胡秀虹，韋國(guó)蘭，李 培，張廷輝，王 翔，3*

（1.凱里學(xué)院 大健康學(xué)院，貴州 凱里 556011；2.黔東南州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州 凱里 556011；3.黔東南民族藥綜合利用工程技術(shù)研究中心，貴州 凱里 556011）

腌韭菜根是貴州黔東南的一款本土特色食品。近年來(lái)，隨著貴州經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，旅游業(yè)及我國(guó)大健康產(chǎn)業(yè)的快速興起，腌韭菜根以其豐富的營(yíng)養(yǎng)成分、獨(dú)特的風(fēng)味及保健功效，逐漸得到推廣和人們的認(rèn)可。黔東南腌韭菜根的工業(yè)化生產(chǎn)是將采集的原生態(tài)韭菜根（一種寬葉韭（Allium hookeriThwaites）的肉質(zhì)根）洗凈晾干后拌以輔料（鹽或糖分）腌制再真空包裝后輻照滅菌或低溫冷藏，食用時(shí)可根據(jù)當(dāng)?shù)厣贁?shù)民族人們的口味、喜好加辣椒、白酒、食鹽、油等涼拌也可以當(dāng)?shù)嘏D肉炒之[1-3]。然而，韭菜根原料水分含量高又營(yíng)養(yǎng)豐富，極易因滋生微生物而腐敗，加之環(huán)境的影響或不規(guī)范的生產(chǎn)操作，袋裝腌韭菜根在貯藏過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)脹袋、變色、軟化、酸敗腐臭等現(xiàn)象，這不僅影響腌韭菜根產(chǎn)品的感官品質(zhì)，也可能產(chǎn)生潛在的食品安全問(wèn)題[4-6]。研究表明[7-9]，袋裝食品的腐敗很大程度上與其中的微生物生長(zhǎng)代謝密切相關(guān)，食品腐敗主要表現(xiàn)在某些微生物生長(zhǎng)和代謝時(shí)生成有機(jī)酸、胺、硫化物、醇、醛、酮等，產(chǎn)生不良?xì)馕?，使產(chǎn)品感官改變。不過(guò)，研究者也指出，微生物的生長(zhǎng)受到如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、溫度、酸堿度、氣體環(huán)境、NaCl等多種因素的影響，改變微生物的生長(zhǎng)環(huán)境，可對(duì)其加以控制或利用[10]。因此，研究食品腐敗微生物的生長(zhǎng)特性，對(duì)指導(dǎo)食品防腐具有重要的意義。

本研究以從脹袋變質(zhì)的腌韭菜根中分離出的5株腐敗菌：巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、萵苣不動(dòng)桿菌（Acinetobacfer lactucae）、解淀粉芽孢桿菌（Paenibacillus amylolyticus）、土楊芽孢桿菌（Bacillus toyonensis）蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）為供試菌株，探究其在不同溫度、酸堿度、含氧量、防腐劑等因素下的生長(zhǎng)狀況，并確定這幾種微生物耐受高溫的溫度與時(shí)間，為解決腌韭菜根腐敗問(wèn)題提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、萵苣不動(dòng)桿菌（Acinetobacfer lactucae）、解淀粉芽孢桿菌（Paenibacillus amylolyticus）、土楊芽孢桿菌（Bacillus toyonensis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）：從脹袋韭菜根中分離篩選，并由凱里學(xué)院黔東南民族藥綜合利用工程技術(shù)研究中心微生物實(shí)驗(yàn)室分離鑒定；瓊脂粉（生化試劑）、氯化鈉（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；牛肉膏、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；苯甲酸鈉、乳酸鏈球菌素（食品級(jí)）：南通奧凱生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；蒸餾水：實(shí)驗(yàn)室自制，于121 ℃高壓滅菌20 min可制得無(wú)菌水。

