莊 謙 董志霞 葉 欣 程金年 宛新建上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心(200233)

背景：高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠膽囊膽固醇結(jié)石模型是膽囊結(jié)石成因及其防治研究常用的動物模型。目的：探討高脂飲食小鼠膽囊膽固醇結(jié)石模型特征并進(jìn)行肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。方法：20只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為2組，分別予普通飼料喂養(yǎng)(對照組)和成石飼料喂養(yǎng)[成石飲食(LD)組]。喂養(yǎng)8周后觀察膽囊結(jié)石形成情況，檢測血脂和膽囊膽汁脂質(zhì)成分，采用Illumina高通量測序技術(shù)篩選模型小鼠肝臟組織差異表達(dá)基因，并進(jìn)行GO和KEGG富集分析。采用real-time PCR驗(yàn)證肝臟膽汁酸合成相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果：LD組小鼠膽囊膽固醇結(jié)石成石率為100%，對照組無結(jié)石形成。LD組小鼠存在明顯的肝大和肝臟脂肪變性，血清總膽固醇、三酰甘油水平以及膽囊膽汁膽固醇含量、膽固醇飽和指數(shù)均顯著高于對照組(P<0.05)。高通量測序和生物信息學(xué)分析共篩選出1 330個差異表達(dá)基因。KEGG分析顯示差異表達(dá)基因主要在脂類代謝、膽汁分泌、胰島素分泌等通路富集。GO分析顯示脂肪酸代謝過程相關(guān)通路是顯著富集的類型。肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析和real-time PCR均顯示LD組小鼠肝臟組織中膽汁酸合成相關(guān)基因CYP7A1、CYP8B1、CYP7B1表達(dá)顯著低于對照組(P<0.05)。結(jié)論：膽囊膽固醇結(jié)石小鼠存在顯著膽固醇、膽汁酸和脂肪酸代謝紊亂。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究可篩選出膽固醇結(jié)石形成過程中發(fā)揮作用的差異表達(dá)基因，為相關(guān)研究提供參考。

膽結(jié)石是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，歐洲等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)患病率高達(dá)20%[1]，我國報道的患病率為7%～10%[2]，且因人口老齡化、飲食西方化等因素的影響，近年我國膽結(jié)石發(fā)病率呈明顯上升趨勢。根據(jù)所含膽固醇比例不同，膽囊結(jié)石可分為膽固醇結(jié)石、膽色素結(jié)石和混合性結(jié)石，我國以膽固醇結(jié)石最為常見[3]。在膽囊膽固醇結(jié)石的成因及其防治研究中，高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠膽囊膽固醇結(jié)石模型是常用動物模型之一，造模方法為喂飼C57BL/6小鼠4～8周的高膽固醇、高膽酸、高脂肪飼料，成石率可達(dá)100%[4-5]，模型動物可出現(xiàn)與膽囊結(jié)石患者相似的病理生理學(xué)變化。盡管目前對膽囊膽固醇結(jié)石發(fā)生的病理生理學(xué)過程已有較深入的認(rèn)識，如腸肝循環(huán)膽固醇-膽汁酸代謝異常、膽汁膽固醇過飽和等[6-8]，但對膽囊膽固醇結(jié)石形成的詳細(xì)機(jī)制尚不完全清楚。因此，本研究成功建立了高脂飲食小鼠膽囊膽固醇結(jié)石模型，并進(jìn)行模型特征和肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，以期為膽固醇結(jié)石的成因研究以及尋找潛在的防治靶點(diǎn)提供參考。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物和主要試劑

SPF級健康雄性C57BL/6J小鼠20只，6周齡，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司[許可證號: SCXK(滬)2018-0006]，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心 SPF級屏障環(huán)境中。成石飼料(含15%脂肪+1.25%膽固醇+0.5%膽酸)、普通飼料(含0.02%膽固醇；南通特洛菲飼料科技有限公司)。總膽固醇測定試劑盒、總膽汁酸試劑盒、三酰甘油測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；磷脂測定試劑盒(富士膠片和光純藥株式會社)；Trizol總RNA抽提試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR)、real-time PCR試劑盒(AceQ?Universal SYBR qPCR Master Mix；南京諾唯贊生物科技股份有限公司)。

