蘭 蕊, 郭 楨，李珍珍，路 靜, 劉培慶

(中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

阿霉素(doxorubicin，DOX)，又名多柔比星，是一種廣譜的蒽環(huán)類抗生素。自1960年被臨床上廣泛用于抗腫瘤，特別是針對肺癌、乳腺癌、白血病、淋巴癌等效果顯著[1]。但DOX由于具有嚴(yán)重的心臟毒副作用，從而限制了其臨床應(yīng)用。目前DOX已經(jīng)被大量用于復(fù)制細(xì)胞及動物水平的心肌病模型，為心肌保護(hù)的新機(jī)制、新靶點研究及藥物的篩選奠定基礎(chǔ)。DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，主要呈現(xiàn)擴(kuò)張型心肌病的病理學(xué)特征：激活心肌細(xì)胞凋亡信號通路，線粒體功能紊亂，心功能下降等[2]?；钚匝?release of oxygen species，ROS)的產(chǎn)生被認(rèn)為是DOX心肌病的經(jīng)典機(jī)制，但抗氧化劑并沒有顯示出很好的抵抗DOX心肌病的效果[3]，提示該疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制可能更為復(fù)雜。

組蛋白去甲基化酶(histone demethylase Jumonji D3，JMJD3)，又稱為KDM6b(lysine-specific demethylase 6b)，主要分布于細(xì)胞核[4]。JMJD3可以將發(fā)生了甲基化修飾的甲基去除，進(jìn)而激活或者抑制相關(guān)基因的表達(dá)。目前有文獻(xiàn)報道[5]，JMJD3在腫瘤、炎癥、細(xì)胞增殖分化、神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用。此外，我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，JMJD3能夠通過調(diào)節(jié)β-MHC啟動子區(qū)域的H3K27me3程度來影響異丙腎上腺素誘導(dǎo)的病理性心肌肥大，且JMJD3在心臟中高表達(dá)[6]，這表明JMJD3與心臟疾病可能存在密切關(guān)系。但JMJD3與DOX誘導(dǎo)的擴(kuò)張型心肌病是否有關(guān)，尚未見報道。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)作為STAT家族重要一員，在心臟疾病中也發(fā)揮著重要的作用[7]。有臨床研究表明，在心臟中過表達(dá)STAT3能夠緩解DOX引起的心臟毒副作用[8]。STAT3蛋白在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核以及線粒體中廣泛分布，STAT3可以有效減少mPTP的開放，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[9]。線粒體靶向過表達(dá)STAT3能夠顯著減少ROS的生成和細(xì)胞色素C的釋放[10]。此外，STAT3在其他疾病中也發(fā)揮重要作用，比如，激活mTOR-STAT3信號通路能夠改善脂多糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮屏障功能障礙和細(xì)胞凋亡，有助于減少微血管損傷和肺損傷[11]。

關(guān)于JMJD3在DOX心肌病中的功能學(xué)研究及JMJD3是否通過調(diào)控STAT3磷酸化水平，進(jìn)而參與對DOX心肌病調(diào)控，目前尚未見報道?；诖耍疚奶骄苛薐MJD3對STAT3的調(diào)控作用及其在DOX心肌病中的機(jī)制，為心肌保護(hù)新靶點的尋找提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料阿霉素(DOX，純度>99 %，美國 Boston，T1020)；胰酶(美國 Sigma，25200-072)；BCA蛋白定量試劑盒(美國 Pierce，23225)；胎牛血清(美國Gibco，10270-106)；Bax抗體、JMJD3抗體(英國 Abcam，ab32503、ab169197)；STAT3抗體、p-STAT3(Ser727和Tyr705)抗體(美國CST，9139S、9134T和9145P)；Caspase-3抗體(美國 ProteinTech，19677-1-AP)；Bcl-2抗體(中國 Boster， A0040-1)；Cleaved Caspase-3抗體(美國 CST，9661T；以上抗體稀釋比是1 ∶1 000。α-Tubulin抗體 (美國 Sigma-Aldrich，T6199，稀釋比1 ∶2 000)；兔二抗、鼠二抗(美國 CST，7074S，7076S，稀釋比1 ∶2 000)；腺病毒JMJD3、STAT3和陰性對照GFP(吉凱基因，中國上海)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國 Thermo，K1622)；TRIzol(日本 TaKaRa，9109)。

