郝吉慶,程浩,高薇薇,孫翠蘭

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科, 安徽 合肥 230022)

肺癌是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC))占85%。NSCLC主要包括肺腺癌和鱗癌，其5年生存率大約為15%[1]。多西他賽屬于微管解聚抑制劑，是NSCLC患者的標(biāo)準(zhǔn)二線化療藥物[2]。纖維蛋白原樣蛋白1(fibrinogen-like protein 1，F(xiàn)GL1)是肝臟分泌的一種可促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的特異生長(zhǎng)因子，且在正常肝組織、腫瘤細(xì)胞和組織內(nèi)呈過(guò)表達(dá)狀態(tài)[3-4]。生理?xiàng)l件下，F(xiàn)GL1主要以自分泌的形式促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂增殖[5]。目前，有關(guān)FGL1與多西他賽等藥物敏感性的研究較少。本研究旨在探討FGL1在人肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C-9中的表達(dá)情況及其對(duì)肺癌細(xì)胞多西他賽敏感性的影響，為提高多西他賽的臨床療效提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B及人肺腺癌PC9細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2藥物與試劑 多西他賽購(gòu)于北京索萊寶有限公司(貨號(hào)ID0400)，胎牛血清購(gòu)自Gibco(貨號(hào)10270106)，RPMI培養(yǎng)基購(gòu)自Hylcone(貨號(hào)SH30022.02)，CCK-8 試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技公司(貨號(hào)CA12110)、二喹啉甲酸(Bicinchoninicacid，BCA)試劑盒均購(gòu)自Beyotime(貨號(hào)P0010S);實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒TBGreen購(gòu)自日本 TaKaRa公司(貨號(hào)RR820A),β-actin抗體購(gòu)自Proteintech公司(貨號(hào)60008-1-lg)，F(xiàn)GL1 抗體購(gòu)自Abcam公司(貨號(hào)ab197357),FGL1-siRNA重組序列、隨機(jī)陰性對(duì)照序列由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)及合成。FGL1靶點(diǎn)序列GAPDH序列見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 The primer sequence of FGL1 and GAPDH

1.1.3儀器 超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)，恒溫水浴箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠)，低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Heraeus 公司)，普通離心機(jī)(德國(guó)Heraeus 公司400e型)，電泳儀(美國(guó)Bio-rad公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-rad公司),純水器(美國(guó) Millipore 公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞和人肺腺癌PC-9細(xì)胞分別在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基和RPIM培養(yǎng)基中，置于 37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)多西他賽對(duì)細(xì)胞的抑制率 將實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組?？瞻讓?duì)照組只加培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組加細(xì)胞懸液不加藥，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后貼壁，加入不同濃度(0、5、10、20、40、80 μmol·L-1)多西他賽分別作用于人肺腺癌PC-9細(xì)胞24 h和48 h，制備單細(xì)胞懸液，以5×104個(gè)/mL的濃度，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL(邊緣孔用無(wú)菌PBS填充)；終止試驗(yàn)前4 h在每個(gè)孔內(nèi)加入CCK-8(5 g·L-1)；酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔OD值(A值)。抑制率/%=[1-(藥物處理組A值-空白對(duì)照組A值)/(細(xì)胞對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值)]×100%。計(jì)算出半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration，IC50)。

1.2.3蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)FGL1蛋白表達(dá) 細(xì)胞中加入適量的裂解液，裂解完全后離心，取上清，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，蛋白液與上樣緩沖液充分混勻，100 ℃加熱10 min，每泳道加入 40 μg樣品進(jìn)行8% SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉1 h后，F(xiàn)GL1和GAPDH抗體均按照1 ∶1 000稀釋?zhuān)? ℃孵育一抗過(guò)夜。4 ℃取出膜，吐溫PBS清洗，加入按照1 ∶10 000稀釋二抗(HRP 標(biāo)記的二抗)，室溫孵育90 min，洗膜，化學(xué)發(fā)光法在紫外凝膠成像儀上進(jìn)行拍照分析。FGL1的相對(duì)表達(dá)量通過(guò)FGL1的灰度值除以GAPDH 的灰度值計(jì)算。

1.2.4逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺腺癌PC-9細(xì)胞消化后接種至6孔板中，使細(xì)胞密度能夠達(dá)到80%～90%。收集細(xì)胞，使用TRIzol、氯仿和異丙醇等試劑提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，F(xiàn)GL1和內(nèi)參GAPDH的引物序列見(jiàn)Tab 1。以cDNA 為模板用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)總體積20 μL，PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，之后95 ℃、10 s，60 ℃退火40 min，共40個(gè)循環(huán)，每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用由公式Folds=2-△△CT計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 PC-9細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前1 d消化收集，制備細(xì)胞懸液，接種細(xì)胞至6孔板中，使轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度能夠達(dá)到40%～60%，實(shí)驗(yàn)分為空白組(Control組)，陰性對(duì)照組(FGL1siNC組)，F(xiàn)GL1siRNA實(shí)驗(yàn)組?？瞻捉M不經(jīng)任何處理，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染FGL1siRNA。嚴(yán)格按照l(shuí)ipofectamineTM2000試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，用Opti-MEM(Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，于37 ℃、5% CO2轉(zhuǎn)染6 h后每組加入完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞。采用熒光倒置顯微鏡觀察各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)觀察其形態(tài)學(xué)變化，判斷轉(zhuǎn)染效率，通過(guò)Western-blot法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