二、方法

1. 動物模型建立：實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)1周普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機(jī)分為2組，每組10只，分別予普通飼料喂養(yǎng)(對照組)和成石飼料喂養(yǎng)[成石飲食(lithogenic diet, LD)組]。環(huán)境條件：12 h光照和12 h黑暗交替，溫度21～25 ℃。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲水和進(jìn)食，每周記錄體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)方案通過上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院動物福利倫理委員會審核批準(zhǔn)。

2. 組織標(biāo)本采集：喂養(yǎng)8周后，所有小鼠隔夜禁食12 h，稱重并編號；腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)麻醉，摘取眼球留取全血，冰上靜置后3 000 r/min離心10 min，收集上層血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。頸椎脫臼處死小鼠，打開腹腔，觀察并記錄膽囊膽固醇結(jié)石形成情況。完整剝離膽囊，稱重，以密度為1 g/mm3近似計算膽囊體積[9]，留取膽囊膽汁待測。肝臟和膽囊以4%多聚甲醛固定或液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3. 血脂和膽囊膽汁脂質(zhì)檢測：吸取血清，采用總膽固醇、三酰甘油、HDL-C、LDL-C測定試劑盒進(jìn)行檢測；吸取混勻的膽囊膽汁，采用總膽固醇、總膽汁酸、磷脂測定試劑盒進(jìn)行檢測。操作均嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。分別計算膽汁中膽固醇、膽汁酸和磷脂摩爾濃度占三者摩爾濃度之和(即膽汁總脂質(zhì)摩爾濃度)的百分比，根據(jù)Carey表計算膽汁膽固醇飽和指數(shù)[10]。

4. 肝臟和膽囊組織學(xué)檢查：肝臟、膽囊組織4%多聚甲醛固定、脫水、透明、包埋、切片，常規(guī)行HE染色，肝臟組織另行油紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變。使用Image-Pro Plus軟件(v6.0)分析油紅染色切片中紅色脂滴面積占整個視野面積的百分比，進(jìn)行油紅染色定量。

5. Illumina 高通量測序和分析：由北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行小鼠肝臟組織 RNA提取和檢測、文庫構(gòu)建、文庫質(zhì)檢和上機(jī)測序，并進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控和基因表達(dá)分析。

①建庫測序：每組取5只小鼠的肝臟組織提取RNA并檢測，濃度和總量達(dá)標(biāo)進(jìn)行文庫構(gòu)建。以磁珠富集真核生物mRNA，將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板依次合成cDNA第一鏈和第二鏈；繼而對雙鏈cDNA進(jìn)行3’-末端腺苷酸化，再連接測序接頭，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集cDNA。文庫構(gòu)建完成后進(jìn)行文庫質(zhì)檢，合格后通過Illumina NovaSeq測序平臺進(jìn)行高通量測序。

②生物信息學(xué)分析：對測序得到的原始序列進(jìn)行過濾，得到干凈、有效、高質(zhì)量的clean reads。應(yīng)用Hisat2軟件(v2.0.6)將由測序數(shù)據(jù)得到的reads比對參考基因組，進(jìn)而對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行注釋和定量。應(yīng)用edgeR軟件(v3.3.3)分析基因在各樣本中的差異表達(dá)情況，并進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，得到校準(zhǔn)后P值。以校準(zhǔn)后P值<0.05且差異表達(dá)倍數(shù)>2為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。應(yīng)用R語言(v4.0.2)繪制展現(xiàn)差異表達(dá)結(jié)果的火山圖和熱圖。

基因本體論數(shù)據(jù)庫(Gene Ontology, GO； http://www.geneontology.org/)可對基因和蛋白功能進(jìn)行限定和描述。從生物過程(biological pro-cess)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)三個層面對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，確定差異表達(dá)基因的主要生物學(xué)功能。同理，應(yīng)用京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG; https://www.kegg.jp/)對各個信號通路中的差異表達(dá)基因數(shù)目和富集情況進(jìn)行KEGG富集分析。本研究使用clusterProfiler軟件(v3.16.1)進(jìn)行差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析。

6. Real-time PCR驗(yàn)證肝臟膽汁酸合成相關(guān)基因表達(dá)：以Trizol試劑提取肝臟組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)試劑說明書配置PCR反應(yīng)體系，檢測膽固醇7α-羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase, CYP7A1)、微粒體甾醇12α-羥化酶(sterol 12α-hydroxylase, CYP8B1)、氧甾醇7α-羥化酶(oxysterol 7α-hydroxylase, CYP7B1)、甾醇27α-羥化酶(sterol 27α-hydroxylase, CYP27A1)表達(dá)。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達(dá)量。

