丁 萌，廖海秀，周楠楠，程 娟，王 琴，管世鶴，周 強(qiáng)，胡 偉，陳禮文

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 合肥 230601)

肺癌是十大惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人類生命健康，是全球癌癥相關(guān)死亡的最主要原因之一。在2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)中，肺癌的發(fā)病率和死亡率均居首位，分別占總病例的11.6%和癌癥死亡總數(shù)的18.4%[1]。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)的組織學(xué)分類定義了兩種類型的肺癌：非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)。NSCLC約占所有肺癌的80%～85%[2]，腺癌(adenocarcinoma，ADC，約40%～50%)和鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma，SCC，約20%～30%)是NSCLC的主要組織學(xué)亞型[3]。雖然NSCLC在診治方面取得了很大的進(jìn)展，但由于腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，NSCLC的總體生存率仍不理想[4]。

近15年來，隨著分子印跡技術(shù)、靶向治療藥物和精準(zhǔn)藥物的發(fā)展，NSCLC的治療發(fā)生了巨大的變化[5]。NSCLC中常見的突變多見于肺腺癌，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、EML4-ALK、c-met等受體酪氨酸激酶是已知的驅(qū)動(dòng)突變，這些突變通過激活下游信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。例如MEK/ERK/MAPK，PI3K/AKT/mTOR和JAK1/STAT3/5信號(hào)通路[6]。在NSCLC中，體細(xì)胞EGFR突變已被證明是生物標(biāo)志物和有吸引力的藥物靶點(diǎn)的強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)因子[7]。靶向突變EGFR治療已成功應(yīng)用于NSCLC患者的臨床治療，如EGFR小分子抑制劑Gefitinib、Erlotinib等，臨床證明能有效延長患者的生存期，但隨著治療時(shí)間的延長，大多數(shù)患者會(huì)產(chǎn)生耐藥性[8]。本研究主要建立對(duì)Gefitinib耐藥的肺癌細(xì)胞株，探討其Gefitinib耐藥的之后EGFR下游信號(hào)通路的改變，以及不同細(xì)胞株之間的差異。

1 材料與方法

1.1 材料NSCLC細(xì)胞系HCC827和H3255購自上海富衡細(xì)胞庫；RPMI 1640培養(yǎng)基(C11875500BT)購自美國Gibco公司；胎牛血清購于南美Lonsera 公司(S711-001S)；吉非替尼(Gefitinib)購自美國Med Chem Express(MCE)公司(HY-50895)；CCK-8購于中國貝博生物公司(BB4221-1)；兔抗人單克隆抗體β-actin(AF7018)、Akt(AF6261)、p-Akt(Ser473,AF0016)、p-STAT3(Tyr705,AF3293)均購于美國Affinity公司；兔抗人單克隆抗體p-ERK1/2(ab214362)、STAT3(ab76315)、CD276(ab227670)，鼠抗人單克隆抗體ERK1/2(ab54230)均購于英國Abcam公司；羊抗兔(ZB-2301)和羊抗鼠(ZB-2305)二抗均購于中國中杉金橋公司；磷酸化抑制劑Cocktail l購自美國Med Chem Express(MCE)公司(HY-K0021)；蛋白裂解液RIPA購于中國碧云天公司(P0013B)；蛋白酶抑制劑PMSF購于美國Sigma公司(10837091001)。

1.2 方法

1.2.1人NSCLC細(xì)胞H3255和HCC827的培養(yǎng)及構(gòu)建Gefitinib耐藥細(xì)胞株H3255/GR和HCC827/GR 人NSCLC細(xì)胞H3255、H3255/GR、HCC827和HCC827/GR用含胎牛血清(10%)、青霉素(100 KU·L-1)及鏈霉素(100 mg·L-1)的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱(HF90/HF240,Heal Force)中常規(guī)培養(yǎng)傳代。在人NSCLC Gefitinib敏感細(xì)胞株H3255的培養(yǎng)基中,按0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.075、 0.10 μmol·L-1濃度梯度逐步增加Gefitinib濃度,使用濃度為0.1 μmol·L-1的Gefitinib維持細(xì)胞耐藥性,以構(gòu)建Gefitinib誘導(dǎo)耐藥株H3255/GR，在人NSCLC Gefitinib敏感細(xì)胞株HCC827的培養(yǎng)基中,按0.001、0.002、0.005、0.01、0.012 5、0.015、0.017 5、0.02 μmol·L-1濃度梯度逐步增加Gefitinib濃度,使用濃度為0.02 μmol·L-1的Gefitinib維持細(xì)胞耐藥性,以構(gòu)建Gefitinib誘導(dǎo)耐藥株HCC827/GR。

