辛紅美,許 潔，汪長東

(重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，重慶 400016)

骨骼疾病致短期或者長期身體疼痛及殘疾，治療該疾病花費(fèi)接近全球國民生產(chǎn)總值3%[1]。成骨細(xì)胞整個分化過程包括間充質(zhì)干細(xì)胞、前成骨細(xì)胞、成熟的成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞。骨形成和骨吸收之間的平衡被打破，骨吸收的作用大于骨形成，會導(dǎo)致骨丟失和骨缺損疾病[2，3]。研究表明，MC3T3-E1成骨前體細(xì)胞具有活躍的生物性能，其增殖和分化對于骨丟失和骨缺損疾病的修復(fù)至關(guān)重要。

《中國藥典》記載，淫羊藿性辛、甘，有補(bǔ)腎陽，祛風(fēng)濕，強(qiáng)筋骨的功效。臨床主要用于治療筋骨疲軟，腰背疼痛，風(fēng)濕麻痹，麻木拘攣等，有最新研究報道[4]，其對小鼠AD模型具有改善作用。Xie等[5]研究表明，裝載有淫羊藿苷(icariin, ICA)的多孔復(fù)合支架可以通過成骨誘導(dǎo)和抑制破骨細(xì)胞活性促進(jìn)骨的重建。Gong等[6]在研究人工骨膜促進(jìn)骨再生的研究中發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可以促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞中堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性明顯增強(qiáng)，以及骨鈣素(osteocalcin, OC)和Ⅰ型膠原蛋白酶(collagen Ⅰ, Col Ⅰ)表達(dá)增加。此外，在負(fù)載淫羊藿苷的纖維基質(zhì)上培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞中鈣沉積明顯增多，證明淫羊藿苷可以促進(jìn)成骨。丁懷利等[7]研究表明，RNAKL/OPG比例的變化在骨質(zhì)疏松發(fā)病中起到重要作用，淫羊藿苷可以通過調(diào)節(jié)RANKL/OPG比例延緩了骨丟失隨年齡增長而加劇的趨勢，從而有效的防治骨質(zhì)疏松癥。因此，我們想探究淫羊藿苷對MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖和分化和作用機(jī)制，為中藥單體淫羊藿苷治療骨丟失疾病提供藥理基礎(chǔ)，以期更好的改善骨組織受損患者的生存質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 試劑和抗體試劑：淫羊藿苷中藥對照樣品購自成都德思特生物技術(shù)有限公司，HPLC級(≥98%)；Alpha-MEM 培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液購自HyClone公司；胎牛血清和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自重慶博培生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自Genview公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、Western blot凝膠試劑盒均購自碧云天公司?？贵w：β-actin抗體(Bioss,批號：bs-0061R);osteocalcin抗體(Bioss，批號：bs-4917R); ALP抗體(Bimake,批號：A5111)；Shh抗體(Bimake,批號：A5115)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和成骨誘導(dǎo)MC3T3-E1小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞在含有10%胎牛血清和抗生素(1×102U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)的α-MEM中生長，每3 d更換一次成骨培養(yǎng)基即10-8mol·L-1地塞米松，50 mg·L-1抗壞血酸和10 mmol·L-1β-甘油磷酸鹽的培養(yǎng)基，在37 ℃含有5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中生長。

1.3 茜素紅染色α-MEM(10-8mol·L-1地塞米松，50 mg·L-1抗壞血酸，10 mmol·L-1β-甘油磷酸)誘導(dǎo)成骨分化。細(xì)胞誘導(dǎo)14～21 d后，4%甲醛固定細(xì)胞。40 mmol·L-1茜素紅S(pH 4.4)室溫染色10 min。10 mmol·L-1磷酸鈉(pH 7.0)，10% cetylpyridinium chloride(sigma)處理細(xì)胞，562 nm測量吸光度值。

1.4 ALP活性檢測PBS洗滌MC3T3-E1細(xì)胞，超聲破碎。37 ℃孵育1 min，405 nm波長檢測吸光度值。堿性磷酸酶測定試劑盒購自中生北控生物科技有限公司，批號：160611。

1.5 CCK-8檢測MC3T3-E1細(xì)胞以5×104個/孔細(xì)胞接種到96孔板中，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。然后建立對照組和藥物組，細(xì)胞隨機(jī)分為6組：對照組，2.5、5、10、20和40 μmol·L-1，CCK-8測定。培養(yǎng)1、3和5 d后，加入10 μL CCK-8。37 ℃孵育3 h檢測490 nm吸光度。

