張小年,張潔文,吳紹鋒,雷清貴,郭宇琳,刁遠明

(1. 廣州中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院， 廣東 廣州 510006；2. 中山大學附屬第一醫(yī)院 中醫(yī)科， 廣東 廣州 510080；3. 廣州中醫(yī)藥大學 中藥學院， 廣東 廣州 510006)

目前，大劑量化療是治療惡性腫瘤的一種重要手段并已廣泛應用于臨床。5-FU利用抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶活性來抑制脫氧核糖核酸合成。它是目前使用非常廣泛的嘧啶類抗癌藥物，但隨著化療的推進，出現(xiàn)了嚴重的毒副作用。在細胞中轉化為核苷酸后，它優(yōu)先被腫瘤和分裂活性組織吸收，因此，5-FU在快速殺滅腫瘤細胞的同時，對人體中處于活躍分裂狀態(tài)的細胞也具有極大的殺傷力。BMSCs是成體干細胞的一種，具有強大的自我增殖能力和多向分化潛能[1]。BMSCs的這種特性，使其處于一種活躍分裂狀態(tài)，也正是由于這種特性使其在化療過程中容易成為5-FU“誤傷”的對象，從而引發(fā)嚴重的骨髓抑制毒副作用[2]。因此，研發(fā)可保護處于快速增殖狀態(tài)的干細胞免受化療藥物攻擊從而減輕腫瘤患者化療毒副作用的藥物或者方法是非常有必要的。

從已有的報道來看，在中醫(yī)上具有“補腎”、“壯陽”、“補氣”、“補血”等補益作用的多種中藥或單味中藥的有效成分、含有藥物的血清和復方中藥能夠促進BMSCs在體外的增殖[3-4]，抑制其凋亡或誘導其分化[5-6]，部分藥物甚至兼具多種作用。例如，黃芪和人參皂苷不但可以促進BMSCs的增殖生長，而且還可以抑制凋亡[7]。

ICA是一種異黃酮化合物，它是淫羊藿的主要有效成分?，F(xiàn)代藥理學實驗表明，ICA具備了抗腫瘤、抗炎、抗氧化、促進成骨、增強免疫功能、改善心血管和腦血管功能、調節(jié)內分泌等多種藥理作用，是近幾年來國內外研究比較熱門的中藥單體。有研究證明，ICA能夠促進BMSCs增殖與分化[8-10]、還能夠在一定程度上抑制BMSCs凋亡，對抗有害因素給細胞造成的損傷，保護細胞及其部分特性[11]。本文通過研究ICA對5-FU誘導的大鼠BMSCs損傷的影響，探討ICA對5-FU所致大鼠BMSCs損傷的保護作用及其機制，為中西醫(yī)結合防治臨床腫瘤化療引起的骨髓抑制及相關疾病提供實驗依據與理論指導。

1 材料與方法

1.1 動物4周齡 SD ♂大鼠，SPF級，體質量為(80～90) g，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，使用許可證號：SYXK(粵)2018-0085，購入后直接用于取材，原代BMSCs 培養(yǎng)。

1.2 藥物試劑ICA(icariin，中國食品藥品檢定研究院)；5-氟尿嘧啶(Solarbio公司，1126A023)；SD大鼠 BMSCs專用培養(yǎng)基(Cyagen公司，T161122G001)、胰蛋白酶(Gibco公司， 19521H12)；單克隆抗體CD90、CD45(Santa Cruz公司，sc-19615、sc-18914)，caspase-3抗體(Abcam公司，ab2302)；NOS測定試劑盒、Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒(南京建成生物工程研究所，20161019、20161025)；Hoechst 33258試劑盒、caspase-3活性檢測試劑盒(碧云天生物技術)；其他試劑均為國產分析純。

