楊 佳，李新生，3 *，耿敬章，徐悅菱，劉智強(qiáng)，裴金金，3

（1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學(xué) 中國(guó)謝村北派黃酒研究院，陜西 漢中 723000；3.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，陜西 漢中 723000）

黃酒是中國(guó)最古老的酒種，同啤酒和葡萄酒并稱為世界三大古老酒種，享有“酒中之祖、酒中之王”的美譽(yù)。黃酒因其酒體柔和、香氣濃郁、酒味醇厚，加其豐富的營(yíng)養(yǎng)、獨(dú)特的風(fēng)味，受到廣大消費(fèi)者的喜愛。近年來(lái)，黃酒已被列入我國(guó)重點(diǎn)扶植和發(fā)展的酒精飲品之一[1]，但黃酒在生產(chǎn)加工、食品質(zhì)量安全控制方面，與現(xiàn)代化程度較高的啤酒和葡萄酒相比較，還有一定差距。1987年日本有關(guān)部門在檢測(cè)中國(guó)出口到日本的部分紹興黃酒中發(fā)現(xiàn)氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）的含量超標(biāo)（＞100 μg/L），并要求我國(guó)相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)采取措施進(jìn)行控制[2]。

氨基甲酸乙酯在一般食品中含量較低，而其在發(fā)酵食品（如面包、酸牛奶、乳酪、醬油等）和發(fā)酵酒精飲料（如葡萄酒、蘋果酒、啤酒、中國(guó)黃酒和日本清酒等）中屬伴隨的副產(chǎn)物[3]，含量相對(duì)較高，在食品質(zhì)量與安全方面屬潛在危害性成分。目前EC的含量已成為國(guó)際社會(huì)高度關(guān)注的發(fā)酵類食品安全熱點(diǎn)問(wèn)題之一，一些國(guó)家還規(guī)定了不同酒中EC最高限量。圍繞葡萄酒、日本清酒中EC產(chǎn)生的生物學(xué)基礎(chǔ)及代謝調(diào)控報(bào)道也較多，但關(guān)于我國(guó)傳統(tǒng)黃酒中EC的研究甚少。開展傳統(tǒng)黃酒釀造中EC形成的機(jī)制及控制技術(shù)研究，對(duì)我國(guó)傳統(tǒng)黃酒釀造的安全性具有非常重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義[4]。本文對(duì)有關(guān)黃酒中EC的形成機(jī)理、食品安全性評(píng)價(jià)、檢測(cè)方法及控制四個(gè)方面的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，旨在為黃酒生產(chǎn)中降低EC的含量，提升黃酒品質(zhì)提供借鑒和參考。

1 EC的形成機(jī)理

EC分子式為NH2COOC2H5，分子質(zhì)量89.09，CAS#51-79-6，無(wú)色無(wú)臭，呈結(jié)晶或白色粉末狀，易燃，易溶于水、乙醇等，微溶于有機(jī)溶劑，不易揮發(fā)[5-6]。1971年，LOFROTH G等[7]利用同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明葡萄酒和啤酒中存在EC。EC是在食品發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的一種發(fā)酵副產(chǎn)物，廣泛存在于發(fā)酵食品和酒精飲料中，人體攝取EC的主要途徑是飲用酒精飲料[8]。

1.1 氨甲?；衔锱c乙醇反應(yīng)生成EC

1976年，OUGH C S[9]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）在酸乳酪和葡萄酒中檢測(cè)到了EC，并證實(shí)EC可由氨甲?；衔锱c乙醇反應(yīng)生成。黃酒中發(fā)酵代謝產(chǎn)生的氨甲?；衔镏饕校耗蛩兀╱rea）、瓜氨酸（citrulline）和氨甲酰磷酸（carbamoylphosphate）等[10]。

（1）氨甲酰磷酸-乙醇途徑

釀酒酵母在酒精發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、CO2和氨在氨甲酰磷酸合成酶作用下生成氨甲酰磷酸，其與乙醇反應(yīng)式如下：

（2）尿素-乙醇途徑

OUGH C S等[11]對(duì)精氨酸、瓜氨酸、氨、尿素和谷氨酸在發(fā)酵飲品發(fā)酵過(guò)程中對(duì)EC形成的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，由精氨酸分解產(chǎn)生的尿素與乙醇反應(yīng)生成的EC含量遠(yuǎn)多于由氨甲酰磷酸形成的EC含量，成品葡萄酒中絕大部分的EC是由尿素形成的，因此尿素是形成EC的主要前體物質(zhì)。其反應(yīng)式如下：