2 結(jié)果

2.1 BEAS-2B、PC-9細(xì)胞中FGL1的差異表達(dá)以人正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞作為對(duì)照，通過(guò)Western blot法檢測(cè)FGL1蛋白在人肺腺癌PC-9細(xì)胞中的表達(dá)，見(jiàn)Fig 1。與BEAS-2B 細(xì)胞中FGL1蛋白表達(dá)量相比，PC-9 細(xì)胞FGL1相對(duì)表達(dá)量為(1.42±0.014)，明顯高于BEAS-2B細(xì)胞，差異具有顯著性(P<0.01)。

Fig 1 Differential expression of FGL1 in BEAS-2B and PC-9 A：Western blot assay was used to detect the expression difference of FGL1 protein in BEAS-2B cells and PC-9 cells; B: The relative level of FGL1 protein in BEAS-2B cells and PC-9 cells.**P<0.01 vs BEAS-2B group

2.2 不同濃度多西他賽對(duì)人肺腺癌PC-9細(xì)胞的增殖抑制作用CCK-8試劑盒檢測(cè)多西他賽對(duì)人肺腺癌PC-9細(xì)胞增殖抑制作用并計(jì)算IC50值，F(xiàn)ig 2結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度多西他賽對(duì)PC-9細(xì)胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。作用24 h時(shí)，藥物的IC50值是29.48 μmol·L-1；而作用48 h時(shí)，藥物的IC50值是5.88 μmol·L-1，提示多西他賽對(duì)PC-9細(xì)胞的增殖抑制作用可能有一定的時(shí)間依賴性。且與陰性對(duì)照組相比，差異具有顯著性(P<0.01)。

Fig 2 The inhibitory effect of docetaxel at different concentrations on PC-9 cells proliferation after 24 hours and 48 **P<0.01 vs control group

2.3 多西他賽增強(qiáng)人肺腺癌PC-9細(xì)胞中FGL1的表達(dá)不同濃度多西他賽作用于人肺腺癌PC-9細(xì)胞24 h后，以Western blot 法檢測(cè)FGL1蛋白的表達(dá)情況，F(xiàn)ig 3A、3B發(fā)現(xiàn)，隨著多西他賽濃度的增加，PC-9細(xì)胞中FGL1蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)，且各個(gè)濃度組與對(duì)照組相比，差異均具有顯著性。進(jìn)一步采用RT-PCR檢測(cè)FGL1 mRNA的表達(dá)情況(Fig 3C)。當(dāng)多西他賽濃度為5 μmol·L-1時(shí)，F(xiàn)GL1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為(1.08±0.023)(P<0.05); 當(dāng)多西他賽濃度為40 μmol·L-1時(shí), FGL1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為(1.62±0.013)(P<0.01)，與對(duì)照組相比差異均具有顯著性。

2.4 轉(zhuǎn)染FGL1 siRNA后對(duì)PC-9細(xì)胞中的FGL1蛋白表達(dá)的影響轉(zhuǎn)染FGL1 siRNA 48 h后，用Western blot法檢測(cè)人肺腺癌PC-9細(xì)胞中FGL1蛋白表達(dá)，見(jiàn)Fig 4。轉(zhuǎn)染組siRNA1的 FGL1相對(duì)表達(dá)量與陰性對(duì)照組相比降至(0.865±0.045)倍，差異無(wú)顯著性(P>0.05)；轉(zhuǎn)染組siRNA2中FGL1相對(duì)表達(dá)量與陰性對(duì)照組相比降至(0.427±0.0025)倍，差異具有顯著性(P<0.01)。選取轉(zhuǎn)染效果較好的FGL1siRNA-2序列用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig 3 Effect of docetaxel on FGL1 expression in human lung A: The effect of docetaxel on FGL1 expression in human lung adenocarcinoma PC-9 cells by Western blot;B: The relative expression level of FGL1 protein in human lung adenocarcinoma cells PC-9 after 24 hours of docetaxel treatment; C: RT-PCR was used to detect the expression level of FGL1 mRNA in human lung adenocarcinoma PC-9 cells after docetaxel treatment.*P<0.05,**P<0.01 vs control group