1.3 儀器超凈工作臺(蘇州名牌之星凈化臺)；二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學儀器有限公司)；倒置顯微鏡(Olympus)；熒光細胞成像顯微鏡(美國Bio-Rad公司)；紫外可以分光光度計(日本島津公司)；分析天平(梅特勒公司)；流式細胞分析儀(美國BD公司)；Elx800型酶標儀(美國 Biotek 公司)；Experion型蛋白印記電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，多功能酶標儀(美國PerkinElmer公司)。

2 方法

2.1 BMSCs的取材、分離培養(yǎng)及純化SD大鼠處死，雙側股骨和脛骨在無菌狀態(tài)下分離，剪斷骨膜末端，露出骨髓腔。用基礎培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，將收集的細胞液800 r·min-1，離心8 min，棄上清，沉淀加入完全培養(yǎng)液，反復吹打均勻后轉移至培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后換液，之后每2 d換液一次。當細胞生長融合達80 %～90 %時，胰酶消化，1 ∶2傳代。

2.2 BMSCs的流式鑒定胰酶消化收集細胞并制成單細胞懸液，調整細胞數(shù)目1×109個/L，每管加入300 μL細胞懸液，分別加入抗體CD45-FITC、CD90-PE及同型對照抗體各5 μL，孵育30 min后，PBS洗滌重懸，過篩，上流式細胞儀進行測定。

2.3 實驗分組及給藥實驗根據隨機對照的原則分為3組：①空白對照組(正常組)：無特殊處理。②單用5-FU組(模型組)：5-FU的質量濃度為 2.5×10-2g·L-1(5-FU對大鼠BMSCs IC50值)。③5-FU +ICA共同作用組(實驗組)：MTT實驗中ICA的濃度為5、10、20、40、80 μmol·L-1，Hoechst 33258染色、Annexin V-FITC/PI，Western blot實驗中ICA的濃度為10和20 μmol·L-1。

2.4 MTT法檢測細胞存活率對數(shù)期細胞接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜后，按分組給藥。培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT(5 g·L-1)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，除去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，搖床振蕩10 min后，于酶標儀492 nm波長處讀取吸光值。取5孔吸光度(A)值的均數(shù)，按公式計算細胞存活率。

細胞存活率/%=(實驗孔A均值-空白孔的A均值)/(對照孔A均值-空白孔的A均值)×100 %

2.5 大鼠BMSCs凋亡過程細胞核形態(tài)檢測接種對數(shù)期細胞于6孔板內并繼續(xù)培養(yǎng)過夜，根據預先設置給藥，48 h后，吸去上清液，加入0.5 mL固定溶液。4 ℃固定，PBS洗滌細胞后，加入0.5 mL Hoechst 33258染色溶液，染色5 min后，PBS洗滌2次。加入抗熒光猝滅封閉液并混勻，于熒光顯微鏡下觀察檢測細胞核。

2.6 大鼠BMSCs凋亡過程流式檢測按實驗分組及給藥48 h后，將細胞上清培養(yǎng)液吸入離心管，貼壁細胞PBS洗滌、胰酶消化并收集至上述離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，除去上清液，收集沉淀并用PBS洗滌1次。按照Annexin V-FITC/PI試劑盒步驟對細胞進行處理，然后上機檢測，以分析不同凋亡階段的細胞，并進行各組間的比較。

2.7 Western blot法檢測Cleaved caspase-3蛋白水平以及caspase-3活性檢測試劑盒檢測 caspase-3酶活性6孔板內，種入細胞培養(yǎng)過夜，按實驗分組及給藥，48 h后，消化收集并裂解細胞，收集蛋白質樣品并予以定量。經電泳、轉膜、封閉后；再經一抗(1 ∶1 000)、二抗(1 ∶5 000)孵育，ECL化學熒光發(fā)光反應，將膜放至暗盒，顯影、定影?；叶葤呙鑳x掃描條帶，并使用Bandscan 4.30軟件分析條帶的光密度值。蛋白質的相對表達由目標蛋白質光密度值/內參蛋白光密度值表示。

