高天紅,董培智,樸晉華,張志偉

(山西省食品藥品檢驗(yàn)所，太原 030031)

紅花注射液是紅花經(jīng)提取而成的滅菌水溶液，具有活血化瘀之功效，臨床上主要用于閉塞性腦血管、冠心病和脈管炎等疾病的治療[1]，其臨床功效、作用特點(diǎn)和作用機(jī)制都較為明確?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明紅花能夠減輕缺血性損傷、改善心腦血氧供應(yīng)、抗心肌缺血、抗凝血、抑制血小板聚集，并具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤等作用[2]，從紅花中分離得到的化學(xué)成分有醌式查爾酮苷類、黃酮類等多種活性成分。鑒于紅花成分的多樣性和藥理作用多組分、多靶點(diǎn)的協(xié)同性, 現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用的形態(tài)學(xué)鑒定、化學(xué)定性鑒別、指紋圖譜及指標(biāo)性成分檢測(cè)，難以揭示其全部有效成分或特征成分，也難以表征理化成分與生物活性之間的相關(guān)性。生物活性的存在是實(shí)現(xiàn)藥效作用的前提和基礎(chǔ)，為使紅花注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)能更好保證臨床使用安全有效，在理化檢測(cè)的基礎(chǔ)上，增加特定中藥生物活性的測(cè)定，以綜合評(píng)價(jià)其產(chǎn)品質(zhì)量[3]。研究采用膠原-腎上腺素誘導(dǎo)小鼠急性腦血栓模型，以紅花注射液對(duì)小鼠的偏癱保護(hù)率作為指標(biāo)來(lái)考察紅花注射液的抗血栓生物活性，為紅花注射液生物活性限值測(cè)定方法的建立提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑膠原蛋白：COLLAGEN Bovine Achilles Tendon，Worthington公司，批號(hào)35E8048-C，規(guī)格1 mL：1 mg；鹽酸腎上腺素注射液：天津金耀氨基酸有限公司，規(guī)格1 mL：1 mg，批號(hào)：0808282。

膠原蛋白-腎上腺素混合溶液配制：稱取膠原蛋白15.00 mg，浸泡于10 mL生理鹽水中4 h以上，研磨至溶液呈懸浮狀態(tài)，3 000 r·min-1離心5 min，取上清液；另取1 g·L-1的腎上腺素0.5 mL，加入上清液中；加生理鹽水至25 mL，制得0.6 g·L-1膠原蛋白-0.02 g·L-1腎上腺素溶液。

1.2 藥品紅花注射液：5個(gè)企業(yè)、5個(gè)批次。每支裝10 mL，山西A企業(yè)，批號(hào)：H-1；每支裝20 mL，湖北B企業(yè)，批號(hào)：H-2；每支裝20 mL，四川C企業(yè)，批號(hào)：H-3；每支裝20 mL，湖北D企業(yè)，批號(hào)：H-4；每支裝5 mL，山西E企業(yè)，批號(hào)：H-5。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠560只，清潔級(jí)，雄性，體質(zhì)量(22±2)g，來(lái)源：解放軍醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(京)2007-004號(hào)；山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第070102。BALB/C種小鼠20只，清潔級(jí)，雄性，體質(zhì)量(22±2)g，來(lái)源：山西省腫瘤醫(yī)院。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXY(晉)2009-0001，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)試驗(yàn)室環(huán)境至少1周，自由取食、飲水，期間進(jìn)行檢疫，動(dòng)物室維持12 h 照明，溫度(21±4)℃，相對(duì)濕度(50±20)%。

2 方法

2.1 抗小鼠體內(nèi)血栓形成試驗(yàn)[4-8]

2.1.1急性缺血模型制備 將血栓誘導(dǎo)劑尾靜脈注射至小鼠體內(nèi)(0.1 mL·10 g-1)，造成小鼠血栓模型。

2.1.2試驗(yàn)方法 小鼠按體重隨機(jī)分組，每組10只，分別為對(duì)照組、紅花注射液組(10 mL·kg-1)，各組小鼠連續(xù)腹腔注射給藥，對(duì)照組給予同體積0.9%氯化鈉溶液，1 次·d-1，于末次給藥后尾靜脈注射膠原蛋白混合誘導(dǎo)劑造模，注射后即觀察5 min內(nèi)小鼠死亡數(shù)及15 min內(nèi)小鼠偏癱未恢復(fù)數(shù)，結(jié)果以卡方測(cè)驗(yàn)(確切概率法)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算各組小鼠的偏癱恢復(fù)率及供試品對(duì)抗小鼠體內(nèi)血栓形成的保護(hù)率。