（3）瓜氨酸-乙醇途徑

王霈虹[12]在模擬黃酒溶液中，對(duì)尿素、瓜氨酸分別與乙醇經(jīng)加熱后形成EC的結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)論表明，黃酒中的瓜氨酸與尿素處于同一數(shù)量級(jí)，可與乙醇在加熱條件下也能形成數(shù)量可觀的EC。因此瓜氨酸也是黃酒中形成EC的重要前體物質(zhì)。瓜氨酸與乙醇反應(yīng)式如下：

H2NCONH（CH2）3CH（NH2）COOH+C2H5OH→NH2COOC2H5+H2N（CH2）3CH（NH）COOH

1.2 黃酒工藝中EC的形成

黃酒具有獨(dú)特的生產(chǎn)工藝，如麥曲釀造、高溫煎酒、年份酒勾兌等。雖然采用獨(dú)特的生產(chǎn)工藝能釀制出獨(dú)特風(fēng)味的美酒，但同時(shí)其過(guò)程中條件控制不當(dāng)，也會(huì)伴隨著EC的產(chǎn)生。

（1）麥曲釀造

中國(guó)黃酒原料以稻米、麥曲為主，蛋白質(zhì)含量相對(duì)較高，其中高含量的精氨酸分解后產(chǎn)生的尿素與黃酒中乙醇反應(yīng)生成EC。陳艷[13]在浙江及其附近地區(qū)采集了85個(gè)黃酒樣品，采用液-液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）法分別對(duì)不同酒曲釀造的黃酒中EC含量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，麥曲釀制的黃酒中EC含量普遍高于紅曲釀制。

（2）煎酒與貯酒

較高的煎酒溫度與適宜的貯酒條件對(duì)黃酒的穩(wěn)定性和香氣形成具有重要作用，但在其過(guò)程中會(huì)形成更多的EC。加熱可加快EC的形成，溫度每升高10 ℃，EC的形成速度就增加約1倍[14]。陶新功等[15]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵階段黃酒中EC含量小幅升高，但煎酒后出現(xiàn)大幅回升的現(xiàn)象，隨著黃酒貯存期的延長(zhǎng)，EC含量會(huì)不斷上升，貯存時(shí)間相同，溫度越高，生成的EC越多。羅蘇僅[16]采用GC-MS法對(duì)黃酒生產(chǎn)過(guò)程中氨基甲酸乙酯含量進(jìn)行測(cè)定結(jié)果表明，經(jīng)煎酒后的黃酒中EC含量是煎酒前的2～4倍；陳釀2年后，EC含量高達(dá)113.46 μg/L。

2 EC食品安全性評(píng)價(jià)

2.1 EC的致癌機(jī)理研究

在20世紀(jì)40年代，EC以1 g/d的劑量被用作人的催眠劑并作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的麻醉劑，但在1943年，NETTLESHIP A等[17]通過(guò)動(dòng)物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)EC具有致癌性。每周一次重復(fù)向小鼠腹腔內(nèi)注射最小麻醉劑量的EC并對(duì)其肺部細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，小鼠的肺腫瘤發(fā)病率從不到5%增加到了75%以上，腫瘤類型主要是特征性肺腺瘤。大量研究者對(duì)EC的致癌機(jī)理進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)EC在生物體內(nèi)的代謝途徑主要有3種：其一是超過(guò)90%的EC可被分解為乙醇、氨和碳水化合物等；其二是約0.5%的EC被細(xì)胞色素P450氧化成脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）加聚物，造成DNA雙鏈破壞，導(dǎo)致癌變；此途徑被普遍認(rèn)為是EC的主要致癌途徑；其三是0.1%左右的EC被細(xì)胞色素（P450）氧化成N-羥基-EC，后者可以誘導(dǎo)Cu2+所調(diào)控的DNA損傷從而導(dǎo)致細(xì)胞癌變[18]。