1.2 儀器超凈工作臺(中國蘇凈安泰)；熒光定量PCR儀(美國Thermo)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo)；冷凍臺式高速離心機(jī)(德國Eppendorf)；恒溫水浴鍋(德國Memmert)；蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(美國Bio-Red)；倒置顯微鏡(德國Leica)；化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(中國Tanno)。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 心肌細(xì)胞系H9C2購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞充分貼壁生長至密度達(dá)70%～80%，棄培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗3次，加入含0.25% EDTA胰酶進(jìn)行消化，離心后加入新的含10%胎牛血清的DMEM重懸細(xì)胞，根據(jù)實驗需要將細(xì)胞接種于細(xì)胞皿中，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3.2RT-qPCR (1)RNA提取:將H9C2細(xì)胞或心肌組織用PBS清洗，加入1 mL TRIzol，細(xì)胞輕柔吹打，組織于冰上勻漿，收集液體至1.5 mL EP管中。加入200 μL氯仿，震蕩、靜置、離心。將上層轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入異丙醇，室溫放置后離心10 min，棄上清。加入1 mL 用DEPC水配置的75 %的乙醇，離心后棄上清，在室溫下干燥20 min。加入15-20 μL DEPC水，于58 ℃恒溫水浴10 min，隨后測定RNA 的濃度及純度。(2)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA:根據(jù)Thermo公司提供的RvertAid cDNA 試劑盒說明書構(gòu)建體系。第一步，將試劑Oligo(dT)18 primer、Total RNA、RNase Free dH2O按說明書劑量在冰上混勻，瞬離后放入PCR儀中65 ℃孵育5 min；第二步：按說明書劑量將5×Reaction Buffer、RiboLockTM RNase Inhibitor、dNTP Mix、RevertAidTM M-MuLV Revert混勻加入至上一步產(chǎn)物中，體系總體積為20 μL，瞬離后放入PCR儀中，設(shè)置反應(yīng)參數(shù)42 ℃×60 min，70 ℃×5 min，最后降溫至4 ℃。(3)PCR擴(kuò)增: 首先在Pubmed Primer BLAST 網(wǎng)站設(shè)計目的基因的引物序列，如下：JMJD3：正向5′- TCAGGAGAGGAAGGCCTCAG-3′，反向5′-AGCTGGGTATGGATGAGGGT-3′；β-actin：正向5′-TCGTGCGTGACATTAAAGAG-3′；反向5′-ATTGCCGATAGTGATGACCT-3′。本實驗的引物委托上海生工合成。根據(jù)Toyobo公司生產(chǎn)的SYBR Premix ExTaq說明書構(gòu)建反應(yīng)體系，實驗設(shè)計三個復(fù)孔以及空白對照，瞬離5 s后放入qPCR儀中，設(shè)置參數(shù)為：95 ℃×1 min；95 ℃×15 s；60 ℃×30 s 循環(huán)50次；95 ℃×15 s；60 ℃×1 h； 65 ℃×30 s，循環(huán)61次。內(nèi)參基因為β-actin，分析數(shù)據(jù)方法均采用2-ΔΔCt法。

1.3.3阿霉素心肌病動物模型的建立 SPF級Sprague-Dawley大鼠，♂，體質(zhì)量(260±20)g，購買于中山大學(xué)實驗動物中心，動物質(zhì)量合格證(No 44008500018368)。隨機(jī)分為2組，分別為生理鹽水對照組(NS)和阿霉素模型組(DOX)，每組6只。將鹽酸阿霉素粉末用生理鹽水配置成濃度為0.5 g·L-1的溶液，模型中SD大鼠于d 1、5、9給予腹腔注射阿霉素(1 mL·100 g-1)，每次劑量為5 mg·kg-1，最終累積劑量為15 mg·kg-1[2]。對照組SD大鼠給予腹腔注射等體積的生理鹽水。所有動物實驗流程均嚴(yán)格按照《Guide for the Care and Use of Laboratory Animals》執(zhí)行。