2.1.3統(tǒng)計(jì)方法及結(jié)果判定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，動(dòng)物死亡與否為計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，采用卡方檢驗(yàn)(準(zhǔn)確概率法) 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。供試品組與對(duì)照組比較，15 min內(nèi)小鼠偏癱恢復(fù)數(shù)增加并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且供試品組對(duì)抗小鼠體內(nèi)血栓形成的保護(hù)率不低于50%，則判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。

2.1.4造模后小鼠恢復(fù)率、保護(hù)率的計(jì)算公式

2.2 試驗(yàn)系考察

2.2.1給藥周期的選擇 按2.1試驗(yàn)方法，紅花注射液批號(hào)為H-1批，取昆明種小鼠40只，隨機(jī)分為4組，即紅花注射液?jiǎn)未谓o藥1 d組、多次給藥3 d組、多次給藥5 d 組和對(duì)照組，紅花注射液的給藥劑量為10 mL·kg-1(5 g生藥·kg-1)，分別于給藥 第1、3、5 d后尾靜脈注入膠原0.6 g·L-1-腎上腺素0.02 g·L-1混合溶液0.1 mL·10 g-1，觀察5 min內(nèi)小鼠死亡數(shù)及15 min內(nèi)小鼠偏癱未恢復(fù)數(shù)。

2.2.2膠原蛋白-腎上腺素混合誘導(dǎo)劑實(shí)驗(yàn)敏感劑量的選擇 按2.1試驗(yàn)方法，紅花注射液批號(hào)為H-1批，取昆明種小鼠80只，紅花注射液10 mL·kg-1(5 g生藥·kg-1)連續(xù)給藥3 d后尾靜脈注入不同濃度膠原蛋白-腎上腺素混合溶液0.1 mL·10 g-1，觀察5 min內(nèi)小鼠死亡數(shù)及15 min內(nèi)小鼠偏癱未恢復(fù)數(shù)。

2.2.3給藥劑量及給藥后造模時(shí)間的考察

2.2.3.1正交試驗(yàn)選擇最佳給藥劑量和給藥后造模時(shí)間 按2.1試驗(yàn)方法，紅花注射液批號(hào)為H-1批，取昆明種小鼠100只，連續(xù)給藥3 d后尾靜脈注入膠原0.6 g·L-1-腎上腺素0.02 g·L-1混合溶液0.1 mL·10 g-1，選用正交設(shè)計(jì)表 L9(32)，以紅花注射液不同給藥劑量及給藥后造模時(shí)間為影響因素，以供試品抗小鼠體內(nèi)血栓形成的保護(hù)率為考察指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)表見(jiàn)Tab 3。

2.2.3.2正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證 由正交試驗(yàn)結(jié)果分別選擇最差實(shí)驗(yàn)控制條件A1B3(1.67 g·kg-1劑量；給藥后60 min造模)和最好實(shí)驗(yàn)控制條件A3B2(5 g·kg-1劑量；給藥后45 min造模)，取紅花注射液H-1批連續(xù)給藥3 d，末次給藥45 min后尾靜脈注入膠原0.6 g·L-1-腎上腺素0.02 g·L-1混合溶液0.1 mL·10 g-1，按2.1試驗(yàn)方法進(jìn)行重復(fù)。

2.2.4不同品系小鼠的考察 按2.1試驗(yàn)方法，紅花注射液批號(hào)為H-1批，取昆明種、BALB/C 小鼠各20只，紅花注射液5 g生藥·kg-1劑量給藥3 d，末次給藥后45 min尾靜脈注入膠原0.6 g·L-1-腎上腺素0.02 g·L-1混合溶液0.1 mL·10 g-1，即刻觀察5 min內(nèi)小鼠死亡數(shù)及15 min內(nèi)小鼠偏癱未恢復(fù)數(shù)，比較不同品系小鼠對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.2.5試驗(yàn)系的確定 依照試驗(yàn)系考察結(jié)果，確定試驗(yàn)最佳條件。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證[9-11]

2.3.1重復(fù)性考察 取紅花注射液H-1批，按2.1試驗(yàn)方法和2.2.5確定的試驗(yàn)條件重復(fù)6次試驗(yàn)。

2.3.2中間精密度考察 取紅花注射液H-1批，分別改變實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部條件(不同人員、不同工作日和試驗(yàn)時(shí)間)，按2.1試驗(yàn)方法和2.2.5確定的試驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)。