1.2.2CCK8法檢測(cè)Gefitinib對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)及耐藥指數(shù)(RI) 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以1×106L-1的密度接種于96孔板,每孔100 μL,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。Gefitinib以0.02、 0.05、 0.075、 0.10、 0.15、0.20、0.25、0.30 μmol·L-1(H3255細(xì)胞)或0.001、0.002、0.004、0.006、0.008、0.01、0.012 5、0.025 μmol·L-1(HCC827細(xì)胞)濃度作用細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)72 h后,每孔加入含有10% CCK-8試劑的完全培養(yǎng)基100 μL，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱避光孵育2 h后，用酶標(biāo)儀(BioTek Inc.，VT，USA)在波長450 nm處檢測(cè)各孔吸光度值(OD)，根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞存活率(vital rate，VR)：VR=(用藥組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)。根據(jù)藥物VR，由藥物濃度的對(duì)數(shù)值與VR線性回歸求出藥物的半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)，并計(jì)算其耐藥指數(shù)RI(resistance index)：RI=IC50(耐藥細(xì)胞)/IC50(誘導(dǎo)前細(xì)胞)。最后取3個(gè)平行孔的平均值。

1.2.3Western blot檢測(cè)細(xì)胞系中p-Stat3、p-ERK1/2和p-Akt的表達(dá)水平 取2×106個(gè)對(duì)數(shù)生長期的H3255、H3255/GR、HCC827和HCC827/GR細(xì)胞種于6孔板中,待長到80%～90%加入Gefitinib(H3255和H3255/GR為0.05 μmol·L-1，HCC827和HCC827/GR為0.012 5 μmol·L-1)處理24 h后，預(yù)冷PBS洗兩遍，每孔加入100 μL預(yù)冷的RIPA裂解液(含1% PMSF和1% Cocktail l)冰上裂解30 min,4 ℃、13 000×g離心30 min后取蛋白上清,用BCA蛋白定量試劑盒按照說明書嚴(yán)格操作,測(cè)定各組細(xì)胞株蛋白樣品濃度。將蛋白樣品20 μg經(jīng)10% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到NC膜上,經(jīng)5%脫脂牛奶(TBST稀釋)室溫封閉1 h后,分別加入β-actin(1 ∶10 000)、Akt(1 ∶1 000)、p-Akt(Ser473 1 ∶1 000)、p-STAT3(Tyr705 1 ∶1 000)、p-ERK1/2(1 ∶1 000)、ERK1/2(1 ∶1 000)、STAT3(1 ∶20 000)，4 ℃ 緩慢勻速振蕩過夜, TBST洗滌3次后,分別加入羊抗鼠二抗(1 ∶10 000)、羊抗兔二抗(1 ∶10 000)室溫避光孵育1h, TBST洗滌3次后, ECL顯色(JS-1070P EV,Peiqing, Shanghai, China)。