牛肉膏蛋白質(zhì)液體培養(yǎng)基[11]：按《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》中的配方配制，調(diào)節(jié)pH為7.2～7.5，在液體培養(yǎng)基配方中添加20 g/L的瓊脂粉即得固體培養(yǎng)基，所有培養(yǎng)基均置于121 ℃高壓滅菌20 min，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺(tái)：上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；ZWY-CZ11D型恒溫?fù)u床培養(yǎng)振蕩器：上海智誠(chéng)分析儀器有限公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱、BGZ-246型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；BIO-BRI型酶標(biāo)儀：成都百樂(lè)科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化

取出保存于冰箱中的菌種，劃線于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基，并于（36±1）℃培養(yǎng)24 h，活化2次。挑取1環(huán)菌種加入已滅菌的100 mL牛肉膏蛋白胨的液體培養(yǎng)基中，于（36±1）℃搖床（轉(zhuǎn)速180 r/min）培養(yǎng)24 h。

1.3.2 不同因素對(duì)5種腐敗菌生長(zhǎng)的影響

將制備好的各株菌的菌懸液接種于20 mL裝有5 mL肉湯培養(yǎng)基（pH值為7.0）的試管中，使接種后的菌液濃度保持一致，于（36±1）℃搖床（轉(zhuǎn)速180 r/min）培養(yǎng)24 h后測(cè)定菌液的OD600nm值[12]。為了探究各菌株在不同培養(yǎng)溫度、pH值、裝樣量下的生長(zhǎng)狀況，在其他培養(yǎng)條件不變的情況下，分別改變單一培養(yǎng)條件，考察不同因素對(duì)5種腐敗菌生長(zhǎng)的影響。

溫度：保持培養(yǎng)pH值、裝樣量不變，設(shè)置培養(yǎng)溫度為4 ℃、15 ℃、25 ℃、37 ℃、45 ℃、50 ℃，分別在不同溫度下培養(yǎng)，平行實(shí)驗(yàn)3次。

pH值：保持裝樣量、培養(yǎng)溫度不變，用1 mol/L氫氧化鈉和1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的pH值為4.5、5.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，平行實(shí)驗(yàn)3次。

裝樣量：保持培養(yǎng)pH值、培養(yǎng)溫度不變，設(shè)置試管中肉湯培養(yǎng)基裝樣量為2 mL、4 mL、8 mL、10 mL、12 mL、14 mL，平行實(shí)驗(yàn)3次。

1.3.3 殺菌處理對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

殺菌溫度：在60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃、110 ℃、120 ℃下分別處理20 min，平行實(shí)驗(yàn)3次。

殺菌時(shí)間：選用100 ℃，分別處理0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min；平行實(shí)驗(yàn)3次。

1.3.4 防腐劑對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

選用苯甲酸鈉、乳酸鏈球菌素兩種防腐劑為研究對(duì)象，依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[13]設(shè)置添加濃度，各防腐劑的添加濃度見(jiàn)表1。將各防腐劑添加到肉湯培養(yǎng)基中，分別接種對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的腐敗菌，使其菌液初始濃度為500 CFU/mL，37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)12 h測(cè)定腐敗菌的生長(zhǎng)情況。另外，以不加防腐劑不接種的肉湯培養(yǎng)基為空白組，以不加防腐劑但接種的為對(duì)照組。

表1 單一防腐劑的添加質(zhì)量濃度Table 1 Mass concentration of single preservatives

1.3.5 數(shù)據(jù)處理及分析

腐敗菌生長(zhǎng)濃度的測(cè)定采用比濁法[14-15]，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定菌液的OD600nm值即測(cè)定在波長(zhǎng)600 nm處的樣品吸光度值。利用Origin 8.0軟件進(jìn)行作圖，使用SPSS 25軟件分析及處理數(shù)據(jù)，顯著性采用Duncan's多重比較法（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