1.3.4SD大鼠心室壁注射JMJD3腺病毒 采用腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL·100 g-1)的方法待大鼠麻醉后，將其固定，將特質(zhì)的氣管插管經(jīng)口腔插入氣道中，連接呼吸機(jī)以輔助呼吸。剔除大鼠仰臥位左側(cè)胸腔處的鼠毛并用碘伏擦拭消毒。開胸腔：在大鼠左側(cè)第3～4根胸骨之間剪開一個約2～3 cm小口，暴露心臟。用胰島素針將200 μL JMJD3腺病毒(用無菌PBS緩沖液稀釋為5×109PFU)分散成3～5個位點注入左心室壁?？焖倏p合、消毒，觀察大鼠傷口愈合情況，待恢復(fù)1周后，可進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.5超聲心動檢測 用4%異氟烷經(jīng)小動物麻醉機(jī)將大鼠麻醉，剔除胸部皮毛，使其平躺于37 ℃恒溫板。用超聲心動儀檢測SD大鼠的各項心功能指標(biāo)。

1.3.6心臟組織取材 對SD大鼠給予腹腔注射0.45%戊巴比妥鈉(45 mg·kg-1)進(jìn)行麻醉。消毒后迅速打開胸腔，灌注0.1 mol·L-1KCl溶液使心臟在舒張期停搏，隨后灌注生理鹽水除去淤血，快速取出心臟，用濾紙吸去多余液體后進(jìn)行稱重、拍照。沿橫截面進(jìn)行分切，隨后凍存于液氮中用于后續(xù)Western blot等實驗。

1.3.7心肌細(xì)胞及心臟組織總蛋白提取 心肌細(xì)胞：棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS清洗，加入100 μL RIPA裂解液(含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑)，刮下細(xì)胞，冰上孵育30 min，在4 ℃，12 000 g 條件下離心20 min，取上清。BCA法測定蛋白濃度并制備樣品。

心臟組織：稱取約15 mg 組織于離心管中，剪碎，加入預(yù)冷PBS，棄上清后加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，于冰上勻漿。在4 ℃，12 000 g 條件下離心15 min，取上清。BCA法測定蛋白濃度并制備樣品以備后續(xù)檢測。

1.3.8蛋白免疫印跡法 制備12 %和8 % SDS-PAGE凝膠,上樣后設(shè)置電泳條件為80 V ×35 min，進(jìn)入分離膠后調(diào)整參數(shù)為120 V ×65 min，轉(zhuǎn)膜條件240 mA×100 min。5 %脫脂牛奶封閉2 h，4 ℃孵育一抗過夜，TBST清洗，室溫孵育二抗1 h，拍照、灰度值分析。

1.3.9細(xì)胞水平干預(yù)目的基因 過表達(dá)JMJD3及STAT3：采用JMJD3或STAT3腺病毒感染的方法處理H9C2細(xì)胞48 h，對照組加入含綠色熒光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)。腺病毒購買于上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

敲低JMJD3：將細(xì)胞接種于8 cm2培養(yǎng)皿中，用250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基分別與5 μL Lipo2000、10 μL濃度為20 μmol·L-1的JMJD3干擾序列輕柔混勻，靜置25 min后加入培養(yǎng)皿中，6 h后更換新的含10% DMEM的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。JMJD3干擾序列為：sense：5′-GCCUUCAUGCGAGUAACAUTT-3，antisense：5′-AUGUUACUCGCAUGAAGGCTT-3′。NC干擾序列為：sense：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，antisense：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′[6]。

2 結(jié)果

2.1 JMJD3在DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型的變化采用1 μmol·L-1DOX分別刺激H9C2細(xì)胞0、6、12、24 h，F(xiàn)ig 1A～B結(jié)果顯示，與正常對照組相比，當(dāng)DOX處理細(xì)胞12 h和24 h時，細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡：凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2、C-Caspase-3/T-Caspase-3比值升高(P<0.05)，明場下觀察到凋亡細(xì)胞數(shù)目增多。TMRE染色結(jié)果顯示，DOX處理細(xì)胞12 h和24 h時，細(xì)胞膜電位發(fā)生明顯下降(Fig 1C)。以上結(jié)果提示，1 μmol·L-1DOX刺激細(xì)胞12 h，可明顯誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷。在此模型下，JMJD3的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增高(Fig 1D～E)。