2 結(jié)果

2.1 耐Gefitinib的肺腺癌細(xì)胞株的建立：H3255/GR和HCC827/GRH3255細(xì)胞和HCC827細(xì)胞連續(xù)6個(gè)月暴露在gefitinib濃度不斷增加的環(huán)境中，直到H3255細(xì)胞能夠在0.1 μmol·L-1Gefitinib中增殖，HCC827細(xì)胞能在0.02 μmol·L-1Gefitinib中增殖。采用CCK-8法檢測(cè)了HCC827/GR和H3255/GR細(xì)胞對(duì)Gefitinib的抗性。結(jié)果顯示，Gefitinib明顯降低了HCC827細(xì)胞和H3255細(xì)胞的存活率，而相對(duì)較高的Gefitinib濃度抑制了HCC827/GR細(xì)胞和H3255/GR細(xì)胞的存活率。CCK-8結(jié)果顯示，0.048±0.002 μmol·L-1，H3255/GR的IC50為0.448±0.171 μmol·L-1(RI=9.566±3.679)，HCC827的IC50為0.013±0.003 μmol·L-1，HCC827/GR的IC50為0.18±0.016 μmol·L-1(RI=13.822 2±1.041)。在H3255/GR和HCC827/GR中，Gefitinib的半抑制濃度(IC50)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 H3255/GR和HCC827/GR細(xì)胞的增殖較H3255和HCC827降低在此，我們進(jìn)一步研究表明，與非耐藥株相比，Gefitinib耐藥導(dǎo)致H3255和HCC827細(xì)胞的增殖顯著減少。在培養(yǎng)24、48和72 h 后，H3255/GR和HCC827/GR株的細(xì)胞增殖較敏感株明顯減少。

2.3 H3255/GR和HCC827/GR細(xì)胞株信號(hào)通路的改變我們檢測(cè)了Gefitinib處理的H3255和H3255/GR，HCC827 和HCC827/GR細(xì)胞中ERK1/2、AKT和STAT3的總水平和磷酸化水平。結(jié)果顯示H3255/GR和HCC827/GR的p-AKT、p-ERK1/2和p-Stat3與非耐藥株相比未觀察到明顯變化。在H3255細(xì)胞中，Gefitinib對(duì)p-AKT和p-STAT3有明顯的抑制作用，對(duì)p-STAT3、p-ERK1/2也有中度抑制作用，而對(duì)p-ERK1/2僅有輕度抑制作用。而在H3255/GR細(xì)胞中p-ERK1/2和p-Stat3表達(dá)水平亦無明顯改變，但p-AKT表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)果顯示，Gefitinib處理的HCC827細(xì)胞的p-ERK1/2，p-AKT和p-STAT3的表達(dá)明顯降低，p-STAT3和p-ERK1/2的表達(dá)也有一定程度的降低，其中p-AKT和p-STAT3幾乎失去表達(dá)。在HCC827/GR細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)Gefitinib處理后其p-AKT和p-STAT3表達(dá)幾乎不被抑制，p-ERK1/2被中度抑制，Gefitinib幾乎失去了對(duì)其信號(hào)的抑制作用。

Fig 1 Survival rate and IC50 of H3255, H3255/GR, HCC827 and HCC827/GR cells at different gefitinib concentrationsA. The survival rates of H3255 and H3255/GR cell lines were treated with 0～0.3 μ mol·L-1 Gefitinib for 72 hours. B. The survival rates of HCC827 and HCC827/GR cell lines were treated with 0～0.125 μ mol·L-1 Gefitinib for 72 hours. C. Calculation of semi-inhibitory concentration(IC50) of H3255 and H3255/GR cells by SPSS22. D. The semi-inhibitory concentrations(IC50) of HCC827 and HCC827/GR cells were calculated by SPSS22,*P<0.05,**P<0.01

Fig 2 Proliferation of H3255, H3255/GR,HCC827 and HCC827/GR n=3)A. The proliferation of H3255 and H3255/GR cells was observed at 0 h, 24 h, 48 h and 72 h. B. The proliferation of HCC827 and HCC827/GR cells was observed at 0 h, 24 h, 48 h and 72 h,*P<0.05,**P<0.01