溫度是影響微生物生長(zhǎng)與存活的重要因素之一。當(dāng)微生物處于最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，生長(zhǎng)代謝旺盛；而不適宜的溫度則會(huì)導(dǎo)致微生物的代謝和形態(tài)改變或使微生物的蛋白質(zhì)凝固變性而導(dǎo)致死亡[16]。不同細(xì)菌對(duì)培養(yǎng)溫度的要求不一，大多數(shù)芽孢桿菌的抗熱能力較強(qiáng)，其最適生長(zhǎng)溫度為30～37 ℃[17]。5種腐敗菌菌株分別在4 ℃、15 ℃、25 ℃、37 ℃、45 ℃、50 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，測(cè)定的菌液OD600nm值變化結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，在處理溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，5株腐敗菌的OD600nm值均呈先升高后下降的趨勢(shì)，在37 ℃時(shí)生長(zhǎng)最好，其OD600nm值分別為0.61、0.27、0.43、0.53、0.29，這說(shuō)明5株腐敗菌的最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃；在15 ℃和50 ℃時(shí)，生長(zhǎng)微弱；在4 ℃時(shí)，OD600nm值接近零，幾乎不生長(zhǎng)。

表2 培養(yǎng)溫度對(duì)腐敗菌生長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of culture temperature on the growth of spoilage bacteria

將4 ℃恒溫培養(yǎng)箱下培養(yǎng)24 h的菌株繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，測(cè)定其OD600nm值，結(jié)果表明，5株腐敗菌的OD600nm值在0.143 2～0.315 4之間。由此可見(jiàn)，在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，4 ℃低溫對(duì)5株腐敗菌具有較好的抑制作用。

2.2 pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

細(xì)菌的生長(zhǎng)需借助于細(xì)胞內(nèi)的各種代謝活動(dòng)來(lái)完成，這些代謝活動(dòng)大多經(jīng)不同酶催化的生化反應(yīng)，反應(yīng)需要在一定的pH條件下進(jìn)行[16-17]。

5種腐敗菌菌株分別在pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0下培養(yǎng)24 h后的OD600nm值見(jiàn)表3。

表3 pH值對(duì)腐敗菌生長(zhǎng)的影響Table 3 Effect of pH value on the growth of spoilage bacteria

由表3可知，在處理pH范圍內(nèi)，隨pH升高，5株腐敗菌的OD600nm值呈先升高后下降的趨勢(shì)，巨大芽孢桿菌在pH為6.0時(shí)，生長(zhǎng)最好，與其他pH處理比差異顯著；土楊芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌在pH為6.5時(shí)，生長(zhǎng)最好，與其他pH處理比差異顯著；萵苣不動(dòng)桿菌、解淀粉芽孢桿菌在pH為6.5時(shí)，生長(zhǎng)最好，與pH=6.0處理比差異不顯著，與其他pH處理比差異顯著；pH在4.5以下或8.0以上時(shí)，生長(zhǎng)會(huì)受到抑制。結(jié)果表明，5株腐敗菌具有一定的耐酸性，最適生長(zhǎng)pH值為6.0～6.5。本試驗(yàn)所用腌制韭菜根的pH值為6.28～6.44，十分有利于腐敗微生物的繁殖生長(zhǎng)，故生產(chǎn)中需要嚴(yán)格控制殺菌pH值，以更好地抑制腐敗菌的生長(zhǎng)。

2.3 裝樣量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

試管中的裝樣量反映了菌株生長(zhǎng)的需氧量。裝樣量（培養(yǎng)液體積）越多，通氧量越少，菌株所獲得的氧氣量則越低[18]。腐敗菌菌株在不同裝樣量（2～14）mL條件下培養(yǎng)24 h后，菌液的OD600nm值，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 裝樣量對(duì)腐敗菌生長(zhǎng)的影響Table 4 Effect of volume of sample loading on the growth of spoilage bacteria

