解駿 李少華 凌蕓

摘要：目的 探討不同濃度自擬蠲痹補腎方對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)滑膜炎癥的影響機制，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。方法 Wistar大鼠32只隨機分為4組：空白對照組（滅菌用水灌胃）、自擬蠲痹補腎方高濃度組、自擬蠲痹補腎方低濃度組，雷公藤多苷片組。通過研究高低二個不同劑量的自擬蠲痹補腎方對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的患者滑膜成纖維細胞的影響，探討其可能的作用機制。結(jié)果 與空白對照血清相比，自擬蠲痹補腎方含藥血清均能顯著抑制滑膜成纖維細胞PCNA mRNA、Bcl-2 mRNA表達（P<0.0001）。結(jié)論 自擬蠲痹補腎方可能是通過調(diào)節(jié)滑膜成纖維細胞PCNA mRNA、Bcl-2 mRNA表達，抑制滑膜成纖維細胞增殖而發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;滑膜炎癥;成纖維細胞

中圖分類號：R593.22 ? 文獻標(biāo)志碼：A ? 文章編號：1007-2349（2020）02-0068-04

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA），在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率在1～3%左右，以慢性起病，最終累及全身多個系統(tǒng)的自身免疫性的病患，在我國，大約有四五百萬人受RA 的困擾，報道的致殘率可高達50%[1-2]。RA在起病的最初2-3年內(nèi)會發(fā)生不可逆的關(guān)節(jié)周圍的骨丟失，進而致關(guān)節(jié)毀損和全身性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。RA的臨床表現(xiàn)為慢性、進行性及對稱性四肢多關(guān)節(jié)的炎癥，隨著疾病的發(fā)展，會引起全身多個系統(tǒng)的損傷。RA關(guān)節(jié)內(nèi)的病理特征表現(xiàn)是慢性增生性炎癥和血管翳的形成，并破壞軟骨面、軟骨下骨的骨質(zhì)，以及關(guān)節(jié)周圍的軟組織等，因此會造成關(guān)節(jié)內(nèi)結(jié)構(gòu)的毀損，最終的臨床轉(zhuǎn)歸是關(guān)節(jié)功能喪失、外觀畸形以及關(guān)節(jié)局部和全身性骨量的丟失。目前公認RA的這些病理變化均與滑膜成纖維細胞的凋亡不足密切相關(guān)，而細胞凋亡不足是大多數(shù)的腫瘤和自身免疫系統(tǒng)疾病的一個重要病因[3]，因此，如果加速滑膜成纖維細胞的凋亡可以有效治療RA[4]。本次實驗選用我院自擬蠲痹補腎方作為研究對象，此方具有活血散瘀、消腫止痛、補腎強骨的功效，在本院臨床使用多年，得到了廣大醫(yī)生和患者的認可。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與滑膜組織 SPF級的雌性Wistar大鼠32只，體重為（200±10）g，購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2007 0005，動物使用許可證號為SYXK（滬）2008 0050。所有的患者的滑膜組織均來自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬光華醫(yī)院關(guān)節(jié)外科。所有的病例均為女性患者，年齡（53.27±6.11）歲，病程（8±13.85）a，診斷均符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要藥物 自擬蠲痹補腎方（方劑主要為骨碎補、白芍、仙靈脾、豨薟草、補骨脂、青風(fēng)藤、黃芪、絡(luò)石藤）。雷公藤多苷片，規(guī)格：10mg/粒，購自黃石飛云制藥有限公司，生產(chǎn)批號：20110301。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清的制備 32只大鼠隨機分為對照（滅菌用水）組、自擬蠲痹補腎方高濃度組、自擬蠲痹補腎方低濃度組，雷公藤多苷片組。滅菌用水組：滅菌用水3mL/只/天，分2次灌胃。自擬蠲痹補腎方組：主要以美國FDA提出的臨床等效劑量換算公式，以人的使用劑量為標(biāo)準(zhǔn)，得出大鼠的劑量，每只大鼠每天3mL，分兩次灌胃;雷公藤多苷片組3mL灌胃。連續(xù)用藥3天后，在第3天給藥后1 小時采血。選擇滅菌非抗凝劑的試管中，注射入所采的大鼠血液，室溫等待血液凝結(jié)。將所首先在37℃水溫浴1 小時，離心15分鐘（轉(zhuǎn)速：3000 轉(zhuǎn)/分鐘）分離血清，-20℃冰箱凍存?zhèn)溆?。在使用前，先?6℃恒溫箱內(nèi)30分鐘滅活，然后使用不帶血清的培養(yǎng)基稀釋，過濾后清除細菌。

