王馨琪，劉 卉，金光德，南桂仙

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

1 研究背景

蒙古柳[Salixlinearistipularis(syn.Salixmongolica)]又名筐柳，主要分布在中國內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林等地[1]，屬于落葉小喬木植物。蒙古柳有很強(qiáng)的抗旱耐鹽堿性能，根系發(fā)達(dá)，有很好的防風(fēng)固沙的作用[2,3]。研究表明，蒙古柳能生長在pH值9.2以上的鹽堿地，是鹽堿地土壤改良中起重要作用的野生植物資源[4]。蒙古柳的生長特性決定了體內(nèi)具有適應(yīng)逆境的機(jī)制，但是對蒙古柳的研究主要集中在形態(tài)結(jié)構(gòu)[5]、造林[6]、環(huán)境改良[7,8]、栽培[9]、防風(fēng)固沙[10]和有性繁殖等方面[11]，其基因信息和抗鹽性機(jī)理方面研究幾乎沒有報(bào)道。本研究對于非模式木本植物蒙古柳的抗逆性分子生物學(xué)的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

植物材料：從安達(dá)鹽堿地采集的蒙古柳種子。實(shí)驗(yàn)常用試劑：SMART試劑盒購自Clontech公司，DNAMarker、GoTaq酶購自TaKaRa公司，所用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

蒙古柳種子的無菌消毒和培養(yǎng)條件：蒙古柳種子用常規(guī)方法進(jìn)行表面消毒，種子播在1/2MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度控制在24℃±1℃，光照時間設(shè)置為9 h光照/15 h黑暗，幼苗長出3～4片真葉后取全株。

RNA的提取和質(zhì)量檢測：利用改良CTAB法提取蒙古柳幼苗總RNA[12]。用DNaseⅠ消化DNA。氯仿抽提一次。用無水乙醇和醋酸鈉(3 mol/L)溶液進(jìn)行沉淀，用75%酒精洗沉淀，晾干后加20 μL DEPC水溶解。測定RNA濃度和純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

蒙古柳cDNA-pYES2大腸桿菌文庫的構(gòu)建：以1 μg RNA 為模板，按照SMART技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫的操作方法合成SMART第一鏈cDNA，然后以其為模板利用聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行長鏈PCR擴(kuò)增，經(jīng)過15、18、21、24和27個循環(huán)后電泳檢測，找出合成雙鏈cDNA最優(yōu)循環(huán)次數(shù)，用SMART樹脂柱對雙鏈cDNA 分級純化。將純化后的雙鏈cDNA通過In-Fusion 反應(yīng)連接到質(zhì)粒載體PYES2上，將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109。

文庫質(zhì)量檢測：第一，測定文庫的滴度。取10 μL cDNA文庫添加到預(yù)熱過的1 mL LB培養(yǎng)基中，再從中取10 μL添加到1 mL LB培養(yǎng)基中，這樣文庫就稀釋104。從中取50 μL，涂在LB培養(yǎng)基，第二天計(jì)每個平板的菌落數(shù)目。計(jì)算文庫滴度(cfu·mL-1)=(菌落數(shù)×稀釋倍數(shù))/ 受體菌的體積。第二，重組質(zhì)粒的PCR鑒定。挑取轉(zhuǎn)化平板上的菌落，通過載體序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測。上游引物序列：CCGGATCGGACTACTAGCAGCTG；下游引物序列：TAGGGACCTAGACTTCAGGTTGTC。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 蒙古柳RNA的提取

得到蒙古柳總RNA的OD260/OD280測定值為1.98，進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，在紫外燈照射下能夠清楚地看到28 s rRNA和18 s rRNA，而且28 s rRNA的亮度大概為18 s rRNA的2倍，兩條帶之間無彌散現(xiàn)象，說明RNA完整沒有降解，提取的RNA質(zhì)量較好，可以用于cDNA文庫構(gòu)建，如圖1。

圖1 蒙古柳幼苗總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis mapping of total RNA in Salix linearistipularis seedlings

3.2 蒙古柳cDNA-pYES2大腸桿菌文庫的構(gòu)建

以1μg RNA為模板，合成SMART第一鏈cDNA，以該cDNA第一鏈作為模板通過長距離PCR擴(kuò)增，進(jìn)行15、18、21、24、27個循環(huán)，得到雙鏈cDNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2。

圖2 M：LD5000DNA Marker；1.2.3.4.5：通過15、18、21、24、27個 循環(huán)次數(shù)擴(kuò)增的雙鏈cDNA的PCR產(chǎn)物電泳檢測Fig.2 M：LD5000DNA Marker；1.2.3.4.5： PCR product electrophoresis of double-stranded cDNA amplified by 15, 18, 21, 24, 27 cycles

選擇21個循環(huán)次數(shù)為雙鏈cDNA的PCR最優(yōu)循環(huán)次數(shù)。合成的雙鏈cDNA片段長度大部分在0.5～2.0 kb范圍內(nèi)，表明合成的cDNA質(zhì)量較好。用試劑盒中SMART樹脂柱對雙鏈cDNA 進(jìn)行分級分離，分離產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小如圖3，將4～8號管中收集的cDNA分離產(chǎn)物用醋酸鈉沉淀后純化cDNA。

圖3 雙鏈cDNA分級分離Fig.3 Double-stranded cDNA hierarchical isolation

3.3 cDNA質(zhì)量鑒定

將蒙古柳cDNA文庫連pSMART載體電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，每個平板長出2 000多個單克隆。根據(jù)文庫滴度測定方法，每個培養(yǎng)基長出30個單克隆，測定培養(yǎng)基中原始文庫滴度為6×106cfu·mL-1。從培養(yǎng)基上長出的大腸桿菌中任意挑選16個單克隆進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示如圖4。

圖4 cDNA文庫插入片段的PCR檢測Fig.4 PCR detection of cDNA library insertion fragments

從圖4看出，大腸桿菌中插入的片段大部分在0.5～2.0 kb，平均長度為0.8 kb，重組率接近100%，基本上每個菌中都轉(zhuǎn)入了蒙古柳基因，得到了蒙古柳cDNA-pYES2大腸桿菌文庫。

4 討論

利用SMART技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫是產(chǎn)生高質(zhì)量cDNA可靠的方法。SMARTcDNA合成技術(shù)是基于PCR的方法構(gòu)建cDNA文庫，它被設(shè)計(jì)為優(yōu)先富集全長cDNAs。采用LD-PCR 技術(shù)擴(kuò)增雙鏈cDNA 的第二條鏈，僅具有SMART錨定序列的5′端的那些SS的cDNA可以作為模板被成倍擴(kuò)大，不完整的cDNA和基因的聚A-RNA的轉(zhuǎn)錄會缺乏SMART錨，不會被擴(kuò)大，因此污染的基因組DNA和聚A-RNA被消除。這種選擇性擴(kuò)大，可以構(gòu)建cDNA文庫具有高比例全長克隆。利用SMART樹脂柱對cDNA 進(jìn)行分級分離，可有效除去小片段的cDNA。

文庫滴度、重組率和插入片段的大小是鑒定cDNA文庫質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)中這些數(shù)據(jù)說明得到的cDNA能滿足構(gòu)建文庫要求。蒙古柳cDNA文庫的構(gòu)建為耐鹽基因的挖掘和揭示耐鹽分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。