2.3.3重現(xiàn)性考察 取紅花注射液H-1批，按2.1試驗(yàn)方法和2.2.5確定的試驗(yàn)條件分別在不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。

2.4 不同批號(hào)紅花注射液抗血栓活性的考察取5批紅花注射液，按2.1試驗(yàn)方法和2.2.5確定的試驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 試驗(yàn)系的考察

3.1.1給藥周期的選擇 Tab 1結(jié)果顯示，造模后對(duì)照組小鼠10只死亡，死亡率100%，各紅花注射液給藥組小鼠死亡數(shù)減少、15 min偏癱恢復(fù)數(shù)增加，單次給藥1 d組恢復(fù)1只小鼠、保護(hù)率為10%,多次給藥3 d組和多次給藥5 d 組分別恢復(fù)6只、7只小鼠、保護(hù)率分別為60%、70%，與對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.01)。

Tab 1 Effect of administration cycle on test results

**P<0.01vscontrol

3.1.2膠原蛋白—腎上腺素混合誘導(dǎo)劑實(shí)驗(yàn)敏感劑量的選擇 Tab 2結(jié)果顯示，隨混合誘導(dǎo)劑劑量降低，對(duì)照組小鼠死亡數(shù)減少、15 min偏癱恢復(fù)數(shù)增加，紅花注射液各誘導(dǎo)劑組小鼠恢復(fù)數(shù)基本一致。與同誘導(dǎo)劑劑量對(duì)照組相比，紅花注射液膠原0.60 g·L-1-腎上腺素0.02 g·L-1誘導(dǎo)組、膠原0.54 g·L-1-腎上腺素0.018 g·L-1誘導(dǎo)組和膠原0.48 mg·L-1-腎上腺素0.016 g·L-1誘導(dǎo)組小鼠的偏癱恢復(fù)數(shù)有顯著性差異(P<0.05或0.01)；膠原0.42 g·L-1-腎上腺素0.014 g·L-1誘導(dǎo)組小鼠恢復(fù)數(shù)與其他組基本一致，與同誘導(dǎo)劑劑量對(duì)照組比較沒(méi)有差異，保護(hù)率為33%。

Tab 2 Effects of different doses of inducer on test results(n=10)

**P<0.01vscontrol；*P<0.05vscontrol

3.1.3給藥劑量及給藥后時(shí)間的考察

3.1.3.1正交試驗(yàn)選擇最佳的給藥劑量和給藥后造模時(shí)間 Tab 4、5結(jié)果顯示，給藥劑量和給藥后造模時(shí)間對(duì)抗小鼠體內(nèi)血栓形成的保護(hù)率均有明顯影響(P<0.05)，影響的主次順序?yàn)榻o藥劑量>給藥后造模時(shí)間。經(jīng)方差分析，給藥劑量三水平之間差異明顯，給藥后造模時(shí)間三水平之間差異明顯。直接觀察9組數(shù)據(jù)，最好試驗(yàn)條件為8號(hào)(A3B2)、其保護(hù)率為78%，最差試驗(yàn)條件分別為1號(hào)(A1B1)、3號(hào)(A1B3)和6號(hào)(A2B3)，保護(hù)率為11%。經(jīng)計(jì)算分析最佳試驗(yàn)條件為A3B2，即小鼠以5 g·kg-1劑量腹腔注射給藥，并于給藥后45 min尾靜脈注射膠原-腎上腺素誘導(dǎo)造模；最差試驗(yàn)條件為A1B3，即小鼠以1.67 g·kg-1劑量腹腔注射給藥，并于給藥后60 min尾靜脈注射膠原-腎上腺素誘導(dǎo)造模。直接觀察與計(jì)算結(jié)果一致。

Tab 3 L9(32) Table of factor-level

Tab 4 Direct-viewing analysis of Orthogonal experiment

**P<0.01vscontrol；*P<0.05vscontrol

Tab 5 Variance analysis of orthogonal experiment

3.1.3.2正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證 Tab 6驗(yàn)證結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果相符，在A1B3試驗(yàn)條件下小鼠偏癱恢復(fù)3只，與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異，保護(hù)率為13%；在A3B2(5 g·kg-1劑量；給藥后45 min造模)試驗(yàn)條件下小鼠偏癱恢復(fù)7只，與對(duì)照組相比有顯著差異性(P<0.05)，保護(hù)率為63%。

