栗向輝 劉君萌 牟洪娜 李紅霞 王思明 唐月明 王玉 何青 陳文祥 董軍 楊睿悅

100730北京大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院(栗向輝、唐月明、王玉)；100730北京醫(yī)院 國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心，衛(wèi)健委老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(栗向輝、牟洪娜、李紅霞、王思明、唐月明、王玉、陳文祥、董軍、楊睿悅)，心內(nèi)科(劉君萌、何青)，衛(wèi)健委臨床檢驗(yàn)中心(陳文祥)

冠心病(coronary artery disease ，CAD)病因復(fù)雜，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，已經(jīng)成為全球許多國(guó)家的首要死亡原因。早期鑒別、診斷并且及時(shí)干預(yù)CAD的危險(xiǎn)因素是降低其發(fā)病率和死亡率的重要手段[1]。對(duì)CAD的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素如高血壓、血脂異常、糖尿病等的干預(yù)已取得明顯成效，但相當(dāng)一部分患者上述危險(xiǎn)因素已控制而CAD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)依然存在。因此，尋找和研究新的危險(xiǎn)因素對(duì)預(yù)防或延緩CAD發(fā)生與發(fā)展具有重要意義。

近期一些代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)血清甘氨酸(glycine，Gly)水平與傳統(tǒng)的心血管病危險(xiǎn)因素，如血壓、三酰甘油、血糖和體質(zhì)指數(shù)(body mass index， BMI)等都呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系[2-4]。除此之外，肥胖和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者血清的Gly水平明顯低于正常人群，并且改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)能夠增加血清Gly水平[5-7]。然而目前尚缺乏血清Gly水平與CAD之間的關(guān)系研究，因此本研究利用同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定行冠狀動(dòng)脈造影診斷為CAD患者及健康對(duì)照組人群血清的Gly濃度，分析血清Gly水平與CAD及其危險(xiǎn)因素的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

本研究為病例對(duì)照研究，選取2008—2011年間在北京醫(yī)院接受冠狀動(dòng)脈造影并確診為CAD的住院患者143例(102例男性和41例女性，30～84歲)。CAD的定義為冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果顯示左前降支、左回旋支、右冠狀動(dòng)脈以及主要分支中至少有一只血管狹窄程度≥50%[8]。具有以下特征的患者被排除在研究之外：在前2個(gè)月內(nèi)不穩(wěn)定性心絞痛和心肌梗死，或在前6個(gè)月接受降脂治療。從2011年8～10月在北京醫(yī)院參加體檢的表觀健康人中隨機(jī)選取健康對(duì)照組(286名)，與CAD患者按年齡(±3歲)和性別進(jìn)行2∶1比例匹配，具體信息參見(jiàn)以前發(fā)表的文章[9]。對(duì)照組排除心絞痛史、既往行冠狀動(dòng)脈造影史，心肌梗死或其他已知的心血管疾病史、腦血管病、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、慢性阻塞性肺疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病等，且肝腎功能正常、無(wú)應(yīng)激情況。使用標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)卷記錄入選者健康狀況、年齡、性別、吸煙和疾病史等信息。測(cè)量身高、體重和坐位血壓。采集清晨空腹靜脈血標(biāo)本，分離血清并儲(chǔ)存于-80℃冰箱。本研究經(jīng)北京醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。所有參與者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

血清Gly濃度采用本實(shí)驗(yàn)室前期建立的同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定[10]。分別取0.05 ml標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司)和血清樣品與0.05 ml同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)(穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)Gly-D5購(gòu)自美國(guó)Cambridge公司)溶液混合。加入含有0.1%甲酸的乙腈0.4 ml，振蕩離心，吸取上清液置入進(jìn)樣瓶中，室溫下氮?dú)獯蹈?，加?.2 ml 0.1%甲酸水溶液復(fù)溶，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)進(jìn)行分析。采用1200型高效液相色譜儀(美國(guó) Agilent公司)，色譜柱為Waters Shield C18柱(3.5 μm，2.1×150 mm)，流動(dòng)相為含0.01%甲酸的水-乙腈(90∶10)溶液，流速0.3 ml/min。質(zhì)譜儀為API 4000 Triple Quadruple質(zhì)譜儀(美國(guó)AB SCIEX公司)，采用正離子電噴霧離子化的多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，氣簾氣、霧化氣和碰撞氣分別為50、60和70 psi。噴霧電壓為5 500 V，去溶劑溫度700℃。Gly和內(nèi)標(biāo)的離子躍遷分別為m/z 76.0→30.0和78.0→32.0。以標(biāo)準(zhǔn)溶液Gly濃度為X軸，Gly和內(nèi)標(biāo)Gly-D5峰面積的比值為Y軸，進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析。