表1 肝臟膽汁酸合成相關(guān)基因PCR引物序列

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、小鼠一般情況和膽囊膽固醇結(jié)石形成率

喂養(yǎng)8周后，對照組小鼠膽囊中未見結(jié)石，膽汁澄清透亮；LD組小鼠膽囊中可見鵝卵石樣或不規(guī)則形態(tài)結(jié)石形成，膽汁混濁，可見大量膽固醇結(jié)晶(圖1A)，成石率為100%。兩組小鼠造模期間體質(zhì)量無明顯差異(P=0.465；圖1B)；LD組膽囊體積大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01；圖1C)；兩組肝質(zhì)量/體質(zhì)量比分別為6.75%±0.45%和4.87%±0.21%，LD組明顯大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01；圖1D)，表明成石飼料可致小鼠肝臟體積增大。

**兩組間比較，P<0.01

二、小鼠血脂、膽囊膽汁脂質(zhì)成分和肝臟、膽囊組織學(xué)改變

與對照組相比，LD組小鼠血清總膽固醇、三酰甘油、LDL-C水平明顯升高，HDL-C水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P=0.02；圖2A)。

LD組小鼠膽囊膽汁內(nèi)膽固醇占總脂質(zhì)的百分比高于對照組，膽汁酸占總脂質(zhì)的百分比低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P=0.03；圖2B)；膽固醇占比升高、膽汁酸占比降低，導(dǎo)致膽汁膽固醇飽和指數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01；圖2C)。

兩組間比較，*P<0.05, **P<0.01

對照組小鼠肝臟組織HE染色細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯病變，LD組則可見大量脂肪變性空泡，提示肝臟脂肪變性(圖3A)；油紅染色LD組紅色脂滴面積占視野面積百分比高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01；圖3B)，提示肝臟脂質(zhì)沉積。與對照組相比，LD組小鼠膽囊壁明顯增厚(圖3C)。

**兩組間比較，P<0.01A：肝臟HE染色(×150)；B：肝臟油紅染色(×300)；C：膽囊HE染色(完整視圖，×50；局部放大視圖，×200)圖3 對照組與LD組小鼠肝臟、膽囊HE染色和肝臟油紅染色比較

三、肝臟差異表達(dá)基因篩選

以P<0.05和差異表達(dá)倍數(shù)>2為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出1 330個LD組肝臟組織相對于對照組的差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因420個，下調(diào)基因910個，據(jù)此繪制火山圖(圖4A)，熱圖展示了差異表達(dá)最顯著的前50個基因(圖4B)。

圖4 LD組小鼠肝臟組織差異表達(dá)基因火山圖(A)和熱圖(B)

四、差異表達(dá)基因KEGG富集分析和GO功能富集分析

對篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析,結(jié)果顯示差異表達(dá)基因在19條通路顯著富集(圖5A)，主要富集于脂類代謝、膽汁分泌、胰島素分泌等通路。GO功能注釋、富集分析顯示，在生物過程分組，脂肪酸代謝過程相關(guān)通路是顯著富集的類型；在細(xì)胞組分分組，細(xì)胞膜等與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的細(xì)胞組分是顯著富集的類型；在分子功能分組，甾體羥化酶活性、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等相關(guān)通路是顯著富集的類型(圖5B)。

圖5 差異表達(dá)基因KEGG富集分析(A)和GO富集分析(B)

五、Real-time PCR 驗(yàn)證肝臟膽汁酸合成相關(guān)基因表達(dá)

肝臟組織中膽汁酸合成相關(guān)基因CYP7A1、CYP8B1和CYP7B1在LD組的相對表達(dá)量均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.02,P<0.01,P<0.01)，兩組間CYP27A1表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05；圖6)。上述基因表達(dá)情況的real-time PCR驗(yàn)證結(jié)果與肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果一致。

