林莉 孫波 王欣昱 趙衛(wèi)華 李建煥

近些年有研究證實(shí)胎兒在母體內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育受多種因素調(diào)控，包括遺傳、激素調(diào)節(jié)、神經(jīng)調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)、營(yíng)養(yǎng)及環(huán)境等多重因素，但其調(diào)控的具體機(jī)制目前尚不完全清楚[1]。近年來，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平的快速發(fā)展和物質(zhì)生活水平的提高，巨大兒的發(fā)生率也不斷上升，由于巨大兒是難產(chǎn)的常見原因，對(duì)母嬰均有不良影響，也已引起產(chǎn)科醫(yī)生越來越多的重視。胎盤作為妊娠期母體與胎兒物質(zhì)能量交換的中間站，在調(diào)節(jié)胎兒發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。Klotho 蛋白是胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的一種激素。有研究表明[2]，敲除 Klotho 基因的小鼠出現(xiàn)皮下脂肪減少、體重降低，提示Klotho 基因可能參與了小鼠體質(zhì)量調(diào)節(jié)的某些關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但是關(guān)于Klotho與新生兒出生體重的關(guān)系目前尚不明確。本文探討了Klotho在妊娠期糖尿病孕婦胎盤中的表達(dá)及其與新生兒出生體重的關(guān)系，希望為巨大兒的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

對(duì)象與方法

1. 研究對(duì)象：選取2014年12月—2017年4月本院產(chǎn)科的160例足月分娩孕婦為研究對(duì)象。年齡22～42歲，平均(27.8±8.5)歲，孕周37～40周，平均(38.8±11.3)周。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)自然受孕，單胎；(2)胎兒無染色體異常疾病高風(fēng)險(xiǎn)；(3)妊娠早期無先兆流產(chǎn)和感染等情況；(4)既往無高血壓和心臟病等內(nèi)、外科疾病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)隨訪資料不完整或失訪者；(2)懷孕前肝臟疾病導(dǎo)致的肝功能障礙，肺炎、肝炎、結(jié)核等急慢性炎癥性疾?。?3)免疫性疾病、高血壓、腎臟疾病、惡性腫瘤等疾??；(4)多胎妊娠、非初次妊娠者；(5)新生兒合并畸形；(6)輔助生殖技術(shù)受孕。

2. 相關(guān)定義及分組：(1)GDM。排除孕前患有糖尿病者，在孕24～28周期間行75 g口服葡萄糖耐量試驗(yàn)，空腹及服糖后1、2 h的血糖值標(biāo)準(zhǔn)分別為5.1、10.0和8.5 mmol/L，任何一點(diǎn)血糖值達(dá)到或超過上述標(biāo)準(zhǔn)即診斷為GDM[3]。(2)出生體重分類。出生體重小于2 500 g為低體重；出生體重在大于等于2 500 g，小于4 000 g為正常出生體重；出生體重大于等于4 000 g為巨大兒。(3)研究對(duì)象分組。根據(jù)新生兒出生體重為正常還是巨大兒，以及產(chǎn)婦是否診斷為GDM，將研究對(duì)象分為GDM巨大兒組、GDM正常體重組和正常巨大兒組以及正常非巨大兒組(正常對(duì)照組)，各40例。所有入選對(duì)象均簽字知情同意書，并取得醫(yī)院倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)。

3. 標(biāo)本采集：胎盤娩出后，無菌狀態(tài)下立即在胎盤母體面的中央取胎盤組織，大小約 1cm×1cm×1cm，去除鈣化或者機(jī)化組織，每例患者取6管組織，置于液氮中暫存，-80℃冰箱保存，待蛋白提取。同時(shí)，另取新鮮胎盤組織，經(jīng)10%甲醛固定，備用。

4. 免疫組化檢測(cè)胎盤組織中Klotho的表達(dá)：收集的標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，切片，SP法檢測(cè)各組胎盤組織中Klotho的表達(dá)水平。一抗為兔抗人Klotho單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作。陽(yáng)性表達(dá)的強(qiáng)度判定：Klotho蛋白陽(yáng)性染色存在于細(xì)胞質(zhì)中，呈現(xiàn)黃棕色顆粒狀。陽(yáng)性表達(dá)的強(qiáng)度判定：(1)隨機(jī)取10個(gè)高倍視野，計(jì)算1 000個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性染色細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性率，0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；(2)根據(jù)細(xì)胞染色程度標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，未著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別為0分，1分，2分和3分。將(1)和(2)分?jǐn)?shù)相乘的結(jié)果為綜合評(píng)分，0～1分定義為陰性(-)，2～5分定義為弱陽(yáng)性(+)，6～8分定義為中度陽(yáng)性(++)，9分定義為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