Tab 6 Verification of orthogonal experiment

*P<0.05vscontrol

3.1.4不同品系小鼠的考察 紅花注射液對(duì)遠(yuǎn)交群(昆明種)和近交系(BALB/C)小鼠體內(nèi)血栓形成有明顯的保護(hù)作用(P<0.05)，小鼠偏癱恢復(fù)數(shù)與對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.05)，保護(hù)率分別為55%和62%。

3.1.5確定試驗(yàn)系 取健康合格，體質(zhì)量(20～24) g，同一來(lái)源的昆明種雄性小鼠，按體重隨機(jī)分為2組，每組不少于10只。每日于大致相同的時(shí)間分別給每鼠腹腔注射0.1 mL·10 g-1(5.0 g生藥·kg-1)紅花注射液或等體積0.9%氯化鈉溶液，每日1次，連續(xù)注入3次，于末次注入45 min后尾靜脈注射膠原0.60 g·L-1-腎上腺素0.02 g·L-1造成小鼠急性腦血栓模型，即刻觀察5 min內(nèi)小鼠死亡數(shù)及15 min內(nèi)小鼠偏癱未恢復(fù)數(shù)，采用卡方檢驗(yàn)(準(zhǔn)確概率法)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算各組小鼠的偏癱恢復(fù)率及供試品對(duì)小鼠體內(nèi)血栓的保護(hù)率。對(duì)照組動(dòng)物偏癱恢復(fù)率控制在不大于20%條件下，供試品組與對(duì)照組比較，小鼠偏癱恢復(fù)數(shù)增加并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且供試品組體內(nèi)血栓形成的保護(hù)率不低于50%，則判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。以紅花注射液5.0 g生藥·kg-1劑量作為生物活性試驗(yàn)的檢測(cè)限值。

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

3.2.1重復(fù)性考察 Tab 8結(jié)果顯示，6次試驗(yàn)對(duì)照組動(dòng)物偏癱恢復(fù)率均不大于20%，供試品組與對(duì)照組相比小鼠偏癱恢復(fù)數(shù)差異有顯著性(P<0.05或0.01)，保護(hù)率均不低于50%，以保護(hù)率計(jì)算RSD值，為10.0%，重復(fù)性較好。

Tab 7 Effect of different strains of mice on test results

*P<0.05vscontrol

**P<0.01vscontrol；*P<0.05vscontrol

3.2.2中間精密度考察 Tab 9結(jié)果顯示，A、B、C三位實(shí)驗(yàn)人員、分別在第1、8、15工作日的不同工作時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)，各對(duì)照組動(dòng)物偏癱恢復(fù)率均不大于20%，各供試品組與對(duì)照組相比小鼠偏癱恢復(fù)數(shù)差異有顯著性(P<0.05或0.01)，保護(hù)率均不低于50%，中間精密度較好。

Tab 9 Intermediate precision inspection test results

*P<0.05vscontrol,**P<0.01vscontrol

3.2.3重現(xiàn)性考察 Tab 10結(jié)果顯示，在不同實(shí)驗(yàn)室分別進(jìn)行試驗(yàn)，各對(duì)照組動(dòng)物偏癱恢復(fù)率均不大于20%，各供試品組與對(duì)照組相比小鼠偏癱恢復(fù)數(shù)差異有顯著性(P<0.05或0.01)，保護(hù)率均不低于50%，重現(xiàn)性較好。

Tab 10 Reproducibility inspection test results

*P<0.05vscontrol,**P<0.01vscontrol

Tab 11 Experimental results of acute cerebral thrombosis in mice

*P<0.05vscontrol,**P<0.01vscontrol

3.3 不同批號(hào)紅花注射液抗血栓活性的考察5批紅花注射液中，H-1、H-2、H-4批樣品小鼠15 min偏癱恢復(fù)數(shù)明顯增加，與對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.05或0.01)，保護(hù)率為52%、71%、62%，表明H-1、H-2、H-4批樣品對(duì)膠原-腎上腺素誘導(dǎo)的體內(nèi)血栓小鼠有顯著的保護(hù)作用，H-3、H-5批樣品也可增加小鼠偏癱恢復(fù)數(shù)，但與對(duì)照組比較差異沒(méi)有顯著性，保護(hù)率為24%和38%。