按“2.2”的實驗分組和給藥，處理48 h后，離心收集細胞，PBS洗滌，冰浴裂解，取上清液進行caspase-3酶活性檢測。按照試劑盒步驟在反應體系中依次加入檢測緩沖液、樣品，適當混勻，隨后再加入10 μL Ac-DEVD-pNA(2 mmol·L-1)，37 ℃孵育。當顏色變化比較明顯時即可于酶標儀405 nm處測定各組樣品的吸光度(A)值，將樣品A值代入pNA標準曲線即可計算出各組樣品caspase-3催化產生的 pNA量。pNA的量/樣品蛋白含量即為單位重量蛋白所含caspase-3的酶活力單位，實驗重復3次。

2.8 NOS試劑盒檢測NOS含量按“2.2”的實驗分組和給藥，處理48 h后，每組取細胞上清液200 μL，分別用于TNOS和iNOS含量檢測。根據NOS 測定試劑盒操作步驟：TNOS測定，空白管和測定管分別加入雙蒸水、雙蒸水和細胞上清液各100 μL；iNOS測定，空白管和測定管分別加入雙蒸水和試劑六各100 μL、細胞上清液和試劑六各100 μL。所有試管置于試管架并搖勻，各管分別依次加入試劑一、二、三，混勻，37 ℃水浴15 min，各管依次加入試劑四、五，混勻，以蒸餾水調零于530 nm處測定各管吸光度值。

3 結果

3.1 BMSCs的形態(tài)觀察本實驗采用全骨髓培養(yǎng)法，根據干細胞生長特性來分離、提純BMSCs。剛取材培養(yǎng)的細胞呈球形懸浮于培養(yǎng)液，并混有少量血細胞等雜質細胞。接種后的24 h內，大量細胞被貼壁情況良好，但是有少量血細胞附著在培養(yǎng)瓶壁上，能夠通過更換培養(yǎng)液逐漸去除。3 d后，貼壁細胞明顯增加，并以紡錘體或多邊形形態(tài)增殖，分布不均，形成多個增殖群。如Fig 1所示，在7～14 d后，細胞逐漸聚合，能夠傳代。

Fig 1 Morphology of BMSCs on 8th dayunder primary culture(×200)

3.2 BMSCs的鑒定第3代細胞的流式細胞儀檢測結果表明，純化培養(yǎng)的BMSCs均一表達CD90，陽性率為99.7%，而CD45陽性率僅為1.59%，呈陰性，表明本實驗分離培養(yǎng)的細胞確為BMSCs，見Fig 2。

Fig 2 Surface marker expression of BMSCs

3.3 ICA對大鼠BMSCs增殖的影響用5、10、20、40和80 μmol·L-1ICA作用大鼠BMSC 48 h后，大鼠BMSCs的存活率分別為(99.7±2.80) %、(103.1±6.20) %、(107.6±9.98) %、(107.3±4.42) %和(89.0±6.49) %。與對照組(99.9±4.20) %比較，5 μmol·L-1ICA對大鼠BMSCs的增殖無明顯影響，10、20、40 μmol·L-1ICA可一定促進大鼠BMSCs增殖，而80 μmol·L-1ICA則對大鼠BMSCs具有一定的細胞毒性作用，可抑制大鼠BMSCs的增殖，見Fig 3。

Fig 3 Effect of different concentrationsof ICA on proliferation of

3.4 ICA對5-FU誘導的大鼠BMSCs損傷的影響由Fig 4可知：與正常對照組相比，模型組細胞活性明顯下降。與模型組相比，ICA給藥組細胞活性顯著增加，說明ICA對5-FU抑制BMSCs增殖有明顯的拮抗作用。5 μmol·L-1ICA組有一定拮抗作用，但是較弱，10、20、40 μmol·L-1ICA組可明顯拮抗，其增殖率接近甚至高于正常對照組，而80 μmol·L-1ICA組增殖率低于模型組，可能是因為其對大鼠BMSCs細胞毒性作用與5-FU的損傷作用相疊加，顯著抑制了大鼠BMSCs的增殖。