1.2.2 原代滑膜細胞的分離培養(yǎng)與傳代 無菌條件下把滑膜組織置于盛有5%FBS DMEM 的15mL離心管中，并于2小時內(nèi)置入盛有DMEM培養(yǎng)液的無菌培養(yǎng)皿，清除滑膜組織表面的脂肪組織及血凝塊，清洗3次。將滑膜組織剪碎至1 mm3的小塊置于6 cm2培養(yǎng)皿中，加入4mL DMEM培養(yǎng)液，再加500 μL的Ⅰ型膠原酶（終濃度為3 mg/mL），再次放入37℃ 5%CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)消化4小時后，見絮狀樣的關(guān)節(jié)滑膜組織。用100目的濾網(wǎng)過濾，加PBS沖洗，濾液離心5分鐘（1500轉(zhuǎn)/分），去除上清液。打散細胞，加入15% FBS DMEM，置10 cm2培養(yǎng)皿中，37℃ 5%CO2 培養(yǎng)箱，待細胞密集度大于80%后，消化傳代培養(yǎng)，當(dāng)傳至第三代后，予以胰酶消化待用。

1.2.3 含藥血清對體外滑膜成纖維細胞增殖作用的影響 將濃度為2×103個/mL的第3代成骨細胞，以100 μL/孔種于96孔培養(yǎng)板，用2%胎牛血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h后，分為4組：（1）20%空白血清組;（2）20%自擬蠲痹補腎方高濃度含藥血清組;（3）20%自擬蠲痹補腎方低濃度含藥血清組;（4）20%雷公藤多苷片含藥血清組。每組8孔，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，棄100μl培養(yǎng)液后，每孔加入20μl的噻唑基四唑（MTT）溶液（5 mg/mL），37℃孵育4 h;棄上清，每孔加150μl二甲基亞砜（DMSO）溶解結(jié)晶，置酶聯(lián)免疫檢測儀上測定吸光值（波長490nm）。計算方法：細胞存活率%=（OD試驗孔/OD對照孔）×100%。

1.2.4 含藥血清對體外滑膜成纖維細胞的PCNA mRNA、Bcl-2 mRNA表達的影響 （1）取第3代成骨細胞，予以0.25%胰蛋白酶消化后，反復(fù)吹吸成為單細胞懸液;細胞濃度調(diào)整為2×104個/mL，接種于12孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1 mL，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h;吸凈孔板里的培養(yǎng)液，更換為l%胎牛血清培養(yǎng)液饑餓12 h;吸凈孔板里的培養(yǎng)液，再次更換為20%空白對照血清、20%自擬蠲痹補腎方高濃度含藥血清、20%自擬蠲痹補腎方低濃度含藥血清、20%雷公藤多苷片含藥血清組，每組3孔，再次予以培養(yǎng)24 h;（2）按Trizol法試劑說明書提取滑膜成纖維細胞RNA，取1μg總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;（3）引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1;（4）實時定量PCR：將熒光染料SYBR Green和目的基因Bcl-2以及內(nèi)參Actin的引物按5μl SYBR Green+0.15μl引物混勻，封膜后，放入實時PCR儀（ABI 7900）進行PCR反應(yīng)，測定出PCNA mRNA表達;Bcl-2基因表達的CT值，根據(jù)公式2-△CT計算基因的相對表達量。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS（24.0版本）軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布要求，按照均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，如果各治療組方差齊，采用LSD-t檢驗進行組間的兩兩比較;單獨2組樣本均數(shù)比較時，若方差齊，采用t檢驗，如果方差不齊，改用t′檢驗，P<0.05時有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 自擬蠲痹補腎方的含藥血清對于滑膜成纖維細胞的作用 如表2所示，與空白對照組比較，當(dāng)作用時間在48小時，5%、10%的自擬蠲痹補腎方含藥血清對滑膜成纖維細胞增殖均無差別;且不同濃度自擬蠲痹補腎方含藥血清對滑膜成纖維細胞增殖也未見差別;20%含藥血清作用時，高濃度的自擬蠲痹補腎方含藥血清可顯著抑制滑膜成纖維細胞增殖（P<0.001）。而表3所示，當(dāng)對比空白對照組，在20%含藥血清作用時，高、低濃度自擬蠲痹補腎方及雷公藤多苷片含藥血清均能顯著抑制滑膜成纖維細胞增殖（P<0.0001），但三組之間比較均無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 含藥血清對體外培養(yǎng)滑膜成纖維細胞 PCNA mRNA表達的影響 如表4所示，對比空白對照組，使用20%含藥血清干預(yù)時，高、低濃度自擬蠲痹補腎方及雷公藤多苷片含藥血清均顯示對于抑制滑膜成纖維細胞PCNA mRNA表達有顯著意義（P<0.0001），但高濃度的自擬蠲痹補腎方比低濃度更具有顯著意義（P=0.037<0.05）。