3 討論

大多數(shù)攜帶EGFR突變激活基因的NSCLC病例，如外顯子19缺失(Del E746-A750)和外顯子21突變(L858R)，最初對(duì)EGFR TKI敏感。吉非替尼通過抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)信號(hào)通路的激活, 降低MAPK或者AKT的激活程度, 從而抑制上游轉(zhuǎn)錄基因的啟動(dòng)。有研究證實(shí)，吉非替尼能夠在抑制癌細(xì)胞快速跨越G0期方面發(fā)揮作用, 從而降低癌細(xì)胞的侵襲，轉(zhuǎn)移和浸潤能力[10]。然而，他們中的絕大多數(shù)最終獲得了對(duì)藥物的耐藥性[11]。目前, 非小細(xì)胞肺癌患者Gefitinib耐藥的機(jī)制主要分為EGFR發(fā)生二次突變(最常見的為T790M突變)[12]，STAT3信號(hào)通路的異常激活[13]和PI3K/Akt信號(hào)通路的持續(xù)活化等[14]。

在本研究中，我們利用逐步增加Gefitinib濃度法成功建立了Gefitinib耐藥株H3255/GR和HCC827/GR株。對(duì)親本細(xì)胞H3255、HCC827和耐藥細(xì)胞H3255/GR、HCC827/GR對(duì)Gefitinib敏感性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞的IC50明顯高于親本細(xì)胞，Gefitinib處理的在H3255/GR細(xì)胞中p-ERK1/2和p-Stat3表達(dá)水平亦無顯著改變，但p-AKT表達(dá)顯著下調(diào)，在HCC827/GR細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)Gefitinib處理后其p-AKT和p-STAT3表達(dá)幾乎不被抑制，p-ERK1/2被中度抑制。H3255/GR和HCC827/GR細(xì)胞Gefitinib耐藥的信號(hào)機(jī)制存在明顯差異。而H3255經(jīng)Gefitinib處理后p-ERK1/2的水平僅輕度下調(diào)，這表明在H3255細(xì)胞中，RAS/RAF/MEK/ERK1/2通路在EGFR下游信號(hào)通路中沒有發(fā)揮功能優(yōu)勢(shì)，先前的研究也表明，L858R突變降低了激活ERK1/2的能力，這是由于EGFR的內(nèi)吞作用受損和Src同源區(qū)2域含磷酸化酶-2(SHP-2)的Y542磷酸化減少所致[15]。另一方面，這些發(fā)現(xiàn)有力地說明了EGFR突變亞型Del E746-A750和L858R在EGFR下游信號(hào)通路的旁路激活上的差異。在耐吉非替尼的情況下，H3255/GR和HCC827/GR細(xì)胞中的JAK2/STAT3通路和HCC827/GR細(xì)胞中的PI3K/AKT通路均可被完全旁路激活。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了旁路激活信號(hào)的靶向抑制可能是治療EGFR-TKI耐藥的一個(gè)有前途的選擇?？紤]到信號(hào)網(wǎng)絡(luò)具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，未來的研究更需要針對(duì)旁路激活，并將受益于基于EGFR突變亞型的分層。

綜上所述，吉非替尼耐藥導(dǎo)致H3255和HCC827細(xì)胞的增殖減少。此外，證明了在H3255/GR和HCC827/GR細(xì)胞系中JAK2/STAT3級(jí)聯(lián)的旁路激活，以及在HCC827/GR株中PI3K/AKT通路的旁路激活。相比之下，H3255/GR細(xì)胞中的PI3K/AKT和HCC827/GR細(xì)胞中的Raf/MEK/ERK 1/2通路仍可被EGFR信號(hào)激活。

Fig 3 Expression of EGFR downstream signal protein in H3255, H3255/GR, HCC827 and HCC827/GR A～C. Detection of p-ERK1/2, p-AKT and p-STAT3 expression in H3255 and H3255/GR cells were treated with or without Gefitinib(0.05 μmol·L-1) by Western blot. D～F. The expression of p-ERK1/2, p-AKT and p-STAT3 in HCC827 and HCC827/GR cells with or without Gefitinib (0.012 5 μmol·L-1).G～H. The gray value of signal protein was analyzed for the difference between groups,*P<0.05,**P<0.01 vs H3255 or HCC827;##P<0.01 vs H3255/GR or HCC827/GR