2.2 JMJD3在DOX誘導(dǎo)的大鼠心肌病模型的變化與生理鹽水對照組(normal saline, NS)相比，DOX組的大鼠心臟橫截面直徑變小(Fig 2A)，心動圖紊亂(Fig 2B)，心重脛骨長比降低，但心重/體重比值無明顯變化(Fig 2C)，左室射血分?jǐn)?shù)(ejection Fraction, EF)降低，心輸出量降低(cardiac output, CO)，左室短軸縮短率(fractional shortening, FS)降低(Fig 2D)，舒張期末左室后壁厚度(left ventricular end-diastolic posterior wall thickness, LVPW-d)降低(Fig 2E)。qRT-PCR結(jié)果顯示，與NS組相比，DOX模型組大鼠心臟組織中JMJD3的mRNA表達(dá)明顯升高(Fig 2F)。采用Western blot方法檢測JMJD3的蛋白表達(dá)：與NS組相比，DOX組大鼠心臟組織中JMJD3的蛋白表達(dá)明顯升高(Fig 2G)。

2.3 過表達(dá)JMJD3對心肌細(xì)胞凋亡的影響在H9C2細(xì)胞中加入JMJD3腺病毒感染48 h，由Fig 3可知，JMJD3過表達(dá)成功。與對照組相比，過表達(dá)JMJD3組的切割型Caspase-3(C- Caspase-3)表達(dá)水平升高，提示凋亡因子Caspase-3被激活，且過表達(dá)JMJD3可以加劇DOX引起的Caspase-3的激活。

2.4 敲低JMJD3對心肌細(xì)胞凋亡的影響在細(xì)胞水平敲低JMJD3后，與對照組相比，敲低JMJD3處理組C-caspase-3/T-caspase-3比值差異沒有顯著性。與DOX處理組相比，si-JMJD3+DOX處理能夠明顯抑制切割型caspase3的激活(Fig 4)。

2.5 JMJD3與STAT3對DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響如Fig 5A結(jié)果顯示：單獨過表達(dá)STAT3(Ad-STAT3)對心肌細(xì)胞凋亡無明顯影響；與DOX模型組相比，DOX合并Ad-STAT3組，可以減輕DOX引起的Bax/Bcl-2以及C-caspase-3/T-Caspase-3的升高；與Ad-JMJD3+DOX處理組相比，Ad-STAT3+Ad-JMJD3+DOX處理組中的Bax/Bcl-2以及C-Caspase-3/T-Caspase-3明顯下降。這些結(jié)果提示，JMJD3可能是通過抑制STAT3表達(dá)，從而加劇DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用。

Fig 1 Changes of JMJD3 expression in doxorubicin(DOX)-induced H9C2 cells were incubated with 1 μmol·L-1 DOX for the indicated durations. A:The ratios of Bax/Bcl-2 and C-Caspase-3/T-Caspase-3 were detected by Western blot. B:The cellular morphology of H9C2 was observed by light microscopy. Scale bar: 200 μm. C:The mitochondrial membrane depolarization was measured by TMRE staining. Scale bar: 100 μm.D: The mRNA expression of JMJD3 was detected by qRT-PCR.(E) The protein expression of JMJD3 was determined by Western blot.*P<0.05 vs control group.

Fig 2 JMJD3 expression increased in DOX-induced SD rats were submitted to the intraperitoneal injected with DOX(with a cumulative dose, 15 mg·kg-1). The control animals obtained an equal volume of normal saline(NS).A： The gross hearts were obscured by morphologic examination. Scale bar: 5 mm. B： Representative echocardiographic graphs. C： The ratios of HW/BW, HW/TL were detected. D～E：Parameters of Cardiac function of EF, CO, FS, LVPW-d were detected by echocardiographic. F： The mRNA expression of JMJD3 was detected by qRT-PCR. G： The protein expression of JMJD3 was determined by Western blot.*P<0.05 vs NS group.

Fig 3 JMJD3 overexpression aggravated DOX-induced H9C2 cells were incubated with 1 μmol·L-1 DOX for 12 h or infected with adenovirus encoding JMJD3(Ad-JMJD3) or GFP(Ad-GFP). The intracellular protein expression of JMJD3 and Caspase 3 were determined by Western blot.*P<0.05 vs Ad-GFP group,#P<0.05 vs Ad-GFP+DOX group

由Fig 5B可以看出，與對照組相比，DOX心肌病細(xì)胞模型中STAT3的蛋白表達(dá)及磷酸化水平降低；過表達(dá)JMJD3也可降低STAT3的蛋白表達(dá)及磷酸化水平；與Ad-GFP+DOX組相比，DOX合并過表達(dá)JMJD3對STAT3的蛋白表達(dá)及磷酸化水平的變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示二者并未出現(xiàn)疊加作用。

Fig 4 JMJD3 knockdown relieved H9C2 cells were incubated with 1 μmol·L-1 DOX for 12 h or transfected with siRNA targeting JMJD3(si-JMJD3) or NC.(A) The intracellular protein expression of JMJD3 and Caspase-3 were determined by Western blot.*P<0.05 vs NC group,#P<0.05 vs NC+DOX group.