2.3 含藥血清對體外培養(yǎng)滑膜成纖維細胞 Bcl-2 mRNA表達的影響 與如表5所示，與空白對照血清相比，高、低濃度自擬蠲痹補腎方及雷公藤多苷片含藥血清均顯示對于抑制滑膜成纖維細胞Bcl-2 mRNA表達有顯著意義（P<0.0001），三組間均沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)論

自擬蠲痹補腎方可能通過調(diào)節(jié)PCNA與Bcl-2基因的表達，從而抑制滑膜成纖維細胞增殖，達到抑制炎癥與減少骨丟失的目的。

4 討論

文獻報道，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病變的關(guān)節(jié)內(nèi)可見滑膜明顯增生，而這些滑膜對關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥及關(guān)節(jié)破壞過程中起著重要意義[5-7]。原因在于滑膜成纖維細胞可能會分泌各種細胞因子等產(chǎn)物，如蛋白酶類、花生四烯酸代謝產(chǎn)物等等，最終這些炎癥因子引起了RA的臨床病理變化。因此，滑膜成纖維細胞的過度增殖導(dǎo)致的滑膜增生是RA重要的病理特征之一[8-9]。

目前認為滑膜細胞凋亡不足，炎性滑膜細胞數(shù)目成倍數(shù)的增生，是RA的重要變化。一般正常情況下，人體可以通過增加細胞凋亡，從而清除這些過多的細胞而保持動態(tài)平衡。但加入滑膜細胞凋亡不足，就會可導(dǎo)致滑膜組織增生并進而出現(xiàn)關(guān)節(jié)破壞的一系列病理改變，因此RA發(fā)病的主要機制就是滑膜成纖維細胞增生過多和凋亡不足。因此目前認為治療RA的重要途徑之一，就是抑制滑膜成纖維細胞增殖、誘導(dǎo)增加其凋亡[10-11]。而傳統(tǒng)的植物提取物中，雷公藤紅素[12]、姜黃素等[13]據(jù)報道可以誘導(dǎo)DNA損傷、細胞周期阻滯以及凋亡作用，因此其可以抑制滑膜成纖維細胞增殖，是治療RA重要藥物;但由于具有高毒性以及效果不明確的缺點限制了其使用。而中藥有效成分治療RA具有多靶點、多種途徑的特點，藥理活性比較廣泛，被認為有重要的研究價值;而化學(xué)合成藥及激酶抑制劑類等藥物已經(jīng)通過相關(guān)的臨床研究明確了在治療RA中的治療效果和相對可靠的安全性，但是其長期用藥的安全性仍有待觀察[14]。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）屬于中醫(yī)“痹癥”“歷節(jié)”范疇。古代醫(yī)家一般認為風(fēng)寒濕邪外侵是重要的外因。臨床上RA的發(fā)病多為內(nèi)外因相互共同作用的結(jié)果。隨著當(dāng)代醫(yī)學(xué)的持續(xù)進步，運用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究結(jié)果，闡明了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的可能發(fā)病機理?，F(xiàn)代醫(yī)家經(jīng)過繼承發(fā)展，認為RA的性質(zhì)為本虛標(biāo)實，肝腎脾虛為本，濕滯、瘀阻為標(biāo)。本方扶正逐邪，標(biāo)本兼顧、活血散瘀、消腫止痛，正切中RA本虛標(biāo)實，肝腎脾虛為本，濕滯、瘀阻為標(biāo)的病機，是治療痹癥的較好的方劑。

本次實驗主要分析了本院通用的自擬蠲痹補腎方的含藥血清對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖的影響。此次我們的實驗表明：高、低濃度的自擬蠲痹補腎方含藥血清均能顯著抑制滑膜成纖維細胞PCNA mRNA表達，且高濃度的自擬蠲痹補腎方比低濃度更顯著。