2.2 EC食品安全性評(píng)價(jià)

自1943年EC被發(fā)現(xiàn)具有致癌性，世界各國(guó)學(xué)者又先后在蒸餾酒、醬油和面包等發(fā)酵酒精飲料和食品中檢測(cè)到了EC，這些研究使各國(guó)政府對(duì)EC在食品安全領(lǐng)域的關(guān)注程度日益增加。1985年，加拿大衛(wèi)生與防疫部門對(duì)酒精飲料中EC含量進(jìn)行規(guī)定：佐餐葡萄酒為30 μg/L，加強(qiáng)葡萄酒為100μg/L，蒸餾酒為150μg/L，烈性酒和水果白蘭地為400μg/L，日本清酒為100 μg/L。美國(guó)食品和藥品管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）、美國(guó)葡萄酒研究所和美國(guó)酒商協(xié)會(huì)規(guī)定：1988年以后生產(chǎn)的佐餐葡萄酒（酒精度≤14%vol）EC含量不能超過(guò)15 μg/L，1989年以后生產(chǎn)的甜葡萄酒（酒精度≥14%vol）EC含量不能超過(guò)60 μg/L。2002年，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織對(duì)EC進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)控，制定了國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)：EC含量不得超過(guò)20 μg/L[19]。2007年世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（international agency for research on cancer，IARC）正式將EC重新分類，由2B組（或可能令人類患癌的物質(zhì)）改為2A組（可能令人類患癌的物質(zhì)）[20-21]。

目前，國(guó)際上尚無(wú)統(tǒng)一的EC限量，各國(guó)仍以加拿大EC限量作為主要參照。我國(guó)由于發(fā)酵食品種類眾多，檢測(cè)方法不統(tǒng)一等原因尚未制定酒精飲料和發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯限量標(biāo)準(zhǔn)[22]。

3 EC的檢測(cè)方法

早在1993年，我國(guó)商檢部門采用氣相色譜法建立了出口酒中EC的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法[23]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和貿(mào)易全球化的進(jìn)行，如何有效檢驗(yàn)和控制黃酒中的EC含量，就成為質(zhì)檢部門關(guān)注的問(wèn)題。近幾年，相繼出現(xiàn)了許多新的檢測(cè)EC的方法。

3.1 氣質(zhì)聯(lián)用法

在已報(bào)道的各種黃酒中EC的測(cè)定方法中，仍以氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS）法為主。在氣相色譜法的基礎(chǔ)上，GC-MS法能快速高效地對(duì)樣品進(jìn)行定量和定性分析，更適用于復(fù)雜混合物中某組分的鑒定。一般黃酒中的EC檢測(cè)采用GC-MS法[24]，其已被國(guó)際葡萄與葡萄酒組織（international vine and wine organization，OIV）、美國(guó)官方分析化學(xué)師協(xié)會(huì)（association of official analytical chemists，AOAC）和歐盟納入檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法[25]。采用GC-MS法檢測(cè)酒中EC的含量成為了近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一。

鮑會(huì)梅[26]采用GC-MS法測(cè)定黃酒中EC的含量。結(jié)果表明，采用GC-MS法檢測(cè)出的EC各項(xiàng)指標(biāo)均符合國(guó)標(biāo)，且操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速，該方法適用于黃酒中EC的測(cè)定。華穎等[27]建立應(yīng)用同位素內(nèi)標(biāo)-GC-MS法快速測(cè)定黃酒和食用酒精中EC的分析方法。該方法定量準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，適用于黃酒和食用酒精中氨基甲酸乙酯的測(cè)定。

目前GC-MS法已被GB 5009.223—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基甲酸乙酯的測(cè)定》采用。

3.2 其他方法

鐘其頂?shù)萚28]建立了高效液相色譜-熒光法（high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLCFLD）測(cè)定黃酒中EC含量的方法，發(fā)現(xiàn)此法更為簡(jiǎn)單快速、成本較低、易于掌握，適用于生產(chǎn)企業(yè)過(guò)程監(jiān)控。王麗娟等[29]建立了超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometric，UPLC-ESI-MS/MS）測(cè)定黃酒與葡萄酒中EC含量的方法。該方法樣品處理簡(jiǎn)單，前處理過(guò)程不使用有機(jī)溶劑，測(cè)定快速、準(zhǔn)確，靈敏度高，適合黃酒中EC的快速檢測(cè)和定量分析。LUO L等[30]采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（competitive inhibition enzyme linked immunosorbent assay，Ci-ELISA法）分析中國(guó)黃酒。結(jié)果表明，通過(guò)Ci-ELISA分析實(shí)際樣品的結(jié)果與GC-MS法的結(jié)果相關(guān)，該方法具有良好的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，適用于監(jiān)測(cè)大量樣品中的EC。

4 EC的控制

EC的形成途徑多種多樣，采用單一的方法很難將EC全部清除。國(guó)內(nèi)外關(guān)于解決飲料酒中EC問(wèn)題的研究主要是從減少其來(lái)源、工藝條件控制與后續(xù)去除等方面去考慮，主要方法如圖1所示。我國(guó)學(xué)者對(duì)黃酒中EC的主要控制途徑研究方面已做了一些基礎(chǔ)性的的工作，其中降低、控制黃酒中EC含量的方法已見報(bào)道，并在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用。

