王蕾蕾 高學(xué)敏 賈嵐 華姞安 孟靚 姚駿凱 付璐 王景霞

糖尿病并發(fā)腎臟功能損害是糖尿病患者致死、致殘的重要原因，預(yù)防糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的發(fā)生發(fā)展極為重要[1-2]?？刂蒲呛涂垢哐獕菏桥R床上有效的治療策略，但療效并不理想[3]，如在DN患者中使用血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑能顯著延緩DN進(jìn)程[4]，但存在不良反應(yīng)和用藥局限性，因此需探索更加安全、有效的藥物[5]。而氧化應(yīng)激是DN發(fā)展中最關(guān)鍵的因素，持續(xù)性高血糖導(dǎo)致的糖代謝紊亂使機(jī)體產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì)[6]，損傷腎臟系膜細(xì)胞，導(dǎo)致腎臟纖維化。中藥在DN患者臨床癥狀改善率，降低肌酐值、尿蛋白，改善腎功能等方面均具有較大的優(yōu)勢(shì)，日益受到重視[7-8]。

青錢柳是雙子葉植物綱胡桃科青錢柳屬植物，是中國特有珍稀樹種資源，與制作阿司匹林的柳樹、防治癌癥和腫瘤的紫杉醇并稱“醫(yī)學(xué)界三棵樹”[9]。民間常用其葉片做茶，其性味甘寒，有生津止渴的功效，具有良好的降糖效果[10]。課題組前期研究表明青錢柳能夠有效緩解肝臟氧化應(yīng)激狀態(tài)[11-12]。為探究青錢柳是否能降低血糖，緩解氧化應(yīng)激，對(duì)糖尿病早期腎損傷起到保護(hù)作用，本研究應(yīng)用高脂飼養(yǎng)結(jié)合腹腔注射鏈尿佐菌素復(fù)制2型糖尿病大鼠早期腎損傷模型，通過觀察青錢柳葉對(duì)2型糖尿病大鼠腎功主要指標(biāo)和早期腎損傷標(biāo)志物的影響，探討其對(duì)糖尿病早期腎損傷的保護(hù)作用，并從抗氧化應(yīng)激的角度初步探討青錢柳抗2型糖尿病大鼠早期腎損傷的作用機(jī)制，為青錢柳防治DN的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，雄性，SPF級(jí)，8周齡，體重180～200 g，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0002，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。普通飼料和高脂飼料(豬油10%、蔗糖15%、蛋黃粉15%、酪蛋白5%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%、碳酸氫鈣0.6%、石粉0.4%、鼠維持飼料52.6%)，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑

實(shí)驗(yàn)藥物：青錢柳葉水提物(無限極中國有限公司提供本科研用)。制備方法：5 kg原料，第一次加12倍水，煮沸保持微沸2 小時(shí)，過濾，濾渣再加10倍水，煮沸保持微沸1 小時(shí)，過濾合并2次濾液，濃縮干燥成干膏，粉碎過80目篩，干燥保存待用。

鏈尿佐菌素(美國SIGMA公司，批號(hào)：#WXBC2544V)，鹽酸二甲雙胍(中美上海制藥有限公司，0.5 g/片)。檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(索萊寶公司，批號(hào)：c1013)。肌酐(creatinine，CRE，批號(hào)：20190320)、尿素氮(urea nitrogen，UREA，批號(hào)：20190320)、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutral gelatinase lipoprotein，NGAL，批號(hào)：20190320)、腎損傷因子1(kidney damage factor 1，KIM-1，批號(hào)：20190320)、銅藍(lán)蛋白(ceruloplasmin，CP，批號(hào)：20190320)、丙二醛(malondialdehyde，MDA，批號(hào)：20190320)、活性氧(reactive oxygen species，ROS，批號(hào)：20190320)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX，批號(hào)：20190320)、過氧化氫酶(catalase，CAT，批號(hào)：20190320)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，批號(hào)：20190320)試劑盒均購自北京華英生物技術(shù)研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

752-邁瑞B(yǎng)S-420全自動(dòng)生化儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，華衛(wèi)德朗DR-200BS酶標(biāo)分析儀(無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司)，neofuge 15R型冷凍離心機(jī)(heal force公司)，穩(wěn)豪倍易型血糖儀和血糖試紙(強(qiáng)生上海醫(yī)療器械有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：3677941)。