目前比較公認的具有調(diào)控細胞凋亡的基因家族之一就是Bcl-2基因家族及其相關(guān)蛋白Bcl-2，而目前研究表明它與細胞凋亡可能有關(guān)的基因之一。Bcl-2是重要的細胞凋亡調(diào)節(jié)基因，其通過抑制多種形式的細胞死亡，從而延長了細胞壽命，增加了細胞數(shù)目，并且增加遺傳物質(zhì)的突變率。高、低濃度的自擬蠲痹補腎方含藥血清均能顯著抑制滑膜成纖維細胞Bcl-2 mRNA表達。

本次采用中藥血清藥理學(xué)研究方法，通過觀察自擬蠲痹補腎方含藥血清對體外培養(yǎng)滑膜成纖維細胞增殖及凋亡的影響，我們研究結(jié)果顯示20%自擬蠲痹補腎方含藥血清的對于滑膜成纖維細胞，具有抑制增殖及促進凋亡的作用，而且實驗結(jié)表明高濃度的自擬蠲痹補腎方比低濃度的效果更明確。經(jīng)定量PCR檢驗進一步證實：自擬蠲痹補腎方的含藥血清使PCNA與Bcl-2表達顯著下降，表明它能顯著抑制滑膜成纖維細胞增殖，顯示了與MTT實驗的結(jié)果的一致性，這可能是自擬蠲痹補腎方含藥血清能夠下調(diào)滑膜成纖維細胞增殖可能的作用機制之一。該研究在細胞水平及分子水平上為自擬蠲痹補腎方用于臨床RA治療提供了有力的實驗依據(jù)，在開發(fā)治療RA的新型中藥復(fù)方中，可考慮多種藥物聯(lián)合應(yīng)用，從細胞分子水平、基因角度以及治療靶點入手，找出抗RA的高效治療藥物。

參考文獻：

[1]張乃崢.臨床風(fēng)濕病學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：118-140.

[2]American College of Rheumatology Subcommitee on Rheumatoid Atthritis Guiddines.Arthfitis Rheum[J].2002，46（2）：328～346.

[3]Bartok B，F(xiàn)irestein GS.Fibroblast-like synoviocytes：keyeffector cells in rheumatoid arthritis[J].Immunol Rev，2010，233（1）：233-255.

[4]王鳳杰，樊莎莎，陳顯兵，等.Lunasin對實驗性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜成纖維細胞增殖與凋亡的影響[J].IMMUNOLOGICAL JOURNAL，2016，2（32）：114-118.

[5]周振華，徐衛(wèi)東，吳岳嵩.滑膜成纖維細胞與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)研究的進展.中華關(guān)節(jié)外科雜志，2008，2（6）：52-55.

[6]Yamanishi Y，F(xiàn)irestein GS.Pathogenesis of rheumatoid arthritis：the role of synoviocytes[J].Rheum Dis Clin North Am，2001，27（2）：355-371.

[7]Fox DA，Gizinski A，Morgan R，et al.Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.Rheum Dis Clin North Am，2010，36（2）：311-323.

[8]黃學(xué)應(yīng)，陳飛虎，張曉明，等.重組人內(nèi)抑素對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細胞周期和PCNA表達的影響[J].中國藥理學(xué)通報，2009，25（5）：649-653.

[9]Nishioka K，Hasunuma T，Kato T，et al.Apoptosis in rheumatoid arthritis：a novel pathway in the regulation of synovial tissue[J].Arthritis Rheum，1998，41（1）：1-9.

[10]Pope RM.Apoptosis as a therapeutic tool in rheumatoidarthritis[J].Nat Rev Immunol，2002，2（7）：527-535.

[11]王鳳杰，樊莎莎，陳顯兵，等.Lunasin對實驗性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜成纖維細胞增殖與凋亡的影響[J].免疫學(xué)雜志，2016，32（2）：114-118.

[12]Xu Z，Wu G，Wei X，et al.Celastrol induced DNA damage，cell cycle arrest，and apoptosis in human rheumatoid fibroblast-like synovial cells[J].Am J Chin Med，2013，41（3）：615-628.

[13]邱艷，商瑋，趙智明，等.姜黃素對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜OPG和RANKL蛋白表達的影響[J].中國免疫學(xué)雜志，2014，30（11）：1490-1494.

[14]汪永忠，鄧龍飛，韓燕全，等.成纖維樣滑膜細胞原代培養(yǎng)及其在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療機制研究中的應(yīng)用進展[J]. 2016，27（7）：966-968.

（收稿日期：2019-10-18）