劉佳寧，馬銀鵬，張丕奇，馬慶芳

(黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010)

木耳(Auriculariaheimuer)[1]別名黑木耳、光木耳，其子實體膠質(zhì)，色澤黑褐，質(zhì)地柔軟，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，同時具有很高的藥用價值，是世界公認的高營養(yǎng)保健食品。我國木耳栽培規(guī)模逐年擴大，木耳產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為東北部分地區(qū)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，在農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值中占有較大比重[2]。

近年來，隨著國家脫貧攻堅戰(zhàn)略的實施，很多貧困地區(qū)將農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)出比較高的食用菌栽培項目作為脫貧的主要手段進行推廣。棚室栽培黑木耳由于其具有占地面積小、資金投入少、商品產(chǎn)出比高等特點，已成為食用菌栽培項目中的主要品種。黑龍江省勃利縣境內(nèi)的多個黑木耳栽培項目紛紛上馬，項目實施過程中，由于栽培經(jīng)驗不足，對栽培環(huán)境的控制不到位，會發(fā)生溫度過高、濕度過大和棚內(nèi)通風不良等現(xiàn)象，為黑木耳病害的聚集和發(fā)生創(chuàng)造了條件。從黑龍江省勃利地區(qū)采集病原菌樣品，根據(jù)科赫法則的基本步驟進行了一系列分離培養(yǎng)、病原菌回接和形態(tài)及分子生物學(xué)鑒定等試驗，確定了該病原菌的分類地位，為后續(xù)防治奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查與病原菌菌株獲取

采集具有典型病害特征的樣品進行分離培養(yǎng)獲取純病原菌菌株。該病害的典型特征為：在菌袋內(nèi)和黑木耳子實體上形成白色的絲狀覆蓋物，初期極其薄弱，當溫度和濕度增加后，白色的絲狀覆蓋物迅速增加，嚴重時可覆蓋整個黑木耳子實體表面，及時曬干黑木耳子實體，白色絲狀覆蓋物也不會消失，仍與黑木耳子實體緊密結(jié)合。當這種病害發(fā)生以后，黑木耳子實體的色澤變黃，耳片邊薄，產(chǎn)量下降較為明顯(如圖1所示)。

在黑龍江省勃利縣五處黑木耳種植場采集具有明顯病癥的標本6株，經(jīng)形態(tài)鑒定后均為未知病原菌(Unknown pathogen)。

1.2 實驗室復(fù)制病害典型特征

根據(jù)科赫式法則，將分離出的病原菌與黑木耳進行回接試驗(試驗所用木耳菌為 “黑威29”，由黑龍江省科學(xué)院微生物研究所提供)，定期觀察，記錄發(fā)病情況。經(jīng)過2周的培養(yǎng)后，黑木耳子實體上出現(xiàn)了與病原地所采集樣品同樣的發(fā)病特征。

1.3 培養(yǎng)基配方

第一，改良PDA培養(yǎng)基。配方為：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、水1 000 mL。

圖1 病原菌附著在黑木耳菌袋和子實體上Fig.1 Pathogens attach to bags and fruiting bodies of Auricularia heimuer

第二，MEA培養(yǎng)基(上海古朵生物科技生產(chǎn))。

1.4 形態(tài)鑒定

用接種針將病原菌挑入盛有改良PDA培養(yǎng)基平板中央，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)，獲得純菌落。間隔24 h測量菌落直徑，觀察外觀形態(tài)變化及顏色等直至菌落長滿平板為止，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。用接種針挑取適量培養(yǎng)基、菌絲及其產(chǎn)物，置于載玻片的無菌水中，蓋好蓋玻片后直接在顯微鏡下觀察照相并測量。

1.5 菌絲體培養(yǎng)及DNA提取

將菌種活化后接種于液體PD培養(yǎng)基中，25℃淺層靜置培養(yǎng)3～5 d，收集菌絲，濾紙吸干后-20℃保存。采用CTAB 法提取DNA，DNA 提取物于-20℃冰箱貯藏備用。