由表4可知，裝樣量為2～8 mL時(shí)，5株菌的OD600nm值變化較小，裝樣量為8～14 mL時(shí)，5株菌的OD600nm持續(xù)下降。根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)對(duì)氧氣的需求不同，可將其分為專性需氧菌、微需氧菌、兼性厭氧菌和專性厭氧菌4類[16-17]。綜上分析，可判斷該5種腐敗菌均為兼性厭氧菌，即在有氧及氧氣不足的條件下都能生長(zhǎng)，有氧時(shí)生長(zhǎng)更好。這正說(shuō)明抽真空保存對(duì)抑制腐敗微生物有一定輔助作用。

2.4 殺菌處理對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

2.4.1 殺菌溫度對(duì)菌株的影響

腐敗菌菌株經(jīng)不同高溫處理20 min后，培養(yǎng)24 h的菌液OD600nm值，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，隨著溫度的上升，菌液OD600nm值降低，其中從90～120 ℃，OD600nm值急劇下降。當(dāng)殺菌溫度為100 ℃時(shí)，OD600nm值均很低，維持在0.056 7～0.148 3之間，說(shuō)明此溫度下可殺死大部分腐敗菌，不過(guò)仍有少數(shù)菌株殘留。當(dāng)溫度升至120 ℃時(shí)，OD600nm值接近于零，幾乎全被滅活，由此可知，5株菌耐高溫能力較強(qiáng)。但在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，殺菌溫度過(guò)高會(huì)影響食品的品質(zhì)，同時(shí)也增加生產(chǎn)成本。因此，可考慮適當(dāng)降低溫度，延長(zhǎng)殺菌時(shí)間。

表5 殺菌溫度對(duì)腐敗菌生長(zhǎng)的影響Table 5 Effect of sterilization temperature on growth of the spoilage bacteria

2.4.2 不同殺菌時(shí)間對(duì)菌株的影響

在100 ℃下，經(jīng)不同殺菌時(shí)間處理后，培養(yǎng)24 h的菌液OD600nm值，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，100 ℃殺菌處理必須超過(guò)20 min才具有良好的滅菌效果，不過(guò)即使殺菌時(shí)間達(dá)到35 min，也難以將腐敗菌徹底滅活。綜上分析，由于供試菌多為芽孢桿菌，耐熱性較好，故在實(shí)際食品生產(chǎn)中，在確?？诟?、品質(zhì)及生產(chǎn)成本的前提下，產(chǎn)品不宜采用高溫殺菌，可考慮在較低溫度下保藏或降低酸度或抽真空包裝。

表6 100 ℃高溫處理對(duì)腐敗菌生長(zhǎng)的影響Table 6 Effect of 100 ℃high temperature treatment on the growth of spoilage bacteria

2.5 防腐劑對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

2.5.1 苯甲酸鈉的抑菌效果

防腐劑苯甲酸鈉是醬腌菜中使用最多的防腐劑之一。不同質(zhì)量濃度苯甲酸鈉對(duì)5種腐敗菌的抑制效果見(jiàn)表7。

由表7可知，當(dāng)各腐敗菌的初始濃度約為500 CFU/mL時(shí)，在苯甲酸鈉質(zhì)量濃度為0～0.2 g/kg內(nèi)，隨著濃度的增加，5株供試菌的OD600nm值明顯下降，通過(guò)SPSS25.0中Duncan's多重比較法分析，發(fā)現(xiàn)各株腐敗菌在苯甲酸鈉質(zhì)量濃度為0、0.1 g/kg和0.2 g/kg時(shí)的OD600nm值差異顯著（P＜0.05）。繼續(xù)升高濃度，各菌的OD600nm值下降緩慢，當(dāng)苯甲酸鈉質(zhì)量濃度為0.2g/kg和0.3g/kg時(shí)，菌株Bacillustoyonensis與Acinetobacfer lactucae菌液的OD600nm值差異顯著（P＜0.05），其他菌株不顯著；當(dāng)苯甲酸鈉質(zhì)量濃度為0.3 g/kg和0.4 g/kg時(shí)，Bacillus toyonensis與Acinetobacfer lactucae菌液的OD600nm值差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，添加單一苯甲酸鈉的最佳質(zhì)量濃度為0.2～0.3 g/kg。當(dāng)苯甲酸鈉濃度上升至0.5 g/kg時(shí)，Bacillus cereus、Acinetobacfer lactucae的OD600nm值趨近于0，Bacillus megaterium、Paenibacillus amylolyticus、Bacillus toyonensis的OD600nm值分別為0.080 8、0.090 5、0.142 8。表明苯甲酸鈉（0～0.5 g/L）在一定程度上能有效抑制腐敗細(xì)菌的生長(zhǎng)。若考慮減少防腐劑用量，增強(qiáng)抑菌效果，后期可考慮與其他防腐劑復(fù)配使用[19-21]，復(fù)配苯甲酸鈉的最佳添加質(zhì)量濃度為0.1～0.3 g/kg。

