá)量與模型組比較明顯上調(diào)，Bc1-2蛋白表達(dá)量下降（P<0.01），見圖3。

3討論

RA是一種病變累及周圍關(guān)節(jié)的多系統(tǒng)性炎癥性的自身免疫病，主要表現(xiàn)為慢性、對(duì)稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變，若未早期診治，在發(fā)病兩年內(nèi)即可出現(xiàn)不可逆的骨關(guān)節(jié)破壞，造成關(guān)節(jié)畸形及功能喪失，最終殘疾[5]。研究表明[1]，RA的關(guān)節(jié)軟骨和骨組織損害與滑膜細(xì)胞過度增生活化及凋亡不足密切相關(guān)。因此，抑制自身免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖及促進(jìn)該免疫反應(yīng)的細(xì)胞凋亡，阻止關(guān)節(jié)滑膜中炎性細(xì)胞的浸潤可減輕關(guān)節(jié)炎病變，是治療該病的重要途徑。

MTX是目前公認(rèn)的有效治療RA的免疫抑制劑，其通過對(duì)腺苷誘導(dǎo)的免疫抑制作用、對(duì)炎性細(xì)胞增殖和凋亡的影響及對(duì)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞因子及其抑制因子的作用等，降低滑膜組織金屬蛋白酶水平，發(fā)揮抗炎及免疫抑制作用[6，7]。許多RA患者單用MTX即可使炎癥緩解，疾病活動(dòng)性得到明顯的控制，且單藥治療除了極高的衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)價(jià)值外，還有相當(dāng)好的安全性。有研究對(duì)服用MTX的RA患者的長期隨訪研究發(fā)現(xiàn)患者的關(guān)節(jié)腫痛晨僵血沉及C-反應(yīng)蛋白的指標(biāo)在6個(gè)月左右開始顯著改善。本研究中CIA大鼠造模后關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯腫脹，以后肢最為明顯，在第28天達(dá)到了高峰。治療后，高劑量治療組肢體炎癥的腫脹程度與模型組相比均有改善。結(jié)果表明MTX的應(yīng)用對(duì)局部關(guān)節(jié)炎癥均有明顯控制作用，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[8]。

本研究中給藥組滑膜細(xì)胞的凋亡幅度明顯上升，與模型組差異顯著，模型組大鼠滑膜組織的Bcl-2表達(dá)增加，而Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達(dá)下降，提示滑膜細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)異常，導(dǎo)致細(xì)胞增生與凋亡的不平衡，引起滑膜細(xì)胞增生。而MTX可以使從大鼠滑膜細(xì)胞Bc1-2表達(dá)減少，Caspase-3、Caspase-9、Bax表達(dá)明顯升高。提示MTX可能通過調(diào)控Bcl-2和Bax等凋亡相關(guān)基因，并誘導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞Caspase-3、9活化，促進(jìn)滑膜細(xì)胞的凋亡，從而抑制關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的增殖，減輕滑膜增厚而發(fā)揮治療作用。

綜上所述，通過MTX對(duì)大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型滑膜細(xì)胞凋亡基因調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究，初步證明了MTX對(duì)RA滑膜細(xì)胞較強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡作用。MTX在誘導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制較為復(fù)雜，涉及體液、內(nèi)分泌、免疫網(wǎng)絡(luò)中的多種調(diào)節(jié)因子、多種轉(zhuǎn)錄、代謝調(diào)控因素，故還需從其他相關(guān)基因或蛋白表達(dá)方面做進(jìn)一步研究。

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收稿日期：2019-11-07;修回日期：2020-03-15

編輯/肖婷婷