1.4 動(dòng)物造模、分組及給藥

1.4.1 動(dòng)物造模與分組 雄性SD大鼠100只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，將大鼠隨機(jī)分為空白組10只和造模組90只。其中空白組給予普通飼料，造模組給予高脂飼料喂養(yǎng)8周。第10周，以30 mg/kg的劑量一次性腹腔注射2 % STZ溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配，取適量鏈尿佐菌素，在0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液冰浴中配置，pH=4.5)，并于 72 小時(shí)后禁食不禁水 8 小時(shí)，尾尖靜脈取血測(cè)空腹血糖，選擇空腹血糖(fasting bloodglucose，F(xiàn)BG) >11．1 mmol /L 的成模大鼠，造模期間，造模大鼠死亡 10 只，成模 70 只。剔除空腹血糖>30 mmol /L的成模大鼠，剩余 50 只成模大鼠納入實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為模型組，二甲雙胍組，CPE 低、中、高劑量組，每組 10 只。

1.4.2 給藥根據(jù) 1 mL /100 g 給藥體積計(jì)算，空白組和模型組灌胃0.9 %氯化鈉溶液，二甲雙胍組灌胃二甲雙胍混懸液(0.3 g/kg)，CPE低、中、高劑量組分別灌胃青錢柳葉水提物0.25、0.5、1 g/kg，連續(xù)給藥4周。給藥期間各組大鼠給予普通飼料，自由進(jìn)食、飲水。

1.5 空腹血糖及血清指標(biāo)檢測(cè)

開始給藥后，每周禁食不禁水8小時(shí)，尾靜脈采血測(cè)空腹血糖。給藥4周結(jié)束后，禁食不禁水8小時(shí)，使用10%的水合氯醛麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取全血，血液經(jīng)3000 r/min離心15分鐘取上層血清，采用酶聯(lián)免疫法測(cè)NGAL、KIM-1含量，采用比色法測(cè)CRE、UREA、CP、MDA、ROS、GSG-PX、CAT、SOD含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CPE對(duì)2型糖尿病大鼠一般體征及FBG的影響

空白組精神狀況良好，毛色有光澤，行動(dòng)自如，反應(yīng)靈敏；與空白組比較，模型組，毛色晦暗，行為狂躁，反應(yīng)異常；與模型組比較，二甲雙胍組及CPE低、中、高劑量組精神狀況有所改善，行為較正常。

與空白組比較，模型組空腹血糖顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，二甲雙胍組空腹血糖顯著降低(P<0.05)；CPE低、中、高劑量組空腹血糖顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 CPE對(duì)2型糖尿病大鼠FBG的影響

注：與空白組比較aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.2 CPE對(duì)2型糖尿病大鼠腎功的影響

與空白組比較，模型組肌酐有上升趨勢(shì)，尿素氮顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，二甲雙胍組肌酐、尿素氮顯著降低(P<0.05)；CPE低、中、高劑量組肌酐、尿素氮顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 CPE對(duì)2型糖尿病大鼠腎功的影響

注：與空白組比較aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.3 CPE對(duì)2型糖尿病大鼠腎損傷因子的影響

與空白組比較，模型組NGAL、KIM-1、CP顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，二甲雙胍組NGAL、KIM-1、CP顯著降低(P<0.05)；CPE低、中、高劑量組NGAL、KIM-1、CP顯著降低(P<0.05)。見表3。

2.4 CPE對(duì)2型糖尿病大鼠氧化應(yīng)激的影響

與空白組比較，模型組MDA、ROS顯著升高，(P<0.05)；模型組GSG-PX、CAT、SOD顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，二甲雙胍組MDA、ROS顯著降低(P<0.05)；CPE低、中劑量組MDA顯著降低；CPE低、高劑量組ROS顯著降低(P<0.05)；二甲雙胍組GSG-PX、SOD顯著升高，CAT有升高趨勢(shì)(P<0.05)；CPE低、高劑量組GSG-PX顯著升高；CPE高劑量組CAT顯著升高；CPE低、中、高劑量組SOD顯著升高(P<0.05)。見表4。