1.6 Western blot檢測用裂解緩沖液(RIPA ∶PMSF=1 000 ∶1)裂解細(xì)胞，然后置冰上30 min。4 ℃， 12 000g離心10 min，取上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定。通過8%～10% SDS-PAGE凝膠分離等量的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用TBST(10 mmol·L-1Tris-HCL，150 mmol·L-1NaCl，0.05% Tween-20，pH 7.6)溶解5%脫脂奶粉封閉1.5 h。分別用PBST稀釋ALP、OC和Shh一抗(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜然后與HRP標(biāo)記對應(yīng)的二抗(1 ∶3 000)孵育。ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯色，使用ImageJ軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿苷促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖分別用2.5、5、10、20、40 μmol·L-1ICA處理MC3T3-E1細(xì)胞24、72、120 h，CCK-8檢測細(xì)胞增殖。結(jié)果顯示，2.5～40 μmol·L-1ICA處理組的吸光度值均較對照組高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明ICA促進(jìn)細(xì)胞增殖。

2.2 淫羊藿苷促進(jìn)成骨分化各組MC3T3-E1細(xì)胞分別用不同濃度的ICA處理后，成骨誘導(dǎo)3 d檢測ALP活性。結(jié)果顯示，20 μmol·L-1ICA處理組和40 μmol·L-1ICA處理組的ALP活性明顯高于對照組(Fig 2A)。但是10 μmol·L-1ICA處理組的ALP活性相比對照組，差異并沒有統(tǒng)計學(xué)意義?？赡苁且?yàn)榈蜐舛鹊腎CA處理并不能引起明顯的ALP活性改變，ICA促進(jìn)成骨是劑量依賴性的，在一定范圍內(nèi)高濃度ICA能引起成骨分化相關(guān)指標(biāo)的顯著改變。所以我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇40 μmol·L-1ICA作為最佳實(shí)驗(yàn)濃度。AR-S結(jié)果表明，20 μmol·L-1ICA處理組和40 μmol·L-1ICA處理組比對照組的橘紅色沉積(鈣結(jié)節(jié))明顯增多(P<0.01)，說明ICA促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞前體細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)的形成從而促進(jìn)成骨分化(Fig 2B)。與對照組相比，40 μmol·L-1ICA作為最佳實(shí)驗(yàn)藥物濃度處理3 d后發(fā)現(xiàn)OC和ALP蛋白表達(dá)也明顯增高(P<0.05)，提示ICA對成骨分化的標(biāo)志基因起促進(jìn)作用(Fig 2C,2D)。這些結(jié)果表明，ICA可以加速M(fèi)C3T3-E1細(xì)胞的成骨分化和礦化。同時，ALP和OC蛋白表達(dá)增加，表明ICA可以在早期和成熟階段促進(jìn)成骨分化。

Fig 1 Effects of icariin on proliferation in MC3T3-E1 cells detected by CCK-8 *P<0.05,**P<0.01 vs control

2.3 淫羊藿苷促進(jìn)成骨分化通過Hedgehog信號通路Hedgehog信號通路是參與成骨分化的關(guān)鍵通路。為了探究其是否參與調(diào)控淫羊藿苷促進(jìn)成骨分化的進(jìn)程，加入5 μmol·L-1Cyclopamine(CYC)，(Hedgehog通路的拮抗劑)。與40 μmol·L-1ICA處理組相比，ICA+CYC處理組ALP活性降低(P<0.01，F(xiàn)ig 3A)。在成骨誘導(dǎo)的d 21，進(jìn)行AR-S檢測鈣沉積物。與40 μmol·L-1ICA組相比，ICA+CYC處理組細(xì)胞鈣沉積物數(shù)量減少(P<0.01，F(xiàn)ig 3B)。這些結(jié)果表明CYC抑制ICA增強(qiáng)成骨分化。40 μmol·L-1ICA組中shh蛋白表達(dá)量增加，ICA+CYC組明顯降低(P<0.01，F(xiàn)ig 3C,D)。這些結(jié)果說明ICA促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化，這一過程至少部分由Hedgehog信號通路調(diào)節(jié)。與40 μmol·L-1ICA處理組相比，加入CYC能夠明顯的降低鈣結(jié)節(jié)(Fig 3E)。

