劉景楠，趙 敏，吳平安，韓 宇，韓 濤

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學藥學院中藥學教研室，甘肅 蘭州 730000；2.華中科技大學 生命科學與技術學院，湖北 武漢 430074)

乳腺增生是一種臨床常見的乳腺良性病變，作為女性乳腺疾病的高發(fā)疾病，近年來發(fā)病齡逐漸年輕化，發(fā)病率逐年升高[1]。該病發(fā)展過程遵循“正常組織-單純性增生(輕、中、重度)-非典型性增生-原位癌-浸潤性癌”的規(guī)律[2]。且研究發(fā)現(xiàn)，乳腺增生癥與乳腺癌的發(fā)生具有相關性[3]。在乳腺癌發(fā)病每年近百萬患者的情形下[4]，對乳腺增生患者進行及時、有效的診斷與治療具有重要臨床意義。

西黃丸又名犀黃丸，出自清代名醫(yī)王洪緒所著《外科證治全生集·卷四》[5],作為現(xiàn)代臨床治療乳腺癌的常用藥之一。課題組前期基于下丘腦-垂體-卵巢軸對西黃丸進行了在體動物實驗研究，發(fā)現(xiàn)西黃丸具有抗乳腺增生作用[6]。通過對軸上FSH、LH等激素及GPR54、GnRHR等受體的調節(jié)作用來實現(xiàn)，但并未說明西黃丸對乳腺組織是否有直接干預作用。葉媚娜等[7]研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的原代正常人乳腺上皮細胞仍具有體內細胞的二倍體遺傳特性，在體外聯(lián)合應用雌二醇和孕酮可以促進其增殖。因此，本實驗通過聯(lián)合應用E2和P促進乳腺上皮細胞增殖，擬構建體內乳腺組織良性增生模型，于體外進行西黃丸抗乳腺增生研究，為西黃丸治療乳腺增生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞

1.1.1動物 SD大鼠，♀，未孕50只(SPF級)，體質量(200±20)g，購自甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK(甘)2015-0002。

1.1.2細胞 大鼠乳腺上皮細胞，購自賽佰康生物技術有限公司，并進行免疫熒光鑒定。將細胞接種于DMEM培養(yǎng)基上，于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.3藥品與試劑 西黃丸，批號：11020073，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，規(guī)格：每20丸重1 g；枸櫞酸他莫昔芬片，批號：31021545，揚子江藥業(yè)集團有限公司，規(guī)格：每片10 mg；黃體酮注射液，批號：131003，浙江仙琚制藥股份有限公司，規(guī)格1 mL含黃體酮20 mg;苯甲酸雌二醇注射液，批號：090801，上海通用藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：每1mL含雌二醇2 mg。 Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，購于BD公司，批號：556547；SP檢測試劑盒，購于索萊寶公司，批號：SP0041。

1.1.4儀器 CO2培養(yǎng)箱，Thermo公司，型號：311；電子顯微鏡，日立公司，型號：HT7700；IMS圖像分析系統(tǒng)，凝膠成像儀，Azure biosystems公司，型號：C300；電泳儀，北京六一生物科技有限公司，型號：DYCZ-24DN；Benchmark Plus酶標儀，美國伯騰儀器有限公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1動物分組及給藥 按隨機數(shù)字表法將大鼠分為5組，即空白組、對照組(他莫昔芬)、西黃丸高、中、低劑量組，每組10只?？瞻捉M灌胃等體積蒸餾水，對照組給予每日1.8 mg·kg-1他莫昔芬灌胃，西黃丸高、中、低劑量組分別給予每日2.16，1.08，0.54 g·kg-1西黃丸灌胃，連續(xù)7 d[8]。

1.2.2西黃丸含藥血清制備 末次灌胃后1h(灌胃前禁食12 h)，10%水合氯醛(0.3 mL/100g)腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，4 ℃離心，無菌分離血清，0.22 μm微孔濾膜濾過，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