5. Western Blot檢測(cè)Klotho蛋白量表達(dá)：標(biāo)本中加2 m1 RIPA組織裂解液，勻漿，冰浴30 min，4 ℃ 1 000 r/min離心3分鐘，取上清，超聲5 s×4次破碎細(xì)胞核，4 ℃ 12 000 rpm離心5 min，吸取上清10 μL用于測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。配制分離膠、濃縮膠，上樣，電泳(電壓為120 V)，轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完畢后，切去膜多余的部分，切角標(biāo)記方向，加封閉液1 h后加入兔抗人Klotho單克隆抗體(1∶1 000)(美國(guó)Santa Cruz公司)、HRP標(biāo)記的第二抗體(1∶3 000)(美國(guó)Santa Cruz公司)進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。Bio-Rad成像儀曝光成像，Image Lab Software(Version 2.0.1，Bio-Rad)測(cè)定條帶光密度。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參蛋白。

結(jié)果

1. 新生兒及孕婦一般資料：160例新生兒，出生體重1 385～4 845 g，平均(3 286.4±451.1)g。男性78例，女性82例。胎齡37～40+6周，平均(38.7±5.6)周。孕婦的年齡、孕周、空腹血糖及分娩新生兒性別等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2. Klotho蛋白在各組胎盤組織中的表達(dá)：Klotho蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)，在正常胎盤組織中表達(dá)呈陰性，GDM巨大兒組中 Klotho蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于GDM 正常體重組、正常巨大兒組及正常非巨大兒組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；正常非巨大兒組、正常巨大兒組胎盤組織中 Klotho 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于GDM正常體重組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；正常巨大兒組中 Klotho蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常非巨大兒組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖1。

表1 各組孕婦一般資料及分娩新生兒性別比較

表2 Klotho蛋白在各組胎盤組織中陽(yáng)性表達(dá)率比較

注：與GDM巨大兒組比較，*P<0.05；與GDM正常體重組比較，#P<0.05

3.各組胎盤組織中 Klotho 蛋白表達(dá)水平的比較

GDM巨大兒組胎盤組織中Klotho蛋白的表達(dá)水平(2.3±0.1)高于GDM 正常體重組(0.6±0.1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；正常巨大兒組胎盤組織中 Klotho 蛋白的表達(dá)水平(1.6±0.1)高于正常非巨大兒組(1.3±0.1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；無妊娠期糖尿病組Klotho蛋白表達(dá)水平低于妊娠期糖尿病組中Klotho表達(dá)水平，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、圖3。

4. 胎盤組織中 Klotho 蛋白表達(dá)水平與新生兒出生體重相關(guān)性分析

納入全部研究對(duì)象數(shù)據(jù)進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，顯示孕婦胎盤組織中 Klotho 蛋白表達(dá)水平與新生兒出生體重正相關(guān)(r=0.2，P<0.001)。

圖1 Klotho蛋白在各組胎盤組織中的表達(dá)(SP染色，400×)AKlotho蛋白在GDM正常體重組胎盤組織陰性表達(dá)；B Klotho蛋白在GDM巨大兒組胎盤組織強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；C Klotho蛋白在正常非巨大兒組胎盤組織中度陽(yáng)性表達(dá)；D Klotho蛋白在正常巨大兒組胎盤組織弱陽(yáng)性表達(dá)。

圖2 各組胎盤組織中 Klotho 蛋白表達(dá)水平A：GDM巨大兒組；B：正常巨大兒組；C：正常非巨大兒組； D：GDM正常體重組

圖3 各組胎盤組織中 Klotho 蛋白表達(dá)水平

討論

近年來，隨著孕婦營(yíng)養(yǎng)水平的提高、中國(guó)二胎政策的放開，新生兒出生體重、巨大兒的發(fā)生率也隨著逐年增加。巨大兒對(duì)母體及新生兒健康都可以造成影響。分娩巨大兒的高危因素包括孕婦肥胖及糖尿病、過期妊娠、經(jīng)產(chǎn)婦、巨大兒分娩史、高齡產(chǎn)婦及種族、民族等[4]。因此，研究巨大兒的相關(guān)因素，進(jìn)一步了解巨大兒發(fā)生的相關(guān)機(jī)制，對(duì)降低圍產(chǎn)期母兒并發(fā)癥及改善預(yù)后具有重要意義。