3 討論

淫羊藿苷分子量：676.65，化學(xué)式：C33H40O15，是從淫羊藿中提取的植物雌激素和類黃酮化合物，被亞洲國家廣泛用于治療骨質(zhì)疏松癥。之前的研究表明它可以有效預(yù)防絕經(jīng)后期婦女的骨質(zhì)疏松癥[8-10]。MC3T3是C57BL/6乳鼠源性的成骨細(xì)胞，E1指的是它的亞屬，屬于前成骨細(xì)胞系，已成為整形外科和組織工程研究的熱點(diǎn)。此外一些研究發(fā)現(xiàn)，某些骨惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移也與成骨細(xì)胞密切相關(guān)[10]。成骨細(xì)胞增殖和分化對于骨重建過程中骨形成至關(guān)重要[11]。ALP是骨形成早期基因，在骨基質(zhì)礦化中起重要作用[12]。OC是一種可以與鈣結(jié)合并促進(jìn)礦物晶體形成從而開始礦化的糖蛋白，在骨形成過程中由成骨細(xì)胞分泌[13]。有研究表明10-7～10-5mol·L-1ICA干預(yù)在成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞的成骨分化作用[14]。本實(shí)驗(yàn)采用ICA處理MC3T3-E1細(xì)胞，與對照組相比，20 μmol·L-1ICA處理組和40 μmol·L-1ICA處理組的ALP活性明顯增加，表明ICA可以在骨形成的早期階段促進(jìn)成骨細(xì)胞的成熟。此研究結(jié)果表明，ICA可以明顯地促進(jìn)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1的增殖和成骨分化。

Fig 2 Icariin promotes osteoblast differentiation in MC3T3-E1 n=3)A:MC3T3-E1 cells were treated with Icariin(10, 20, or 40 μmol·L-1) or control, and further induced with osteogenic for 7 days, and then ALP activity in those cells was examined. B. MC3T3-E1 cells were treated with Icariin and further induced with osteogenic media for 21 days, and then those cells were subjected to Alizarin Red staining. Representative images were shown and quantitative mineralization levels were calculated. C. MC3T3-E1 cells were treated with 40 μmol·L-1 ICA or PBS as control, and further induced with osteogenic media for 3 days, and then cells were harvested for Western blot. D. Quantitation analysis of ALP and OC protein levels in Western blot(*P<0.05，**P<0.01 vs control group)

Hedgehog信號通路是參與動物胚胎發(fā)育最重要的信號通路之一，并且在出生后的組織修復(fù)、組織穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞增殖等多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。哺乳動物中的3個hedgehog基因，包括Sonic hedgehog(Shh)、Indian hedgehog(Ihh) 和Desert hedgehog(Dhh)。已經(jīng)證明，Ihh和Shh均可以通過Runx2加速間充質(zhì)祖細(xì)胞的成骨分化[16]。在我們的研究中，與40 μmol·L-1ICA處理組相比，ICA+CYC處理組中Hedgehog信號通路關(guān)鍵基因shh的蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)且ALP活性和礦化能力下降。

Fig 3 CYC inhibits osteoblast differentiation resulting from treating ICA in MC3T3-E1 A:The MC3T3-E1 cells were treated with control, or 40 μmol·L-1 alone or the combination of 40 μmol·L-1 ICA and 5 μmol·L-1 Hedgehog pathway antagonist CYC and further induced with osteogenic media for 7 days, and then ALP activity in those cells was examined;B:The scanned images of Alizarin Red staining and quantitative mineralization levels;C:The MC3T3-E1 cells were treated with control, 40 μmol·L-1 Icariin alone or combination of 40 μmol·L-1 Icariin and 5 μmol·L-1 CYC and further induced with osteogenic media for 3 days, and then those cells were harvested for Western blot;D:Quantitative analysis of shh protein level from Western blot;E:The images of microscopic calcium nodules by Alizarin Red staining in the MC3T3-E1 cells(100×).(#P<0.05 vs 40 μmol·L-1 ICA group)

ICA主要通過調(diào)節(jié)一些Hedgehog信號通路靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。此外CYC可以顯著抑制ALP活性和shh蛋白表達(dá)量。在形態(tài)學(xué)上，我們也觀察到CYC明顯抑制礦化結(jié)節(jié)數(shù)量。結(jié)果表明Hedgehog信號通路介導(dǎo)ICA促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化。

綜上，研究結(jié)果表明，ICA在成骨細(xì)胞的分化中起重要作用，主要通過Hedgehog信號通路發(fā)揮促進(jìn)成骨分化的作用，對成骨細(xì)胞分化和增殖促進(jìn)作用為骨質(zhì)疏松癥的治療提供了新的思路和方向。我們還需要完善動物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這一作用，并最終將其應(yīng)用于骨丟失和骨損傷疾病的臨床治療。