3 討論

常規(guī)尿蛋白、血尿素氮和肌酐是判斷腎臟損傷的傳統(tǒng)指標(biāo)[13]，但是由于早期糖尿病腎病并沒有明顯的臨床癥狀和體征，所以單憑癥狀和體征難以及早地發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病，當(dāng)血BUN、Cr升高，特別是出現(xiàn)大量蛋白尿時(shí)，腎損傷已經(jīng)相當(dāng)嚴(yán)重，不可逆轉(zhuǎn)[14]。糖尿病腎損害的早期，良性腎小球動(dòng)脈硬化尚未出現(xiàn)臨床癥狀，但腎臟儲(chǔ)備功能已經(jīng)下降，腎小球和腎小管的功能和結(jié)構(gòu)已發(fā)生改變[15]。研究發(fā)現(xiàn)，NGAL是 25 kDa 小分子量蛋白，屬于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族成員，可以由中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞(包括腎小管細(xì)胞) 釋放，當(dāng)腎小管功能損害時(shí)，NGAL 釋放入血液中，在正常白蛋白尿的極早期能夠被檢測(cè)到，可預(yù)測(cè)糖尿病腎損害[16]。KIM-1是跨膜蛋白，正常近端小管上皮細(xì)胞不表達(dá)，腎損傷后 KIM-1 會(huì)特異性升高，可作為腎臟近端小管損傷的生物標(biāo)記物，有利于腎損傷的早期診斷[13]。CP是由肝臟合成的唯一藍(lán)色蛋白質(zhì)，是一種多銅氧化物及抗氧化劑，可反映機(jī)體急性和慢性炎癥，與糖尿病腎病進(jìn)展相關(guān)[17]。因此，NGAL、KIM-1、CP是腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子[17-18]，可作為早期腎損傷的重要生物學(xué)靈敏標(biāo)志物。

本實(shí)驗(yàn)中，與空白組相比，模型組大鼠FBG顯著升高，UREA顯著升高，CRE沒有顯著差異但有明顯升高趨勢(shì)，同時(shí)模型組大鼠血清NGAL、KIM-1、CP的含量顯著升高，表明2型糖尿病大鼠模型已經(jīng)產(chǎn)生了早期的腎損傷。而其中CRE并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也說明了在腎損傷早期，傳統(tǒng)的腎功指標(biāo)并不靈敏，這就需要更靈敏的標(biāo)志物來預(yù)測(cè)腎損傷，從而加以預(yù)防，防止其進(jìn)一步惡化最終發(fā)展為糖尿病腎病，檢測(cè)NGAL、KIM-1、CP等細(xì)胞因子，對(duì)于及時(shí)發(fā)現(xiàn)并預(yù)防早期腎損傷具有重要意義。經(jīng)過給予CPE治療，CPE低、中、高劑量組都能顯著降低FBG、CRE、UREA、NGAL、KIM-1、CP含量，表明青錢柳可以有效降低血糖，改善腎功能，降低腎損傷標(biāo)志物NGAL、KIM-1、CP的含量，所以青錢柳對(duì)于2型糖尿病大鼠的早期腎損傷具有良好保護(hù)作用，能夠預(yù)防糖尿病腎病。

表3 CPE對(duì)2型糖尿病大鼠腎損傷因子的影響

注：與空白組比較aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表4 CPE對(duì)2型糖尿病大鼠氧化應(yīng)激的影響

注：與空白組比較aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2型糖尿病與機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激的程度及抗氧化防御體系功能紊亂有關(guān)[19]，持續(xù)性高血糖誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生超氧化物如MDA、ROS[20]，同時(shí)高血糖還可導(dǎo)致抗氧化酶的糖基化，令CAT、SOD、GSH-PX 等抗氧化酶活性降低，抗氧化系統(tǒng)清除能力減弱，這時(shí)機(jī)體內(nèi)大量的氧自由基會(huì)損傷周圍正常組織蛋白和腎組織，釋放NGAL、KIM-1、CP于血液中，并激活糖尿病腎病相關(guān)通路，進(jìn)一步損傷腎臟，使其纖維化，此時(shí)腎功能將完全喪失，發(fā)展為終末期腎病。本實(shí)驗(yàn)中，與空白組相比，模型組ROS、MDA顯著升高，CAT、SOD、GSH-PX顯著降低，說明2型糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)；與模型組相比，CPE低、中高劑量組不僅能顯著降低ROS、MDA，還能顯著升高CAT、SOD、GSH-PX。結(jié)果表明青錢柳可以緩解腎臟的氧化應(yīng)激損傷，可能通過此途徑發(fā)揮了早期的保護(hù)作用，從而阻礙了腎損傷的進(jìn)一步惡化，但其具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。