《意見》提出了實行最嚴格水資源管理制度“五個堅持”的基本原則。一是堅持以人為本，著力解決人民群眾最關心最直接最現(xiàn)實的水資源問題，保障飲水安全、供水安全和生態(tài)安全。二是堅持人水和諧，尊重自然規(guī)律和經(jīng)濟社會發(fā)展規(guī)律，處理好水資源開發(fā)與保護關系，以水定需，量水而行，因水制宜。三是堅持統(tǒng)籌兼顧，協(xié)調好生活、生產和生態(tài)用水，協(xié)調好上下游、左右岸、干支流、地表水和地下水關系。四是堅持改革創(chuàng)新，完善水資源管理體制和機制，改進管理方式和方法。五是堅持因地制宜，實行分類指導，注重制度實施的可行性和有效性。

1.2.3細胞分組及給藥 大鼠乳腺上皮細胞的培養(yǎng)方法：取大鼠乳腺組織，物理剪碎法結合胰蛋白酶消化法處理組織，待消化后，加入混合培養(yǎng)液，培養(yǎng)液為89%DMEM培養(yǎng)基+1%青鏈霉素混合液+10%大鼠血清，前兩天每24 h換液一次，之后每隔1 d換液1次[7]。

將大鼠乳腺上皮細胞分為①空白組：乳腺上皮細胞+10%空白組血清；② 增殖組：乳腺上皮細胞+E2、P干預+10%空白組血清；③ 西黃丸高劑量組：乳腺上皮細胞+ E2、P干預+10%西黃丸高劑量組血清； ④ 西黃丸中劑量組：乳腺上皮細胞+ E2、P干預+10%西黃丸中劑量組血清；⑤ 西黃丸低劑量組：乳腺上皮細胞+ E2、P干預+10%西黃丸低劑量組血清；⑥ 他莫昔芬組：乳腺上皮細胞+ E2、P干預+10%對照組血清。

1.2.4免疫熒光鑒定原代培養(yǎng)的乳腺上皮細胞 細胞爬片，固定，封閉，一抗孵育，二抗孵育，滴加一滴Fluoromount-G熒光封片劑，包埋。

1.2.5CCK-8法檢測大鼠乳腺上皮細胞增殖最佳培養(yǎng)濃度 用無水乙醇將E2、P、E2+P配制成1 g·L-1的母液，之后用生長培養(yǎng)基分別稀釋成0.1、10-2、10-3、10-4、10-5g·L-15種濃度[6]。以無水乙醇與生長培養(yǎng)基作為空白組，以加入等量無水乙醇與生長培養(yǎng)基的大鼠乳腺上皮細胞為對照組，每組設5個復孔，采用CCK-8法檢測各濃度藥物培養(yǎng)液下各組乳腺上皮細胞增殖情況，得到其增殖最佳濃度藥物培養(yǎng)液為E2+P混合培養(yǎng)液(濃度為0.1 g·L-1)。

1.2.6CCK-8法檢測給予西黃丸后大鼠乳腺上皮細胞的存活率 采用CCK-8法檢測給予西黃丸后各組乳腺上皮細胞于第24 h、48 h、72 h的存活率。細胞存活率/%=(實驗組/增殖組-1)×100%

1.2.7Giemsa染色法進行西黃丸干預后大鼠乳腺上皮形態(tài)學觀察 取各組對數(shù)生長期的細胞，細胞爬片，滴加瑞式-吉姆薩染液2～3滴覆蓋整個標本，2 min后滴加等量pH 6.4的磷酸緩沖液，充分混勻，水洗、吸干、鏡檢。

1.2.8流式細胞儀檢測給予西黃丸后大鼠乳腺上皮凋亡率 收集大鼠乳腺上皮細胞，PBS洗滌，冰預冷的70%乙醇固定，將細胞重懸于200 μL binging buffer，400目篩網(wǎng)過濾離心，染色，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒嚴格操作，于流式細胞儀上進行檢測，使用CYEXPERT分析軟件進行結果分析。

1.2.9免疫組化法檢測給予西黃丸后大鼠乳腺上皮細胞凋亡因子表達 采用SP試劑盒進行檢測，細胞爬片固定后，PBS漂洗兩次，加入0.5%Triton X-100室溫孵育20 min，PBS漂洗兩次，加入3%H2O2處理15 min，PBS漂洗。吸去上清液，血清室溫封閉20 min，一抗、二抗孵育，DAB顯色，蒸餾水洗滌終止反應，蘇木素復染，封片，顯微鏡觀察[8]。