Fig 4 Effect of different concentrations of ICA on proliferationof BMSCs injured by #P<0.05 vs control; *P<0.05, **P<0.01 vs 5-FU model

3.5 ICA對5-FU誘導的大鼠BMSCs凋亡的細胞形態(tài)影響Hoechst 33258是一種核酸染料，可以穿透細胞膜并與細胞核DNA相互嵌合。正常細胞的膜膜完整性較好，染色質分布均勻，因此在熒光顯微鏡下可見正常細胞的細胞核呈現(xiàn)均一的淡藍色；凋亡細胞膜通透性增強，染色體DNA固縮甚至斷裂，因而細胞核呈致密濃染亮藍色或顆粒狀熒光。在熒光顯微鏡下，正常對照組中BMSCs的染色質以擴散均勻的低強度熒光均勻分布(Fig 5A)。5-FU模型組中的BMSCs具有大量細胞凋亡，細胞核致密或粒狀熒光(Fig 5B)，細胞數(shù)量明顯低于正常組。而與模型組比較， 10、20 μmol·L-1ICA組內的大鼠BMSCs細胞核致密或顆粒熒光的細胞數(shù)量均有降低，大多數(shù)細胞呈彌散均勻的低強度熒光(Fig 5C、D)，趨向正常組。初步表明，5-FU具有促進大鼠 BMSCs 凋亡的作用，ICA可抑制5-FU誘導的大鼠BMSCs的凋亡。

Fig 5 Apoptosis morphology of BMSCs in different groups(Hoechst 33258, Bar=25μm)A:Control;B:5-FU;C:5-FU+ICA10 μmol·L-1;D:5-FU+ICA20 μmol·L-1

3.6 ICA對5-FU誘導的大鼠BMSCs凋亡率的影響為了確定ICA對BMSCs的抗凋亡作用，根據“3.4”的實驗結果，本實驗進一步檢測10、20 μmol·L-1ICA組對5-FU化療損傷大鼠BMSCs細胞凋亡率的情況。Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒測定結果發(fā)現(xiàn)：相對于對照組，模型組早晚期凋亡率均顯著升高；10、20 μmol·L-1ICA干預后，與模型組相比，兩組BMSCs早期和晚期凋亡率均顯著減少，差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見Fig 6。

Fig 6 Effect of ICA on cell apoptosis induced by 5-FUin BMSCs detected by flow ##P<0.01 vs control; **P<0.01 vs 5-FU model

3.7 ICA對5-FU誘導大鼠BMSCs凋亡過程中caspase-3活性的影響蛋白免疫印跡分析顯示(Fig 7A、B)：ICA處理組的Cleaved caspase-3蛋白表達水平比模型組要低，甚至基本接近正常組(P<0.01)。分光光度法檢測各組caspase-3活性，結果顯示，與正常對照組比較，模型組細胞 caspase-3 活性明顯升高，ICA實驗組caspase-3活性與模型組比較明顯降低(P<0.05)，如Fig 7C。 提示ICA其對BMSCs的保護作用可能與抑制caspase-3的活化有關。

3.8 ICA對5-FU誘導大鼠BMSCs細胞凋亡過程中iNOS、TNOS活力的影響從實驗結果來看，和正常對照組相比，模型組細胞上清液iNOS活性明顯高于正常對照組，分別加入10 μmol·L-1和20 μmol·L-1ICA干預后，實驗組iNOS活力與模型組比較顯著下降(P<0.05)。TNOS呈現(xiàn)相同的變化趨勢，提示5-FU化療損傷是可能是通過激活 NOS引起NO的增加，從而通過NO通路促使BMSCs的凋亡。而ICA是降低了NOS的表達，抑制NO生成，從而達到保護BMSCs損傷的效果。