圖1 氨基甲酸乙酯主要控制途徑示意圖Fig.1 Sketches diagram of the main way to control ethyl carbamate

4.1 構(gòu)建低產(chǎn)尿素酵母

黃酒中的尿素主要有2個(gè)來(lái)源：其一是原料、水和輔料會(huì)帶入一定量尿素；其二是在發(fā)酵過(guò)程中由酵母菌代謝精氨酸生成。黃酒中絕大部分的尿素是由釀酒酵母代謝精氨酸產(chǎn)生的，直接參與尿素代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)的基因有精氨酸酶編碼基因（CAR1）、脲基酰胺酶編碼基因（DUR1，2）、尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（DUR3），研究表明[31]，釀酒酵母的單個(gè)CAR1等位基因表達(dá)的精氨酸酶足以降解精氨酸生成大量的尿素，形成數(shù)量可觀的EC。

（1）敲除CAR1。在酒精發(fā)酵時(shí)，酵母胞內(nèi)的CAR1表達(dá)水平較高，精氨酸水解產(chǎn)生大量尿素，進(jìn)而使酒中EC含量增加。趙然然[32]選育低產(chǎn)尿素的黃酒酵母菌株，通過(guò)敲除CAR1的方法改造黃酒酵母，降低其精氨酸酶表達(dá)活性，減少酵母分解精氨酸產(chǎn)生的尿素，進(jìn)而降低酒液中EC含量。方逸群等[33]通過(guò)紫外誘變?cè)囼?yàn)篩選獲得誘變菌株（CAR1缺陷型酵母菌株）。結(jié)果表明經(jīng)過(guò)改良菌種發(fā)酵獲得黃酒產(chǎn)品與原始菌株相比，發(fā)酵產(chǎn)物尿素及EC含量顯著下降。

（2）過(guò)表達(dá)DUR1，2和DUR3。釀酒酵母在酒精發(fā)酵階段時(shí)，由于DUR1，2表達(dá)受到氮代謝阻遏效應(yīng)（nitrogen catablite repression，NCR）調(diào)控，胞內(nèi)脲基酰胺酶活性很低，不能及時(shí)降解由精氨酸水解所產(chǎn)生的大量尿素，多余尿素被分泌到胞外與乙醇反應(yīng)生成EC[34]。WU D H等[35]采用代謝工程改造了兩種酵母菌株N85（DUR1，2）和N85（DUR1，2）-c。使用兩種改造菌株發(fā)酵的黃酒中EC的濃度比親本菌株發(fā)酵的黃酒分別降低49.1%和55.3%。所有工程菌株均顯示出良好的遺傳穩(wěn)定性，適合商業(yè)化以提高中國(guó)黃酒的安全性。申超等[36]通過(guò)采用融合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)提高DUR3的表達(dá)水平，構(gòu)建了尿素吸收型工業(yè)黃酒酵母單倍體工程菌Na-uD。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Na-uD具有“吸收尿素”的能力，能夠有效降低發(fā)酵液中尿素及EC的含量，且無(wú)外源抗性基因的引入。

4.2 生產(chǎn)工藝過(guò)程控制

4.2.1 添加酸性脲酶

通常的尿素降解酶即指脲酶，脲酶分為中性和酸性酶?；陲嬃暇频乃嵝詐H，只可添加酸性脲酶。發(fā)酵液中的尿素可在外源酸性脲酶的作用下分解為NH3和CO2，進(jìn)而減少酒中EC的含量[37]。

周建立等[38]構(gòu)建表達(dá)酸性脲酶的乳酸乳球菌，并對(duì)重組酸性脲酶對(duì)尿素和EC的水解過(guò)程進(jìn)行研究，結(jié)果表明重組酸性脲酶對(duì)黃酒中尿素具有很好的降解能力（60 mg/L的尿素在25 h內(nèi)完全被降解）。張傲娜[39]從小鼠糞便、合肥豆制品廠和乳制品廠的污泥中篩選得到一株產(chǎn)酸性脲酶能力較高的菌株，并初步研究該酶對(duì)尿素的去除效果。結(jié)果表明，該酶能去除75%左右的尿素；經(jīng)該酶處理的黃酒在煎酒過(guò)程中生成的EC含量降低75.7%，表明該酶在黃酒中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