4 討論

膠原蛋白和腎上腺素均為血小板聚集誘導(dǎo)劑，合用有顯著的協(xié)同作用，二者小劑量混合，靜脈注射可誘發(fā)小鼠血栓性偏癱和死亡[4]；紅花注射液具有活血化瘀的功效，可抑制血小板聚集，拮抗由該模型誘導(dǎo)的小鼠血栓性偏癱和死亡。該模型動(dòng)物廉價(jià)易得、誘導(dǎo)劑使用劑量小、操作簡(jiǎn)單易行，整體試驗(yàn)條件和環(huán)境易于控制、具有較好的重復(fù)性,符合中藥生物活性測(cè)定的基本原則。在前期的藥物篩選試驗(yàn)中，紅花注射液對(duì)膠原-腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)血栓模型比較敏感，能夠表達(dá)出不同企業(yè)之間和同一企業(yè)不同批號(hào)之間的活性差異。因此進(jìn)一步探討作為紅花注射液生物活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

誘導(dǎo)劑劑量是試驗(yàn)系的影響因素之一：誘導(dǎo)劑劑量過(guò)大，小鼠死亡數(shù)多、偏癱難以恢復(fù)，無(wú)法體現(xiàn)藥物的保護(hù)作用；誘導(dǎo)劑劑量過(guò)小，則小鼠偏癱模型不明顯，難以判斷是藥物的保護(hù)作用還是動(dòng)物機(jī)體的自身抵抗，無(wú)法計(jì)算藥物對(duì)小鼠偏癱的保護(hù)率。試驗(yàn)過(guò)程發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源和批次的同品系小鼠對(duì)膠原-腎上腺素混合誘導(dǎo)劑的敏感性也有差異。為使誘導(dǎo)劑能引起大多數(shù)正常小鼠血栓性偏癱，且引起的血栓性偏癱程度在藥物的保護(hù)范圍，應(yīng)使對(duì)照組動(dòng)物偏癱恢復(fù)率控制在不大于20%的范圍內(nèi)。試驗(yàn)確定的膠原-腎上腺素混合誘導(dǎo)劑參考劑量范圍在膠原0.6 g·L-1-腎上腺素0.02 g·L-1～膠原0.54 g·L-1-腎上腺素0.018 g·L-1之間，以膠原0.6 g·L-1-腎上腺素0.02 g·L-1為宜。

紅花注射液對(duì)膠原-腎上腺素誘導(dǎo)的昆明種小鼠和BALB/C小鼠體內(nèi)血栓模型均有保護(hù)作用，其中昆明種小鼠為遠(yuǎn)交群，相對(duì)于近交系 BALB/C 小鼠出籠量大、抗病力強(qiáng)、環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)，在試驗(yàn)過(guò)程中能經(jīng)受多次給藥等操作刺激，且價(jià)格便宜，因此選擇昆明種小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。連續(xù)給藥3 d和5 d后紅花注射液對(duì)急性腦血栓小鼠均有顯著保護(hù)作用，考慮到經(jīng)濟(jì)、快捷，選擇3 d為試驗(yàn)給藥周期。

選用兩因素三水平正交設(shè)計(jì)表L9(32)，給藥劑量為主要因素，給藥后造模時(shí)間為次要因素，二者三水平之間差異顯著。相同給藥后造模時(shí)間對(duì)急性血栓小鼠的保護(hù)作用與劑量呈正相關(guān)。有研究報(bào)道紅花中色素類成分在抑制血小板聚集的同時(shí)對(duì)已聚集的血小板有非常明顯的解聚作用，且隨劑量的增加而逐漸增強(qiáng)[12]。

考察5家不同企業(yè)的5批紅花注射液生物活性，對(duì)膠原-腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)血栓保護(hù)率分別為52%、71%、24%、62%、38%，其中H-1、H-2、H-4批樣品對(duì)膠原-腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠偏癱恢復(fù)有顯著性差異(P<0.05或0.01)，顯示5個(gè)不同企業(yè)的紅花注射液生物質(zhì)量有差異，膠原-腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)血栓模型可對(duì)這種差異進(jìn)行區(qū)分。紅花注射液各企業(yè)間生產(chǎn)工藝存在不同，藥效物質(zhì)羥基紅花黃色素A對(duì)熱不穩(wěn)定,各企業(yè)半成品、成品的滅菌溫度與時(shí)間差別較大, 可能是造成樣品生物活性差別的原因之一。應(yīng)進(jìn)一步積累數(shù)據(jù)，為紅花注射液生物活性限值測(cè)定方法的建立提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，作為紅花注射液現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的有益補(bǔ)充，以期對(duì)紅花注射液的質(zhì)量屬性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。并經(jīng)系統(tǒng)對(duì)中藥生物活性限值測(cè)定法的開(kāi)發(fā)、建立和應(yīng)用，為中藥制劑質(zhì)量生物評(píng)價(jià)提供研究方法和思路。