Fig 7 Effects of ICA on cleaved caspase-3 expressionand caspase-3 activity of BMSCs injury induced

##P<0.01 vs control; **P<0.01 vs 5-FU model

Fig 8 Effects of ICA on enzyme activity of TNOS and iNOSof BMSCs injury induced by #P<0.05, ##P<0.01 vs control; *P<0.05,**P<0.01 vs 5-FU model

4 討論

5-FU是目前在臨床上使用非常廣泛的抗嘧啶藥物，對消化道癌癥等實體瘤具有非常好的效果，在腫瘤的醫(yī)學治療里面發(fā)揮著重要作用。但是其毒性呈劑量依賴性，高劑量化療不僅能殺死腫瘤細胞，而且還能出現(xiàn)骨髓抑制的副作用，它不只是損害造血細胞，還損害BMSCs。BMSCs的損傷會影響化療后受抑骨髓的造血恢復，增加患者的臨床風險。中藥作為一種輔助化療藥物，在腫瘤治療中擁有特殊的優(yōu)勢，特別是在減輕化療藥物的毒副作用、提升化療藥物的療效與患者化療前后的生活品質等方面具有顯著的效果。聯(lián)合用藥可以有效降低化療藥物給身體帶來的影響。

本研究MTT實驗結果初步表明，一定濃度的 ICA可促進大鼠BMSCs增殖對5-FU抑制BMSCs增殖有明顯的拮抗作用。Hoechst 33258熒光染色和Annexin V-FITC凋亡檢測結果顯示：用ICA處理過的BMSCs，凋亡細胞以及凋亡率相比模型組有明顯的降低，初步說明ICA可抑制5-FU化療損傷誘導的BMSCs凋亡的發(fā)生，對BMSCs具有保護作用。caspase-3是細胞凋亡過程中最關鍵的執(zhí)行分子之一， caspase-3的激活常被作為細胞凋亡的一個重要指標。模型組的Cleaved caspase-3的蛋白表達水平比加ICA干預實驗組的caspase-3明顯要高。由此實驗結果表明，5-FU通過激活caspase-3來實現(xiàn)誘導BMSCs凋亡從而造成化療損傷，ICA可通過抑制caspase-3的活化，從而起到保護BMSCs的作用。

一氧化氮( nitric oxide，NO)是人體內細胞間信息傳遞的重要調節(jié)因子，它能夠調節(jié)體內能量代謝、細胞凋亡、炎癥和其他的關鍵途徑[12]。在體內，NOS是體內催化L-精氨酸生成NO的關鍵酶。目前已知的NOS主要類型有4種，介導NO合成的限速酶是iNOS[13]。在正常條件中iNOS并不會表達或者少量表達，不過，在病理或者藥物作用下，細胞能夠誘導它們的合成，iNOS一旦合成，即可大量生成NO。這些NO 能導致大量的ROS產生，ROS 可以引起脂質過氧化[14]，造成細胞的氧化損傷，這說明NOS的表達和活性與細胞的增殖凋亡有關。ICA是一種異黃酮化合物，其抗氧化作用主要與其清除活性氧自由基有關。本研究結果顯示：5-FU可誘導BMSCs細胞內TNOS、iNOS活性升高，而ICA共處理組細胞內TNOS、iNOS酶活性相比模型組降低，表明ICA具有抑制BMSCs細胞內TNOS、iNOS酶活性的作用，從而減少NO的生成，抑制細胞凋亡，保護BMSCs的作用。綜上所述，本研究表明一定濃度的ICA可促進BMSCs增殖，拮抗5-FU引起的BMSCs增殖抑制作用，這種拮抗作用可能是通過降低BMSCs細胞內NOS活性，減少NO的生成，抑制caspase-3的激活，從而抑制5-FU誘導的細胞凋亡的發(fā)生，達到保護BMSCs的作用。