3 討論

DOX心肌病的作用機(jī)制復(fù)雜，氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是主要機(jī)制[12]。心肌細(xì)胞在DOX刺激下，經(jīng)過各類氧化還原酶的作用，在線粒體、肌漿網(wǎng)、胞質(zhì)中形成半醌自由基，該自由基可與醌環(huán)之間形成循環(huán)，進(jìn)而傳遞電子給O2，并產(chǎn)生大量的ROS[13]。大量研究表明，DOX進(jìn)入細(xì)胞，能夠直接引起細(xì)胞壞死、凋亡及自噬。本實驗發(fā)現(xiàn)JMJD3在DOX心肌細(xì)胞毒性模型中呈現(xiàn)時間依賴性上調(diào)；且在整體動物模型中同樣表達(dá)升高，提示JMJD3可能參與了DOX心肌病發(fā)生發(fā)展過程。

JMJD3是含有JmjC結(jié)構(gòu)域的組蛋白去甲基化酶家族的重要成員之一，在腫瘤、炎癥、細(xì)胞增殖分化、神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用[5]。有研究證實，JMJD3通過水解組蛋白H3K27me3上的甲基進(jìn)而去除其對基因轉(zhuǎn)錄的抑制[14]。我們實驗室在前期研究證實，JMJD3通過調(diào)節(jié)β-MHC啟動子區(qū)域的H3K27me3程度，改變β-MHC表型向α-MHC轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥大[6]。在本實驗中，過表達(dá)JMJD3檢測凋亡相關(guān)蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)JMJD3單獨即引起心肌細(xì)胞凋亡，也可以加重DOX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

Fig 5 Effects of JMJD3 and STAT3 on DOX-induced H9C2 cells were incubated with 1 μmol·L-1 DOX for 12 h or infected with Ad-JMJD3,Ad-STAT3 or Ad-GFP. A:The ratios of Bax/Bcl-2 and C-Caspase-3/T-Caspase-3 were analyzed by Western blot.*P<0.05 vs Ad-GFP group;#P<0.05 vs Ad-GFP+DOX group; △P<0.05 vs Ad-JMJD3+DOX group. B:The protein expressions were detected by Western blot.*P<0.05 vs Ad-GFP group;#P<0.05 vs Ad-GFP+DOX group.

STAT家族在調(diào)節(jié)多種生物功能過程中發(fā)揮著重要作用，迄今發(fā)現(xiàn)該家族7個成員，分別是STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6，它們可被細(xì)胞因子、生長因子激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[7]。有文獻(xiàn)報道，STAT3可以保護(hù)DOX引起的心肌細(xì)胞凋亡和線粒體損傷[8]。我們發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)STAT3可以減輕Ad-JMJD3和DOX引起的心肌細(xì)胞凋亡，這提示STAT3可能參與了JMJD3對DOX心肌病的調(diào)控過程。

心血管疾病如心衰、心肌肥大、擴(kuò)張型心肌病等發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其發(fā)生發(fā)展與營養(yǎng)-環(huán)境及基因的改變密切相關(guān)。近年來，從表觀遺傳學(xué)角度研究眾多疾病機(jī)制成為研究熱點，表觀修飾對基因的選擇性轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控成為研究表觀遺傳學(xué)與疾病關(guān)系的重要內(nèi)容[6]。本研究中的JMJD3本身是重要的組蛋白去甲基化酶，STAT3作為轉(zhuǎn)錄因子與JMJD3之間存在調(diào)控關(guān)系，從表觀遺傳的角度出發(fā)，我們猜測可能是JMJD3通過其組蛋白修飾的作用抑制STAT3的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而引起心肌細(xì)胞損傷。本實驗通過過表達(dá)JMJD3發(fā)現(xiàn)其可以抑制STAT3的蛋白表達(dá)及其磷酸化水平。但是關(guān)于JMJD3與STAT3之間具體是如何調(diào)控的，是否與JMJD3對STAT3啟動子區(qū)域的H3K27me3水平的影響有關(guān)，這是我們今后的研究方向之一。