表7 苯甲酸鈉對(duì)腐敗菌的抑菌效果Table 7 Antibacterial effect of sodium benzoate on spoilage bacteria

2.5.2 Nisin的抑菌效果

生物防腐劑Nisin自1988年就被公認(rèn)為一種安全的食品防腐劑，廣泛應(yīng)用于果蔬、肉制品、香腸和奶酪中，并在制藥、化妝品和保健產(chǎn)品中也開(kāi)始受到追捧。Nisin對(duì)革蘭氏陽(yáng)性（G+）細(xì)菌具有較好的抑制作用，特別是對(duì)食品中的一些產(chǎn)芽孢的細(xì)菌，如芽孢桿菌[22]。不同質(zhì)量濃度的Nisin對(duì)初始濃度約為500 CFU/mL的5種腐敗菌的抑制效果見(jiàn)表8。

由表8可知，Nisin對(duì)腐敗細(xì)菌Acinetobacfer lactucae、Bacillus megaterium和Bacillus toyonensis的抑制效果顯著，當(dāng)Nisin的質(zhì)量濃度為0.2 g/kg和0.3 g/kg時(shí)，Acinetobacfer lactucae、Bacillus megaterium和Bacillus toyonensis的OD600nm值趨近于0；Nisin對(duì)Bacillus megaterium和Paenibacillus amylolyticus的抑制效果較差，其OD600nm值最小為0.019和0.128。通過(guò)SPSS25中Duncan's多重比較法分析，當(dāng)Nisin的質(zhì)量濃度達(dá)0.20 g/kg后，菌株的OD600nm值之間差異不顯著（P＞0.05）。綜上分析，添加單一Nisin的最佳質(zhì)量濃度為0.20 g/kg，且無(wú)論其是作為單一防腐添加劑還是考慮進(jìn)一步與其他防腐劑復(fù)配都將是不錯(cuò)的選擇。

表8 Nisin對(duì)腐敗菌的抑菌效果Table 8 Antibacterial effect of Nisin on spoilage bacteria

3 結(jié)論

腌韭菜根中的5株優(yōu)勢(shì)腐敗細(xì)菌：Bacillus megaterium、Acinetobacfer lactucae、Paenibacillus amylolyticus、Bacillus toyonensis、Bacillus cereus具有較強(qiáng)的耐熱性，其最適生長(zhǎng)溫度均為37 ℃，在15 ℃和50 ℃時(shí)生長(zhǎng)微弱，4 ℃時(shí)幾乎不生長(zhǎng)。這些腐敗菌具有較好的耐酸性，最適生長(zhǎng)pH值為6.0～6.5，且均為兼性厭氧菌。高溫殺菌時(shí)，需達(dá)100 ℃滅菌20 min以上才能達(dá)到較好的滅菌效果。單一防腐劑苯甲酸鈉、Nisin對(duì)初始濃度約為500 CFU/mL的腐敗菌具有良好的抑制效果，其添加的最佳質(zhì)量濃度為0.2～0.3 g/kg。若考慮減少防腐劑的用量，增強(qiáng)抑菌效果，可考慮進(jìn)一步進(jìn)行防腐劑復(fù)配應(yīng)用研究。