1.2.10蛋白免疫印跡技術測定蛋白表達 Western blot法測定乳腺上皮細胞雌二醇受體α(estradiol receptorα，ER-α)、雌二醇受體β(estradiol receptor β，ER-β)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)蛋白表達水平。待細胞密度生長至80%，提取細胞蛋白，繪制標準曲線進行蛋白定量。制膠，室溫下電泳，將蛋白分離并轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉進行膜的封閉，抗體孵育，ECL顯色，拍照，ImageJ軟件分析。

2 結果

2.1 原代培養(yǎng)正常大鼠乳腺上皮細胞的鑒定結果如下圖所示，均為陰性表達，經(jīng)免疫熒光鑒定，細胞為原代大鼠乳腺上皮細胞，純度達到90%以上。

Tab 1 Effect of estradiol and progesterone on inhibition of normal rat mammary epithelialcells in primary

*P<0.05vsmultiple comparisons

2.2 E2、P干預下原代培養(yǎng)正常大鼠乳腺上皮細胞最佳增殖濃度結果如Tab 1所示，原代培養(yǎng)的正常大鼠乳腺上皮細胞增殖實驗結果為E2+P混合培養(yǎng)液組(E2、P濃度為10-1g·L-1)時OD值最大，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 西黃丸對大鼠乳腺上皮細胞存活率影響結果如Tab 2所示，與增殖組比較，對照組，西黃丸高、中、低劑量組OD值均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。西黃丸高、中、低劑量組及他莫昔芬組均對E2、P誘導的大鼠乳腺上皮細胞有明顯抑制作用，且隨著時間延長，抑制率逐漸升高，西黃丸高劑量組于72 h抑制率達到最高。

Tab 2 Effect of Xihuang pills on proliferation of normal rat mammary epithelialcells in primary

**P<0.01vsproliferation

2.4 西黃丸干預下大鼠乳腺上皮細胞形態(tài)學觀察結果如Fig 2所示，活細胞為淡紫色，凋亡細胞為深藍色，結果可見空白組及增殖組多為淡紫色，可見淡紫色細胞核，而西黃丸高劑量組及對照組多為深藍色染色，且未能觀察到細胞核，即凋亡細胞。

2.5 西黃丸對大鼠乳腺上皮細胞凋亡率影響結果如Fig 3所示，經(jīng)PI染色后，乳腺上皮細胞細胞核為紅色，正常細胞分布于B3下左區(qū)，B2與B4區(qū)主要為凋亡細胞，由圖可以得出，西黃丸高、中、低劑量組及對照組均會促進E2、P干預的大鼠乳腺上皮細胞凋亡，且主要影響乳腺上皮細胞的晚期凋亡，以西黃丸高劑量組影響最明顯，凋亡率為43.79%。

2.6 西黃丸對大鼠乳腺上皮細胞凋亡因子表達的影響結果如Fig 4、5及Tab 4所示，正常生長的大鼠乳腺上皮細胞為藍紫色，凋亡細胞在光學顯微鏡下陽性表達為棕黃色，結合光密度值來看，F(xiàn)ig 4中西黃丸高、中劑量組陽性表達最為顯著(P<0.01)，即西黃丸可促進Bax的表達；Fig 5中西黃丸高、中劑量組及對照組多為藍紫色，即抑制Bcl-2的表達(P<0.01)。故西黃丸可通過改變Bax/ Bcl-2來促進大鼠乳腺上皮細胞凋亡。

Fig 2 Morphological observation of rat mammary epithelial cells treated with Xihuang pills(×200)Rat mammary epithelial cells stained with Giemsa:A:Blank group,B:Proliferation group,C:Control group,D:Experimental-H group, E:Experimental-M group, F:Experimental-L group,in which dark blue indicates apoptotic cells.

Tab 3 Effect of Xihuang pills onapoptotic rate of normal rat mammary epithelial cells in primary

**P<0.01vsproliferation

Fig 3 Effect of Xihuang pills on apoptotic rate of rat mammary epithelial cellsRepresentative images of flow cytometry, B1 quadrant:dead cell,B2 quadrant:late apoptotic cell,B3 quadrant: normal cell, B4 quadrant:early apoptotic cell.A:Blank group,B:Proliferation group,C:Control group,D:Experimental-H group, E:Experimental-M group, F:Experimental-L group.