2.5 沉默F(xiàn)GL1增強(qiáng)人肺腺癌PC-9細(xì)胞對(duì)多西他賽敏感性的作用不同濃度(0、5、10、20、40、80 μmol·L-1)多西他賽作用于人肺腺癌PC-9細(xì)胞24 h后，用CCK-8試劑盒檢測(cè)多西他賽對(duì)人肺腺癌PC-9細(xì)胞的增殖抑制作用，見(jiàn)Fig 5。FGL1 siRNA組藥物IC50值為2.91 μmol·L-1,與對(duì)照組相比差異具有顯著性(P<0.01)。而FGL1siNC組細(xì)胞IC50值為29.48 μmol·L-1，與對(duì)照組相比差異也具有顯著性(P<0.01)，表明FGL1 siRNA可增加多西他賽藥物的敏感性。

Fig 4 Effect of FGL1 siRNA transfection on expression of FGL1 protein in human lung adenocarcinoma PC-9 cell A:The transfection efficiency of FGL1 siRNA was observed with Western blot analysis in PC-9 cell line;B: The relative expression level of FGL1 protein after transfection in PC-9 cell line.**P<0.01 vs FGL1 siNC group

Fig 5 Effect of FGL1 silencing on sensitivity of PC-9 cells to **P<0.01 vs control group

3 討論

惡性腫瘤已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅中國(guó)人群健康的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，其中肺癌位居我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病首位[6-7]。NSCLC的二線化療標(biāo)準(zhǔn)方案包括多西他賽，其作用機(jī)理是加強(qiáng)微管蛋白聚合、抑制微管解聚作用，阻滯細(xì)胞于G2與M期，從而破壞腫瘤細(xì)胞的有絲分裂與增殖。多西他賽不僅可導(dǎo)致細(xì)胞分裂異常、紡錘體結(jié)構(gòu)的損傷而引起細(xì)胞死亡[8-9]，還可以在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)解除對(duì)肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)[10]，具有間接抑制血管新生功能。同時(shí)其還具有免疫調(diào)節(jié)能力，如增強(qiáng)腫瘤相關(guān)抗原的釋放，增加細(xì)胞的抗原呈遞和提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性[11]。但由于目前多西他賽對(duì)NSCLC療效尚不甚滿意，因此尋找新的干預(yù)手段以提高肺癌細(xì)胞對(duì)其敏感性，可能是一種治療肺癌的新策略和研究重點(diǎn)。

纖維蛋白原樣蛋白1(FGL1)，也稱(chēng)Hepassocin或肝細(xì)胞源性纖維蛋白原相關(guān)蛋白(HFREP-1)，是Yamamoto等[12]于1993年通過(guò)差減雜交的方法在肝癌中篩選的一種過(guò)表達(dá)基因，屬于纖維蛋白原家族，與羧基末端纖維蛋白β和γ亞基具有高氨基酸同源性，但它沒(méi)有纖維蛋白凝塊形成所必須的特征性血小板、交聯(lián)區(qū)域和凝血酶敏感結(jié)合位點(diǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GL1 mRNA 在肺腺癌、前列腺癌和惡性黑色素瘤等多種腫瘤組織中表達(dá)均上調(diào)。此外，研究發(fā)現(xiàn)在小鼠腫瘤模型中體內(nèi)沉默F(xiàn)GL1基因可促進(jìn)T細(xì)胞的免疫而使腫瘤縮小，且通過(guò)基因芯片技術(shù)檢測(cè)到人肺腺癌組織中FGL1呈過(guò)表達(dá)狀態(tài)。推測(cè)FGL1是淋巴細(xì)胞活化基因3(lymphocyte-activation gene-3, LAG-3)的主要免疫抑制配體，F(xiàn)GL1可以通過(guò)LAG-3在體內(nèi)外抑制抗原介導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答，造成腫瘤免疫逃逸現(xiàn)象。此外有研究已證實(shí)FGL1在胃癌細(xì)胞和組織中高表達(dá)，且對(duì)胃癌的侵襲、遷移和增殖起促進(jìn)作用[13]。Nayeb-Hashemi等[14]在肝癌研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GL1是肝腫瘤細(xì)胞抑制因子，其丟失與分化程度低等相關(guān)[14]。但FGL1表達(dá)與化療藥物敏感性間的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)與正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞相比，F(xiàn)GL1在人肺腺癌PC-9細(xì)胞中呈高表達(dá)，通過(guò)轉(zhuǎn)染FGL1siRNA沉默F(xiàn)GL1表達(dá)可增加不同濃度多西他賽對(duì)人肺腺癌PC-9細(xì)胞的增殖抑制作用，且與對(duì)照組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P<0.01)，表明抑制人肺腺癌PC-9細(xì)胞中FGL1的表達(dá)有可能成為提高多西他賽藥物敏感性的有效策略。

綜上所述，F(xiàn)GL1在人肺腺癌PC-9細(xì)胞中呈高表達(dá)，沉默F(xiàn)GL1表達(dá)可增強(qiáng)人肺腺癌細(xì)胞PC-9對(duì)多西他賽的敏感性，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。但FGL1對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡、侵襲和遷移有何影響及可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。