4.2.2 控制傳統(tǒng)生產(chǎn)條件

（1）縮短浸米時(shí)間

王賓等[40]通過(guò)模擬黃酒的發(fā)酵過(guò)程，利用分光光度法和平板計(jì)數(shù)法對(duì)黃酒發(fā)酵過(guò)程中EC相關(guān)前體物質(zhì)的變化規(guī)律進(jìn)行研究，結(jié)果表明，黃酒釀造工藝中的浸米階段會(huì)形成瓜氨酸積累，瓜氨酸是EC形成過(guò)程中重要的前體物質(zhì)。因此浸米時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，避免黃酒中瓜氨酸的積累。

（2）煎酒與貯存

煎酒與貯存過(guò)程均會(huì)使黃酒產(chǎn)生數(shù)量可觀的EC[16-18]，但其也是黃酒生產(chǎn)中不可或缺的兩個(gè)重要工序，所以控制原料及靈活掌握適宜的煎酒條件、貯酒條件和貯酒期，就既能最大程度的保留黃酒營(yíng)養(yǎng)成分及色、香、味，又能直接減少黃酒中EC的產(chǎn)生量。

（3）EC降解酶

EC降解酶是能直接降解EC的酶，使其降解為氨、CO2和乙醇，此法可直接解決EC問(wèn)題且不需更換酵母菌種，不改變生產(chǎn)工藝條件和原酒風(fēng)味特性。劉俊[41]通過(guò)基因比較發(fā)現(xiàn)，黃酒適用腸桿菌（Enterobactersp.）R-SYB082尿素降解酶是一種酸性脲酶同功酶——脲基乙醇酸酰胺水解酶（ureidoglycolate amidohydrolase，UAH）而非脲酶，該酶能實(shí)現(xiàn)黃酒中待去除底物尿素及產(chǎn)物EC的聯(lián)合控制，具有很好的應(yīng)用特性與工業(yè)開發(fā)前景。

目前為止仍沒(méi)有商品化的EC降解酶生產(chǎn)，一是由于己經(jīng)報(bào)道的產(chǎn)生菌酶活都比較低，二是黃酒中的乙醇和低pH環(huán)境也對(duì)酶的性質(zhì)有苛刻的要求，而EC降解酶普遍乙醇耐受性及酸耐受性差。

（4）吸附材料

被廣泛開發(fā)和應(yīng)用的吸附性材料是合成樹脂，其具有多孔性立體結(jié)構(gòu)的小顆粒，在整個(gè)顆粒內(nèi)部及外部具有表面活性，其與物質(zhì)間的相互作用能達(dá)到物質(zhì)的分離、凈化等目的。

王翼瑋等[42]通過(guò)篩選得到能夠有效吸附黃酒中EC的大孔結(jié)構(gòu)吸附樹脂。研究結(jié)果表明，該樹脂具有良好的吸附性能和再生能力，對(duì)EC吸附去除率可達(dá)70%以上，且對(duì)黃酒的主要理化指標(biāo)沒(méi)有顯著影響。高雅[43]優(yōu)選出吸附黃酒中EC效果較好且對(duì)其風(fēng)味物質(zhì)影響較低的兩種樹脂材料DM301和DA-201，將二者進(jìn)行復(fù)配后可進(jìn)一步減少風(fēng)味物質(zhì)的損失。另得出結(jié)論，在最適工藝條件下黃酒的EC去除率可達(dá)76.81%。

5 展望

綜上所述，黃酒在釀制及貯存過(guò)程產(chǎn)生的EC的含量的控制，目前的研究主要集中在黃酒中EC的形成機(jī)理、食品安全性評(píng)價(jià)、檢測(cè)方法及控制四個(gè)方面。EC的研究已取得一系列成果，但如何在不影響黃酒品質(zhì)的條件下，高效經(jīng)濟(jì)地控制并去除EC，并能大規(guī)模應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中的技術(shù)體系尚未建立。雖然在發(fā)酵液中直接添加酸性脲酶控制EC含量的方法已建立，但酸性脲酶只能專一地分解EC合成前體物質(zhì)尿素，不能分解EC或?qū)ζ浞纸饴蕵O低，酸性脲酶作用的局限性，影響了其在酒類行業(yè)中使用；且由于諸多原因目前為止仍沒(méi)有商品化的EC降解酶生產(chǎn)。已發(fā)現(xiàn)許多新型樹脂吸附材料可去除EC，進(jìn)一步提高去除率，并實(shí)現(xiàn)在生產(chǎn)中應(yīng)用，還需要后續(xù)更深入的研究。