血清樣本的常規(guī)生化指標(biāo)，如空腹血糖(FBG)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等使用來(lái)自日本第一化學(xué)試劑的測(cè)定試劑盒，在Hitachi 7600全自動(dòng)生化學(xué)分析儀上檢測(cè)。計(jì)算血漿致動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(atherosclerosis index of plasma，AIP)，AIP=lg[TG/HDL-C]。血脂異常包括高TG血癥、高TC血癥、高LDL-C血癥以及低HDL-C血癥，分別定義為T(mén)G>1.70 mmol/L，TC>6.21 mmol/L，LDL-C>4.14 mmol/L以及HDL-C<1.04 mmol/L[11]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 人群的基本資料

429名參與者的血清Gly濃度呈偏態(tài)分布(峰度4.40，偏度1.52)，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)分布。由表1所示，根據(jù)Gly的三分位數(shù)分布，血清Gly水平較低者，年齡較大(P趨勢(shì)=0.001)，并且吸煙史、高血壓史、高TG和低HDL-C血癥的比例偏高(均為P趨勢(shì)<0.05)。隨著Gly水平的逐漸增加，CAD患者的比例顯著降低(P趨勢(shì)<0.001)。就代謝特征而言，隨著Gly水平的增加，BMI、SBP、AIP和TG的水平逐漸降低(均為P趨勢(shì)<0.01)；HDL-C的水平逐漸增加(P趨勢(shì)<0.001)。CAD患者的血清Gly水平[219.1 (195.6，262.0) μmol/L] 顯著低于對(duì)照組 [269.0 (240.0，308.6) μmol/L](P<0.05)。與對(duì)照組相比，CAD組患者具有更高的吸煙史、患T2DM、高TG血癥以及低HDL-C血癥的比例。CAD組和健康對(duì)照組的基線(xiàn)資料的對(duì)比詳見(jiàn)課題組之前發(fā)表過(guò)的文章[9]。

表1 人群的基線(xiàn)資料

注：CAD：冠心??；BMI：體質(zhì)指數(shù)；SBP：收縮壓；DBP：舒張壓；T2DM：2型糖尿?。籊ly：甘氨酸；TC：總膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；AIP：血漿致動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)；TG：三酰甘油；FBG：空腹血糖

2.2 血清Gly水平與傳統(tǒng)CAD危險(xiǎn)因素的偏相關(guān)分析

在校正年齡和性別后，血清Gly水平與CAD的一些傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素，如BMI、SBP、TG、AIP呈顯著負(fù)相關(guān)(均為P<0.05)；與HDL-C呈顯著正相關(guān)(P<0.001)。與DBP、TC、LDL-C以及FBG無(wú)明顯相關(guān)性(均為P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 血清Gly水平與CAD傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素的偏相關(guān)分析

注：BMI：體質(zhì)指數(shù)；SBP：收縮壓；DBP：舒張壓；TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；AIP：血漿致動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)；FBG：空腹血糖

2.3 血清Gly水平與CAD之間的logistic回歸分析

在模型1中，單因素logistic回歸結(jié)果顯示，血清Gly水平降低可能是CAD的危險(xiǎn)因素(OR=0.29，95%CI：0.19～0.40，P<0.001)。

多因素logistic回歸分析時(shí)，在校正年齡、性別、高血壓、T2DM、血脂異常等CAD的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素以后，血清Gly水平每增加1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，CAD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低68%(OR=0.32，95%CI：0.21～0.47，P<0.001)，見(jiàn)表3。