1.6 ITS序列比對與分析

對未知病原菌unknown pathogen進行ITS 序列的擴增。引物為ITS1-F：5′- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA -3′、ITS4-：5′- CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG -3′。引物由大連寶生物有限公司合成。PCR反應(yīng)在Gene Amp PCR System 9700 PCR儀上進行擴增，20 μL的反應(yīng)體系內(nèi)各種成分反應(yīng)體系見表1。擴增程序見表 2。測序由上海生物工程有限公司完成。

表1 ITS序列擴增反應(yīng)體系表Tab.1 ITS sequence amplification reaction system

表2 擴增程序設(shè)置表Tab.2 Settings for amplification procedure

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

2.1.1 菌落形態(tài)

在MEA培養(yǎng)基上的菌落在7 d內(nèi)達到73～75 mm。氣生菌絲白色，致密，棉質(zhì)，表面白色，反面白色。

在PDA培養(yǎng)基上的菌落擴散非?？?，在7 d內(nèi)達到82～84 mm。氣生菌絲白色，較為稀疏，絨毛狀，表面白色，3周后菌落表面呈現(xiàn)極淡紫色。

2.1.2 菌絲及孢子形態(tài)

在氣生菌絲體中產(chǎn)生的分生孢子，長度不定，分支分隔，每個芽枝都有一個分生孢子。分生孢子長見橢圓形到寬橢圓形，很少見亞球形，0-1分隔，10-18×7-10 μm。

該菌形態(tài)特征與已知真菌菌寄生(Hypomycesmycophilus)基本一致，初步確定該菌株為真菌菌寄生(Hypomycesmycophilus)。

2.2 序列分析

2.2.1 ITS擴增結(jié)果及分析

測序結(jié)果顯示，供試菌株ITS 序列為499 bp，如下：

菌株的ITS 序列已提交GenBank，接受號為HM573930。

2.2.2 ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析

用已經(jīng)獲得的未知病原菌ITS序列在GenBank中比對，與相似度最高的7個不同種建立進化樹，7種序列名稱及GenBank號見表3：

表3 相似度較高的7個種的ITS 序列名稱及號碼表Tab.3 ITS sequence name and number list of 7 species with high similarity

圖2 未知病原菌(unknown pathogen)與相似度 較高的7個品種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic trees of unknown pathogens and seven species with high similarity

由圖2可知，各分枝內(nèi)菌株間的最大遺傳距離較大。其中病原菌(unknown fungi)與已知種HypomycesmycophilusGenBank編號KU937111.1的序列遺傳距離差異為0.0000，經(jīng)比對后其相似度為99%，結(jié)合宏觀經(jīng)典分類學(xué)數(shù)據(jù)進一步確定該病原菌為真菌菌寄生(Hypomycesmycophilus)其生物學(xué)分類為：子囊菌門 (Ascomycota)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、肉座菌科(Hypocreaceae)、菌寄生菌屬(Hypomyces)、真菌菌寄生(Mycophilus)。

3 討論

根據(jù)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方法鑒定，將病原菌確定為真菌菌寄生(Hypomycesmycophilus)。該真菌在我國最早的記錄是2017年，由中國科學(xué)院曾昭清[2-3]等發(fā)現(xiàn)的我國新紀錄種。菌寄生屬主要以寄生的方式生在其他真菌的子實體上，這也符合黑木耳栽培中真菌菌寄生以黑木耳子實體為寄主的實際情況，利用黑木耳子實體及其栽培環(huán)境為自身生長提供條件。在棚室栽培黑木耳的中期，比較容易遇到高溫天，在高溫、高濕且栽培大棚通風較差的情況下，病原菌真菌菌寄生極易生長，造成病害的大規(guī)模發(fā)生。由于黑木耳本身的生長、生殖所需要的營養(yǎng)、溫度、濕度、pH、水分等基礎(chǔ)條件與真菌菌寄生所需條件有巨大的交集，因此對真菌菌寄生病害的防治造成較大困難，希望通過后續(xù)研究能夠找到應(yīng)對該病害的合理措施。