Fig 4 Effect of Xihuang pills containing serumon Bax expression in proliferating mammary epithelial cells(×400)Expression of Bax protein under immunohistochemistry: A:Blank group,B:Proliferation group,C:Control group,D:Experimental-H group, E:Experimental-M group, F:Experimental-L group, in which the positive expression was brownish yellow.

Tab 4 Effect of Xihuang pills on Bax and Bcl-2 expression in primarily cultured rat mammary epithelial

2.7 西黃丸對大鼠乳腺上皮細胞ERα、ERβ、PR蛋白表達的影響結果如Fig 6所示，與空白組比較，增殖組灰度值差異具有顯著性(P<0.01)，說明E2、P可增加正常乳腺上皮細胞ERα、ERβ、PR表達；而增殖組與西黃丸高、中、低劑量組及對照組比較，差異均有顯著性(P<0.01)，說明西黃丸含藥血清各劑量組及他莫昔芬組均對ERα、ERβ、PR表達有抑制作用。以ERα、ERβ灰度值看，對照組的抑制作用優(yōu)于西黃丸高劑量組，即可有效抑制乳腺組織增生，以PR看，抑制作用亦高于西黃丸高劑量組，即不利于乳腺組織的復舊。

3 討論

細胞凋亡是指為維護內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主有序的死亡，對機體正常發(fā)育、維護內環(huán)境穩(wěn)態(tài)有重要的作用[9]。乳腺增生的發(fā)病、加重、甚至癌變的過程就是乳腺上皮細胞增殖過度及凋亡減弱的結果。而乳腺細胞凋亡和增殖過程是由生長因子和營養(yǎng)激素相互調節(jié)的。研究表明，乳腺增生的發(fā)病與E2/P直接相關，ER過度表達導致乳腺上皮細胞及間質纖維出現(xiàn)增生，使乳腺上皮細胞的修復能力減弱。PR的過度表達可誘導乳腺上皮細胞的形態(tài)發(fā)生改變，可激活特異性生長因子，使乳腺上皮細胞對P的應答出現(xiàn)異常，進而影響乳腺組織的復舊[10]。實驗結果表明，西黃丸可有效抑制ER、PR的表達，改變ER/PR，從而改變乳腺組織的增生與復舊。

Fig 5 Effect of Xihuang pills containing serum on Bcl-2 expressionin proliferating mammary epithelial cells(×400)Expression of Bcl-2 protein under immunohistochemistry: A:Blank group,B:Proliferation group,C:Control group,D:Experimental-H group, E:Experimental-M group, F:Experimental-L group, in which the positive expression was brownish yellow.

線粒體作為誘導細胞凋亡的核心。 Behera等[11]研究發(fā)現(xiàn)，孕激素能通過Fas L途徑激活誘導的細胞凋亡。Simpkins等[12]研究表明，雌激素對線粒體功能有顯著影響，并將雌激素受體ER定位于線粒體內。有研究認為，E2通過膜受體ER或線粒體受體ER在乳腺細胞中通過與線粒體呼吸復合物(MRC)的直接相互作用產生ROS導致蛋白激酶活化而改變線粒體，從而導致細胞凋亡[13]。本實驗對調節(jié)線粒體介導細胞凋亡的Bcl-2家族成員進行研究，發(fā)現(xiàn)西黃丸通過上調抗細胞凋亡蛋白Bax/促細胞凋亡蛋白Bcl-2的轉錄來促進乳腺細胞凋亡，其結果可能與E2直接調節(jié)Bcl-2家族有關。

Fig 6 Effect of Xihuang pills on expression of ER-α,ER-β and PR protein in rat mammary epithelial cellsGray value strip chart of ER-α,ER-β and PR by Western blot;Gray value histogram of ER-α,ER-β and PR.**P<0.01 vs proliferation

綜上所述，西黃丸能通過抑制ER、PR的表達,從線粒體途徑誘導乳腺上皮細胞凋亡，抑制其增殖，對乳腺增生有顯著的療效。而Bcl-2、Bax作為促凋亡因子，能誘導細胞色素C釋放和凋亡小體的形成。因而本課題組下一階段將針對線粒體、mtDNA、雌激素、ER在乳腺增生中的關系，從細胞色素C入手進行下一步實驗。