兩組間比較，*P<0.05, **P<0.01

討 論

目前觀點(diǎn)認(rèn)為，膽汁膽固醇過飽和是膽固醇結(jié)石形成的首要條件[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)8周成石飼料喂養(yǎng)后，小鼠膽囊膽汁中膽固醇含量明顯增加。小腸是膽固醇吸收的主要場所，成石飼料中的膽酸可顯著促進(jìn)小腸膽固醇吸收[5]。過量的膽固醇吸收使小鼠血清總膽固醇以及其他脂質(zhì)含量明顯增加。此外，成石飼料喂養(yǎng)的小鼠還表現(xiàn)為肝大和顯著的肝臟脂肪變性，肝臟分泌進(jìn)入膽汁的膽固醇增多，最終導(dǎo)致膽汁膽固醇含量增加，促進(jìn)膽汁膽固醇過飽和發(fā)生和結(jié)石形成。盡管成石飼料中含有15%的脂肪，但本研究中LD組小鼠造模過程中體質(zhì)量的變化與對照組相比并無明顯差異。既往研究也發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食中額外添加0.5%膽酸可在不影響小鼠進(jìn)食量的情況下顯著抑制和逆轉(zhuǎn)高脂飲食誘導(dǎo)的體質(zhì)量增加，其機(jī)制可能與膽酸與G蛋白耦聯(lián)膽汁酸受體1(G protein-coupled bile acid receptor 1, GPBAR1)結(jié)合，進(jìn)而通過環(huán)腺苷酸(cAMP)介導(dǎo)甲狀腺激素激活、增加能量消耗有關(guān)[11-12]。因此，添加膽酸是膽固醇結(jié)石模型與許多其他高脂飲食模型的重要不同之處，在參考其他無膽酸高脂飲食模型的研究結(jié)果時，應(yīng)考慮如有膽酸存在，對結(jié)果會有何種影響。

轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細(xì)胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出的所有 RNA的總和，轉(zhuǎn)錄組學(xué)能從整體水平研究基因功能，篩選出差異表達(dá)基因，為在分子水平尋找潛在致病基因提供了極大的便利[13]。本研究通過Illumina NovaSeq測序平臺對小鼠肝臟組織RNA進(jìn)行高通量測序和生物信息學(xué)分析，探討成石飼料誘導(dǎo)小鼠膽囊膽固醇結(jié)石形成的潛在機(jī)制。結(jié)果共篩選出1 330個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因420個，下調(diào)基因910個。膽汁酸主要由肝細(xì)胞通過經(jīng)典途徑和替代途徑合成。經(jīng)典途徑由CYP7A1啟動，替代途徑由CYP27A1啟動，CYP8B1、CYP7B1也在膽汁酸合成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。Real-time PCR驗(yàn)證顯示，膽汁酸合成限速酶CYP7A1在LD組小鼠肝臟組織中表達(dá)下調(diào)， CYP8B1、CYP7B1表達(dá)亦顯著下調(diào)，提示模型小鼠自身膽汁酸合成顯著受抑，推測可能與成石飼料中的膽酸激活核受體法尼酯X受體(farnesoid X receptor, FXR)，進(jìn)而抑制CYP7A1等基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)[15-16]。既往研究發(fā)現(xiàn)普通飼料喂養(yǎng)的小鼠膽汁中存在大量親水性膽汁酸?；?β鼠膽酸(tauro-β-muricholic acid, T-βMCA)[14]，而經(jīng)成石飼料喂養(yǎng)后，疏水性膽酸鹽替代了膽汁中原先含量最高的T-βMCA，膽汁疏水性增加，進(jìn)而促進(jìn)膽汁膽固醇過飽和發(fā)生[5,17]。膽固醇結(jié)石與胰島素抵抗以及非酒精性脂肪性肝病、2型糖尿病等代謝相關(guān)疾病存在密切聯(lián)系[7,18]，有學(xué)者認(rèn)為膽固醇結(jié)石是代謝綜合征的一種表現(xiàn)形式[19]。本研究KEGG分析進(jìn)一步顯示，LD組小鼠肝臟組織差異表達(dá)基因主要在脂類代謝、膽汁分泌、胰島素分泌等通路富集；GO分析提示脂肪酸代謝過程相關(guān)通路是顯著富集的類型。因此，膽汁酸、脂肪酸等代謝紊亂可能是膽囊膽固醇結(jié)石形成的重要因素。

綜上所述，本研究探討了高脂飲食誘導(dǎo)小鼠膽囊膽固醇結(jié)石模型的特征，并通過肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析篩選出在膽固醇結(jié)石形成過程中發(fā)揮作用的差異表達(dá)基因，研究結(jié)果提示模型小鼠存在自身膽汁酸合成障礙以及膽固醇、脂肪酸代謝紊亂，可能與膽固醇結(jié)石形成密切相關(guān)，為膽固醇結(jié)石成因及其防治研究提供了參考。