3 討論

據(jù)《中國(guó)心血管病報(bào)告2017》報(bào)道，我國(guó)心血管疾病患病率和死亡率仍處于持續(xù)上升階段，其中CAD患者數(shù)量高居前三[12]。代謝物作為細(xì)胞調(diào)節(jié)過(guò)程的終極產(chǎn)物，其水平可以反映體內(nèi)外環(huán)境改變對(duì)生物系統(tǒng)的影響。最近通過(guò)代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)一系列小分子代謝物與心血管代謝性疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，為臨床CAD危險(xiǎn)預(yù)測(cè)、診斷、預(yù)后和療效評(píng)估，以及進(jìn)一步闡明疾病發(fā)病機(jī)制提供了重要手段。

Gly是人和動(dòng)物體內(nèi)結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的非必需氨基酸，主要在肝臟和腎臟中合成，用于生成肌酸、嘌呤、葡萄糖和膠原蛋白等，參與抗炎抗氧化反應(yīng)以及免疫功能調(diào)節(jié)等生理過(guò)程[13]。近期代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，肥胖、T2DM和代謝綜合征患者血清Gly水平顯著降低[6-7， 10]。在活動(dòng)受限的超重老年人中，血清Gly水平與穩(wěn)態(tài)評(píng)估模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)顯著負(fù)相關(guān)；并且血清Gly與脂肪分布相關(guān)，與反映較好胰島素敏感性的大腿皮下脂肪量顯著正相關(guān)，而與反映較差胰島素敏感性的大腿肌間脂肪和腹部脂肪量顯著負(fù)相關(guān)[14]。前瞻性研究中也證實(shí)，血清Gly水平降低能夠預(yù)測(cè)T2DM、血脂異常和代謝綜合征的發(fā)生[15]。然而，目前國(guó)內(nèi)外研究多集中于血清Gly水平與心血管病危險(xiǎn)因素及糖尿病等代謝性疾病的關(guān)聯(lián)性研究，與CAD及心血管事件的關(guān)系尚缺乏研究。

本研究通過(guò)同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定CAD患者和健康對(duì)照組血清的Gly濃度，結(jié)果顯示CAD患者體內(nèi)血清Gly水平顯著低于健康人。多因素logistic回歸進(jìn)一步證實(shí)，血清Gly水平降低與CAD發(fā)生危險(xiǎn)增加獨(dú)立相關(guān)，此關(guān)系不受糖尿病、高血壓以及血脂紊亂等因素的影響。

表3 血清Gly水平與CAD的logistic回歸分析

注：a模型1：?jiǎn)我蛩豯ogistic回歸；b模型2：模型1基礎(chǔ)上調(diào)整年齡和性別；c模型3：模型2基礎(chǔ)上進(jìn)一步調(diào)整高血壓和糖尿??；d模型4：模型3基礎(chǔ)上進(jìn)一步調(diào)整高TG血脂、高TC血脂、高LDL-C血癥以及低HDL-C血癥

Gly作為潛在的代謝性疾病保護(hù)因素的機(jī)制可能與其抗氧化能力有關(guān)，Gly是機(jī)體內(nèi)源性抗氧化物谷胱甘肽(GSH)的重要組成成分，老年人膳食補(bǔ)充Gly可使GSH保持活力并且增強(qiáng)胰島素敏感性?？诜礼ly能夠有效降低T2DM患者體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)和炎癥損傷[16-17]。Gly還能夠直接或間接刺激腸道激素的分泌，進(jìn)而增強(qiáng)胰島素敏感性，促進(jìn)循環(huán)中葡萄糖的清除，抑制胰高血糖素生成內(nèi)源性葡萄糖[18]。Gly參與心血管病的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

由于血清Gly暴露水平測(cè)量與受試者招募同時(shí)進(jìn)行，因此無(wú)法確定關(guān)聯(lián)的時(shí)間順序，以及血清Gly水平變化與CAD的因果關(guān)系。這些結(jié)果還需要在未來(lái)的前瞻性研究中進(jìn)一步證實(shí)。此外，本研究未對(duì)入選的健康對(duì)照組進(jìn)行冠脈造影，以對(duì)確診冠心病患者予以排除，這樣可能造成偏倚，這也是本研究的局限性之一。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)血清Gly降低與CAD發(fā)生危險(xiǎn)增加獨(dú)立相關(guān)，有望在CAD的危險(xiǎn)評(píng)估中發(fā)揮作用。

利益沖突：無(wú)