Klotho 基因主要分布于腎臟、甲狀旁腺、脈絡(luò)叢及胎盤組織[5]。盡管Klotho蛋白分布較少，且在外周循環(huán)中水平低，但其在多種生物學(xué)功能中發(fā)揮作用，如能量代謝及鈣磷代謝等[6]。有研究表明[2]，敲除Klotho 基因的小鼠出現(xiàn)皮下脂肪減少、體重降低，提示Klotho 基因可能參與了小鼠體質(zhì)量調(diào)節(jié)的某些關(guān)鍵環(huán)節(jié)。大量研究表明[7-10]，Klotho 基因與糖尿病、高血壓、腫瘤密切相關(guān)，那么，Klotho 基因是否參與了胎盤對(duì)于新生兒出生體質(zhì)量的調(diào)節(jié)？胎盤中 Klotho 基因的表達(dá)水平與巨大兒的發(fā)生是否存在相關(guān)性？另外研究表明[11]，臍靜脈血中的 Klotho蛋白水平遠(yuǎn)高于母親及新生兒靜脈血中Klotho蛋白水平，因此推測(cè)胎盤中Klotho 蛋白可能通過分泌到臍血中參與了胎兒的物質(zhì)代謝，進(jìn)而影響新生兒出生體質(zhì)量。邵文佳等研究表明[12]，Klotho mRNA和蛋白在巨大兒胎盤組織中高表達(dá)，與新生兒出生體重密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，GDM巨大兒組胎盤組織中Klotho蛋白的表達(dá)水平高于GDM 正常體重組，正常巨大兒組胎盤組織中 Klotho 蛋白的表達(dá)水平高于正常非巨大兒組，相關(guān)性分析表明孕婦胎盤組織中 Klotho 蛋白表達(dá)水平與新生兒出生體重正相關(guān)，這些結(jié)果都提示Klotho與巨大兒的發(fā)生密切相關(guān)。Klotho基因調(diào)節(jié)新生兒出生體質(zhì)量的具體機(jī)制可能是：(1)胎盤組織中的Klotho蛋白進(jìn)入胎兒體內(nèi)，促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化，加速脂肪細(xì)胞的成熟，從而導(dǎo)致胎兒體重的增加，巨大兒的發(fā)生。(2)Klotho蛋白可以促進(jìn)胎兒垂體分泌更多的生長(zhǎng)激素，從而調(diào)節(jié)胎兒發(fā)育及新生兒出生體質(zhì)量。(3)Klotho蛋白能增加細(xì)胞膜上鈉鉀泵數(shù)量，增加細(xì)胞膜內(nèi)外的電位差，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，影響胎兒發(fā)育及新生兒出生體質(zhì)量。

目前，氧化應(yīng)激對(duì)巨大兒的影響的研究越來越多[13]。當(dāng)抗氧化物質(zhì)減少時(shí)就會(huì)導(dǎo)致氧化失衡，進(jìn)而引起胎盤血管損傷，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起母嬰各種不良結(jié)局。2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制是胰島素分泌不足和胰島素抵抗，同時(shí)伴有氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)[14]，Klotho 蛋白能阻止胰島素受體的酪氨酸磷酸化，干擾胰島素的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，引起胰島素抵抗。另外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[15]，敲除Klotho基因的小鼠血糖和胰島素水平明顯降低，胰島素抵抗增加。但另外臨床研究結(jié)果表明2型糖尿病患者血漿中Klotho蛋白水平與正常人群水平差別不大，提示Klotho基因與糖尿病關(guān)系不密切[16]。本研究結(jié)果表明，無妊娠期糖尿病組Klotho蛋白表達(dá)水平低于妊娠期糖尿病組中Klotho表達(dá)水平，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但本次研究樣本量小，未分析母體糖化血紅蛋白、糖化白蛋白、胰島素水平與胎盤組織中Klotho含量的關(guān)系，有待進(jìn)一步大樣本研究。

本次研究對(duì)象都是在同一家醫(yī)院納入，可能影響結(jié)果的代表性，今后需要進(jìn)行更大樣本量的前瞻性隊(duì)列研究。另外Klotho基因的生理機(jī)制和調(diào)節(jié)目前仍未闡明，胎盤組織Klotho基因能否作為預(yù)測(cè)疾病的嚴(yán)重程度與預(yù)測(cè)新生兒出生體重的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，GDM巨大兒患者胎盤組織中Klotho蛋白表達(dá)水平顯著增高，Klotho蛋白表達(dá)水平與GDM巨大兒的發(fā)生顯著相關(guān)。胎盤組織Klotho蛋白水平與新生兒的出生體重相關(guān)，Klotho蛋白還可能與巨大兒的發(fā)生相關(guān)。從分子水平了解到巨大胎兒的發(fā)生機(jī)制對(duì)于更早期預(yù)防由巨大胎兒發(fā)生可能造成的影響等問題有重要的意義和發(fā)展前景。